专利名称：：定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素b的胶体金免疫层析方法以及胶体金免疫检测试纸条的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物检测领域，具体涉及金黄色葡萄球菌毒素B的检测快速定量检测方法以及胶体金免疫检测试纸条。
背景技术：
：金黄色葡萄球菌(金葡菌)是引起感染和中毒性疾病的主要病原菌，其致病性主要与其产生多种致病物质有关，葡萄球菌肠毒素B(staphylococcalen2terotoxinB，SEB)是其中一种重要的致病物质，其小鼠LD值为0.023-5网/kg。金黄色葡萄球菌能引起食物中毒，主要原因为其能产生肠毒素(Enterotoxin，简称SE)从临床分离的金黄色葡萄球菌，约1/3产生肠毒素。金黄色葡萄球菌肠毒素主是由血浆凝固酶或耐热酸酶阳性菌株所产生的一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，迄今从血清型上已被鉴定的SE有IO种，A、B、C、D、E、G、H、I、J、K,其中C型抗原又根据等电点的不同分为3个亚型(Cl、C2、C3)，各型肠毒素均能引起食物中毒，其中以A型和D型引起的食物中毒最多，B型和C型次之。肠毒素可引起急性胃肠炎，人吃了被产毒菌抹污染了的牛奶、肉类、鱼虾、蛋类等食品就会引起食物中毒。肠毒素是一种可溶性蛋白质，耐热，经IO(TC煮沸30分钟不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响，故误食污染肠毒素的食物后，在肠道作用于内脂神经受体，传入中枢，刺激呕吐中枢，引起呕吐，并产生急性胃肠炎症状。发病急，病程短，恢复快。一般潜伏期为l-6小时，出现头暈、呕吐、腹泻，发病1~2日可自行恢复，预后良好。目前金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的检测方法主务农靠传统的分离养和生化鉴定，该方法费时费力(参见吴清平."单核细胞增生李斯特菌检测技术研究逸艮"，J.中国卫生检验杂志，2005，15(7):888-890;RobinLTChurchill，HungLee，etal."DetectionofListeriamono24cytogenesandthetoxin1isteriolysin0infooflJ.JournalofMi2crobiologicalMethods,2006，64:141-170.)。胶体金快速诊断试纸条技术是20世纪90年代以来发展起来的一项新型体外诊断技术(参见GrabarKC，FreemanRG，HommerMB,Wa/."PreparationandcharacterizationofAucolloidmon&layers，，J.AnalChem，1995，67:735~743.)。近年来该方法发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用，但用于食品卫生领域检测的产品较少。本研究针对金黄色葡萄球菌肠毒素B研制出了食品污染金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫胶体金检测试纸条。(李小兵，谢光洪，周昌芳，等."相思子毒素-a的纯化及鉴定，，.《中国兽医学报》，2008，28(3):310-313;李小兵，谢光洪，周昌芳等."相思子毒素-a单克隆抗体的制备与鉴定"。《中国兽医学报》，2008，28(7):836-839.)
发明内容本发明涉及胶体金免疫层析技术快速定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的方法及其产品。本发明的方法利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的快速检测方法。发明人评价其特异性和敏感性，并拟合检测曲线进行定量检测；在奶粉、牛奶、火腿肠等食品样品中添加金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)模拟污染样品，评价该方法对固体、半固体、液体等食品、可疑生物恐怖样品的检测能力。本发明的方法可在15min内完成定性和半定量检测，灵敏度为lng/ml，线性范围lOng/ml-5000ng/ml、回收率94%一112%。该法特异性、稳定性良好，可对样品直接进行检测。本发明提供一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的胶体金免疫层析方法，能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)，并可实现定量，适用于现场快速检测。一种检测金葡菌肠毒素B型的方法，其中包括将待测标本与样品稀释液混匀，再将样品混合液加入检测试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果；所述检测试纸包;J舌(1)反应支持物；(2)吸水垫；5(3)硝酸纤维膜，该膜包被有金葡菌肠毒素B型抗体和质控抗体的检测条带和质控条带；(4)金标抗体垫，其中含有胶体金标记的金葡菌肠毒素B型抗体；(5)样品垫；其中所述抗SEB的抗体可以是多克隆抗体，也可是单克隆抗体；多抗可选自兔抗SEB、鼠抗SEB;质控抗体可选自羊抗兔、鼠抗兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠的IgG。