专利名称：用于检测Hum j 3特异性IgE抗体的ELISA试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以小鼠杂交瘤单抗和天然潷草花粉纯化主要致敏蛋白Hum j3为 基础的用于检测潷草花粉过敏患者血中Hum j3specific-sIgE(Hum j3特异性IgE)水平的 ELISA试剂盒，为将来Hum j3过敏的分子免疫治疗提供了全新的、易于标准化的途径。
背景技术：
蔷薇亚纲大麻科一年生缠绕草本植物潷草(Humy Ius japonicus或Humy Ius scandens)，原产我国，广泛分布于远东地区，是一种重要的夏秋季花粉致敏原。我国除新 疆、青海以外的各省区均有分布，东亚各国(朝鲜、日本、俄罗斯、越南)以及欧洲、美国西海 岸地区亦有分布。上世纪八十年代由北京协和医院牵头的第一次全国性气传致敏花粉调查 中，在79个花粉收集点中有53个点可收集到潷草花粉，仅次于蒿属花粉，其分布范围基本 上覆盖全国，播散高峰为八、九月[1]。北京协和医院首次发现潷草花粉是我国夏秋季节仅次 于蒿属花粉的重要致敏原，是导致临床上出现变应性鼻炎、过敏性结膜炎、花粉性皮炎、季 节性哮喘等花粉症症状的重要病因，很大程度上影响了患者的生活质量[2]。现阶段对于花粉症的诊断和治疗，依赖于特异性变应原疫苗(Specific Allergenic Vaccines)，而变应原特异的免疫治疗(Allergen -Specific Immunotherapy, SIT)是目前成熟的针对花粉症病因治疗的方法。变应原疫苗是指包括变应原提取物以及 其它成分的生物制剂，可有效用于人类过敏性疾病的诊断、预防和治疗[3]。变应原特异的免 疫治疗(Allergen-Specific Immunotherapy, SIT)通过调节抗原提呈细胞、B淋巴细胞和 T淋巴细胞的免疫应答以及调节介导变态反应效应细胞的功能和数量，从而减轻患者症状 M。WHO发布指导文件[5]指出，SIT是唯一能影响过敏性疾病自然病程、有效阻止变应性鼻 炎进展为哮喘的治疗方法。尽管SIT是目前成熟的针对花粉症病因治疗的方法，但现阶段以变应原浸液为基 础的变应性疾病免疫诊断和治疗模式并非是最理想的模式，而基于变应原组分(allergen component-resolved diagnosis andtreatment)的诊断和治疗模式的尝试,则代表了一种 新的方向[6’7]。因为即使是对于同一种花粉过敏，不同患者的血清致敏蛋白反应谱也不一 样，例如同为潷草过敏患者，由于潷草花粉变应原种类很多，其不同个体血清中可能含有针 对潷草花粉变应原浸液中不同致敏成分反应的特异性IgE(SlgE)。因此，以花粉浸液作为 皮试和体外IgE检测试剂，仅能得出对该花粉过敏的信息，但无法确认对何种致敏蛋白过 敏。最近，由于分子生物学的进展，大量的变应原被纯化、鉴定和重组表达，基于变应原组分 (allergen component-resolved diagnosis andtreatment)的诊断禾口治疗模式的尝试，更 为科学的反应了过敏患者的体内致敏蛋白血清slgE反应谱，所以诊断更为特异，相应也就 能达到个体化免疫治疗的目的。同时由于排除了对个体患者无意义的致敏蛋白和非致敏蛋 白，也使得该个体化免疫治疗更为安全，使变应原特异的免疫治疗在医疗实践中能达到WHO 关于医疗保健的质量定义，即“高度的专业诊断标准”、“有效的利用资源”、“患者承担风险 最低”、“患者高度满意”、“以及患者治疗的连续性”[8_16]。