本发明方法中所述的检测试纸，其中吸水垫选用滤纸，反应支持物选用PVC板，金标抗体垫的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，样品垫的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。本发明方法中所述的试纸，其中吸水垫、金标抗体垫、反应支持物、硝酸纤维膜和样品垫按照附图1所示方式构成；反应支持物5位于底层，硝酸纤维膜2位于反应支持物5上的中部，该膜的T处是兔抗SEB多克隆抗体包被的检测条带，并且C处是羊抗兔IgG包被的质控条带；玻璃纤维膜3位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的兔抗SEB多克隆抗体；吸水垫1位于硝酸纤维膜2上部的相对于玻璃纤维膜3而言的另一侧并与2部分重叠。样品垫4位于2上与1相反的一侧并与3部分重叠。本发明方法中所述的试纸，其中吸水垫一侧为起始端，玻璃纤维膜一侧为末端，检测抗体的条带位于接近末端，质控条带接近于起始端。本发明所述的试纸，其中所述抗SEB的抗体可以是多抗，也可是单抗；多抗可是兔抗SEB、鼠抗SEB等；质控抗体根据金标抗体的免疫源可选择羊抗兔、鼠抗兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠等的IgG。本发明方法中所述的试纸，其中所述抗SEB多克隆抗体的浓度为3-8mg/ml。本发明方法中所述的试纸，其中质控抗体浓度为0.1-5mg/ml。本发明方法中所述的试纸，其中所述抗SEB抗体标记lml胶体金的量为5-20ug。本发明提供一种制备上述的金葡菌肠毒素B型的检测试纸的制备方法，该方法包4舌(1)用隔流喷金划线机以一定喷膜速度喷涂抗SEB抗体和质控抗体两个条带的硝酸纤维膜；(2)制备一种含有胶体金标记的抗SEB抗体的玻璃纤维膜，将胶体金标记的抗SEB抗体均匀涂布在玻璃纤维膜上，并烘干或冷冻干燥。本发明方法中所述的试纸在检测金葡菌肠毒素B型中的应用，其中包括将待测标本与样品稀释液混匀，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果。本发明所述的方法制备的检测金葡菌肠毒素B型的试纸。本发明采用的抗原及抗体例如是金黄色葡萄J求菌肠毒素B及其抗体，如SEB重组抗原，兔多抗，可购自军事医科院微生物流行病研究所，羊抗兔IgG(可购自鼎国生物技术公司)。注此处的抗体，如羊抗兔IgG是同羊抗鼠IgG—样，是普通的一种二抗；包被的抗原与抗体，只是针对本实验的抗原抗体材料及来源，实际应用中，SEB的抗原除了重组的也可用野生的。本发明方法采用层析测试条耗材，其中例如是结合垫(玻璃纤维)、硝酸纤维素膜(NC膜，SHF1350225)、样品垫及吸水垫、滤纸购自Minipore公司。根据才企测试纸，其中吸水垫选用滤纸，反应支持物选用PVC板，金标抗体保护膜的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，样品垫的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。本发明方法采用的实验仪器例如是金标免疫分析仪，可得自中国科学院上海光学精密机械研究所、中国检验检疫科学研究院联合研制。;图1表示金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)胶体金免疫层析试纸条的检测敏感性。图2为特异性4全测图示；其中，1:SEB2:SEA3:SEC4:SED5:SEE6:肉毒毒素7:蓖麻毒素8:相思子毒素9:BSA10:空白对照。图3为金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)胶体金免疫层析试纸条检测,系统拟合工作曲线，其中X:天然金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)浓度；Y:各浓度下金标分析仪读值T/C比值。图4为金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)胶体金免疫层析试纸条稳定性检测；其中1:金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)，2:1%BSA，3:SEA,4:空白对照。具体实施例方式实施例1:胶体金免疫层析试纸条的制备1、抗原及抗体金黄色葡萄球菌肠毒素B及其抗体(SEB重组抗原，兔多抗，军事医科院孩i生物流-f亍病研究所)、羊抗兔IgG(购自鼎国生物4支术>^司)2、层析测试条耗材结合垫(玻璃纤维)、硝酸纤维素膜(NC膜，SHF1350225)、样品垫及吸水垫、滤纸购自Minipore^^司03、实验仪器金标免疫分析仪(中国科学院上海光学精密机械研究所、中国检验检疫科学研究院联合研制)。4、胶体金免疫层析试纸条的制备4.1胶体金结合垫将pH值8.0~8.5、浓度5ug/ml的兔抗SEB抗体标记于柠檬酸钠法制备25nm的胶体金颗粒的胶体金颗粒，371:干燥〖5]。4.2硝酸纤维素膜才企测带兔抗SEB多克隆抗体2mg/ml+l%BSA;质控带羊抗兔lmg/ml，37。C干燥。4.3组装将样品垫、结合垫、吸水垫依次贴在带有IS^剂的底衬卡，切成0.4cm的条，干燥，装壳，室温贮存备用。实施例2:样品的定性和定量检测1、样品的处理用样品处理液(5mMPBSpH7.4)将动物血清、牛奶等粘稠液体样品进行l:20稀释，火腿肠等固体食品按1/100(W/V)加入样品处理液溶解，静止取上清，静止取上清。分别添加不同剂量的天然金黄色葡萄球8菌肠毒素B(SEB)作为模拟检测样品。2、定性检测将处理后的样品和样品处理液(作为阴性样品)100ul加到制备好的层析条样品垫端，静置15min,观察结果。检测带和质控带均出现红色判为阳性，仅质控带出现红色为阴性，检测带和质控带均不显色，则为试纸条失效。3、定量检测3.1、判定值的确定按1.6.1将阴性样品检测20次，用金标免疫分析仪扫描读取信号T/C比值。20个样品T/C比值的平均值(AVERAGE)与3倍标准差(STDEVA)之和为CUT-OFF值。3.2、定量检测判定将显色后的金标条》认金标免疫分析仪扫描，读取信号T/C比值，大于判定值为阳性。实施例3:灵敏度试验1、定量检测的灵敏度检测不同浓度天然金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)，经过计算判定值(CUT-0FF)为0.0243，浓度为lng/ml、5ng/ml的天然金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的平均T/C比值为的值均为0.00，低于0.043,为阴性；10ng/ml~10ug/ml的天然金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的平均T/C比值分别为的值均高于0.0243结果为阳性；当天然金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)浓度大于10ng/ml时，T/C比值平均值大于0.0243，故检测灵敏度为10ng/ml。表1金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)胶体金免疫层析试纸条各浓度检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>10ng/ml0.006V0.678V0.04+50ng/ml0.019V0.476V0.14+100ng/ml0.161V0.543V0.29+500ng/ml0.111V0.593V0.37+lug/ml0.462V0.625V0.545ug/ml0.326V0.391V0.73lOug/ml0.485V0.436V1.112、直观检测灵敏度评价按确定的最佳反应条件制备胶体金免疫层析试纸条，检测不同浓度的天然金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)。将天然金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)用样品处理液稀释成浓度依次为10ug/ml、lug/ml、100ng/ml、10ng/ml、lng/ml，同时进行检测。结果如图1所示，直接目测试纸条结果可以达到10ng/ml显色更加清晰。实施例4:标准曲线拟合实验以LOG10样品浓度为f黄坐标(10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)，以T/C值为纵坐标，拟合标准曲线(图3)。检测SEB各个浓度下，图二判定值(CUTOFF)为0.0243的T/C读值。可见小于10ng/ml为阴性，10ng/ml一5000ng/ml线性关系良好，拟合曲线见图3。线性方程为y=0.2576x-0.2536;R2=0.9675实施例5:特异性试验按确定的最佳反应条件制备胶体金免疫层析试纸条，以样品稀释液同样分别处理金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157:H7、肉毒毒素、鼠疫菌等、至浓度均为0.2mg/mL，以制备好的胶体金免疫层析试纸条检测，并与同样菌数的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)样品对照，同时检测空白对照。结果如图2所示。实施例6:回收率试验在线性检测范围内，检测已知浓度的天然金黄色葡萄球菌肠毒素B10(SEB),根据金标分析仪读值T/C比值和标准曲线计算出检测浓度，检测浓度与理论浓度的比值百分率为回收率。由表2可见，以LOG10样品浓度(10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)和T/C值才艮据拟合曲线方程(图3)来计算回收率，可见10ng/ml—1000ng/ml之间回收率在94%一112°/之间。表2金葡菌肠毒素B型(SEB)胶体金免疫层析试纸条检测系统回收率信号值T/CloglO浓度值检测值C(V)回收率0.141.70ng/ml1.52ng/ml111.8%0.292ng/ml2.11ng/ml94.8%0.372.70ng/ml2.42ng/ml111.6%0.543ng/ml3.08ng/ml97.4%0.733.70ng/ml3.82ng/ml96.9%实施例7:稳定性试验取在37。C放置的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)胶体金检测试纸条进行检测，第7天的检测结果可见金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)测试条的稳定性良好，在37。C放置7天后仍能特异性的检出金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)，而且敏感性也未下降。和新制备的检测试纸条相比，灵敏度没有明显下降，且特异性良好。结果参见附图4，图中1、10ng/mlSEB，2、1%BSA,3、SEA,4、空白对照;金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)胶体金检测试纸条37。C放置7天，进行检测，灵敏度可检测到10ng/ml，并且与金黄色葡萄球菌肠毒素的其他分型也没有交叉反应，稳定性良好。实施例8:检测样品的实验火腿肠50mg、奶粉50mg、牛奶250ji1，分别加入到1ml含金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的样品稀释液中，混匀，静置10min，再取l份培养后的菌液，用PBS10倍系列稀释进行检测。试纸条检测模拟污染样品试验的结果表明，该试纸条检测食品中模拟污染的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)仍然能检测到100ng/ml。结论即食食品很容易被金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)污染，其LD值为0.023-5ug/kg，这就要求及时对即食食品批量的快速定量检测。本研制适用于现场快速检测的双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条。该试纸条的标记物和被标记抗体通过静电引力和疏水作用结合，因而不会影响抗体活性。胶体金本身具有肉眼可见的颜色，无需仪器即可判读结果。无需洗涤，不形成免疫复合物的标记抗体通过层析作用自动分离，既筒化了操作步骤，又减少了影响实验结果的干扰因素。该法通常能在5-10min完成检测，样品处理方法简便、操作灵活、运输方便、不需要其他辅助仪器，结果可直观判断，而且试纸条自带质量控制线，实验结果一目了然，为现场检测提供最佳检测法尤其是对被金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)污染的即食食品的检测具有简便、快速、特异、敏感、稳定等特点，有利于对金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)引起食物中毒的及时诊断。因此，该试纸条具有广阔应用前景。本发明还将胶体金测试条与胶体金生物传感器有机整合为胶体金定量检测系统。运用胶体金免疫分析仪的优势在于，判读仪能够在人眼无法正确识别可疑物检测是否存在阳性的情况下，正确判读该试纸条检测结果。减少了因人为主观判读带来的错误率，增加了客观性、准确性；并且。并且经过整个检测系统的优化克服了检测血清、食品、饮料等样品时出现假阳性的现象可实现定量检测。此外，胶体金免疫分析仪携带方便、使用简单、判定准确、结果客观、易保留，为检验检验工作带来了方便。1权利要求1.一种检测金葡菌肠毒素B型的方法，其中包括将待测标本与样品稀释液混匀，再将样品混合液加入检测试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果；所述检测试纸包括(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有金葡菌肠毒素B型抗体和质控抗体的检测条带和质控条带；(4)金标抗体垫，其中含有胶体金标记的金葡菌肠毒素B型抗体；(5)样品垫；其中所述抗SEB的抗体可以是多克隆抗体，也可是单克隆抗体；多抗可选自兔抗SEB、鼠抗SEB；质控抗体可选自羊抗兔、鼠抗兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠的IgG。2.根据权利要求1或2所述的方法，其中，吸水垫选用滤纸，反应支持物选用PVC板，金标抗体垫的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，样品垫的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。3、根据权利要求3所述的方法，其中，所述试纸中的反应支持物(5)位于底层，硝酸纤维膜(2)位于反应支持物(5)上的中部，该膜的T处是兔抗SEB多克隆抗体包被的检测条带，并且C处是羊抗兔IgG包被的质控条带；金标抗体垫(3)位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠，该垫含有胶体金标记的兔抗SEB多克隆抗体；吸水垫(1)位于硝酸纤维膜(2)上部的相对于金标抗体垫(3)而言的另一侧并与硝酸纤维膜(2)部分重叠，样品垫(4)位于硝酸纤维膜(2)上与吸水垫(1)相反的一侧并与金标抗体垫(3)部分重叠。4、根据权利要求3所述的方法，其中，吸水垫一侧为起始端，样品垫一侧为末端，；险测抗体的条带位于接近末端，质控条带接近于起始端。5、根据权利要求3所述的方法，其中，SEB重组抗原，兔多抗。6、根据权利要求5所述的方法，其中，所述兔抗SEB多克隆抗体的浓度为3-8mg/ml。7、根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中，质控抗体浓度为0.1-5mg/ml。8、根据4又利要求1-7任一项的方法，其中，所述抗SEB抗体标记lml胶体金的量为5-20ug。9、一种权利要求1-8任一项所述方法中的所述金葡菌肠毒素B型的检测试纸的制备方法，该方法包4舌(1)用隔流喷金划线机以一定喷膜速度喷涂抗SEB抗体和质控抗体两个条带的硝酸纤维膜；(2)制备一种含有胶体金标记的抗SEB抗体的玻璃纤维膜，将胶体金标记的抗SEB抗体均匀涂布在玻璃纤维膜上，并烘干或冷冻干燥。10、由权利要求9所述的方法制备的检测金葡菌肠毒素B型的试纸。全文摘要本发明提供一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的胶体金免疫层析方法，能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)，并可实现定量，适用于现场快速检测。文档编号G01N33/577GK101666802SQ20091009004公开日2010年3月10日申请日期2009年7月29日优先权日2009年7月29日发明者姚李四,姜永强,孙肖红,张晓龙,宇杨,静王,胡孔新申请人:中国检验检疫科学研究院