最近，有较多基于变应原组分的诊断和治疗的文章发表[8_15]。如以重组的胡萝卜变应原来体外诊断过敏患者究竟对于何种胡萝 卜变应原过敏。作者发现，该诊断模式有较好的敏感性与特异性，能作为一种标准的诊断模 式。而G. Pittnerm以纯化的天然和重组螨变应原来对屋尘螨过敏患者进行体外诊断研究 也发现，大于95%的尘螨过敏患者能由nDer pi和rDer p2联合诊断，该方法能用于筛选适 用于免疫治疗的的过敏患者以及正在接受免疫治疗的患者的免疫状态监测。A. Reuter等 [17]利用重组的rPru av 1，3，4三种分子分别以单独和混合的方式对樱桃过敏患者进行了 血清学诊断试验的评价，重组分子混合模式的诊断其敏感度为95 %，而樱桃变应原浸液的 诊断敏感度仅为65%。而在免疫治疗方面，Adriano Mari等[18]特异性免疫治疗的模式做 了新的探讨，认为有一些单变应原分子致敏的患者，可以以纯化或重组的变应原分子进行 免疫治疗；而对同一种花粉的多种变应原或引起交叉反应的不同花粉的变应原，则可以按 传统的变应原浸液进行免疫治疗；对于多种花粉致敏的患者，则可以按照“鸡尾酒”的模式 进行变应原分子的混合后再行免疫治疗。以Chimeric ELISA的模式进行过敏原的血清学诊断，基本原理在于，以变应原特 异的小鼠单抗为捕获抗体包被酶标板，然后加入变应原浸液或纯化的变应原，然后加入标 准血清、待测血清和阴性血清，最后加入鼠抗人IgE单抗，显色后经酶标仪读数，通过与标 准曲线对照，计算待测血清样本中针对该变应原的sIgE[19]，模式图见附图1。Martin等[19] 认为该Chimeric ELISA模式与CAP系统检测变应原特异的slgE有较好的相关性，在临床 和流行病研究中很有用，又由于其简单实用，在基层医院即可操作。Trombone AP_等以 Chimeric ELISA的方法研究分析了尘螨过敏患者血中IgE抗体对于尘螨变应原Derpl和 Der p2的反应情况，并与CAP系统检测对于螨体变应原浸液Dpt的情况作了比较，发现前者 前者与后者明显相关。所有尘螨过敏患者中，70%患者对于Dpt的slgE检测为阳性，76. 5% 患者对Der pi血清阳性，79. 2%患者对Der ρ2血清阳性，83. 对于Der pi和Derp2联 合检测为阳性。作者认为当Der pi或者Der p2的Cut-off值在2IU/ml的时候，对于CAP 系统检测Dpt阳性预期值大于95%。由于潷草花粉由于地理分布广、流行病学意义重大而倍受国内外研究者重视。在 国内李东栋[21]等对武汉地区潷草花粉变应原蛋白质组分的进行了双向电泳分析，孙秀珍 [22]等对潷草花粉变应原致敏组分进行了研究；刘昀[23]等构建潷草和初步鉴定了花粉cDNA 表达文库，陶爱林等[24]创建了潷草及豚草过敏原的嵌合基因，并对其抗原性作出评价；尹 佳[25]等研究了皮内试验和血清特异性IgE检测在诊断潷草花粉症中的临床价值等。但一直 以来，对于潷草主要变应原一直没有足够的认识。直至最近，率先由北京协和医院变态反应 科尹佳等纯化、克隆、鉴定一个潷草花粉致敏蛋白，其过敏患者血清slgE结合率约为74%， 确定为潷草主要致敏蛋白，拟定名为Hum j3。本申请发明人利用纯化的天然潷草主要致敏蛋白，免疫BALB/c小鼠，得到了杂交 瘤单抗，通过对单抗的筛选，首次构建了以ChimericELISA方法测定潷草花粉过敏患者血 中Hum j3 specific-sIgE水平的ELISA方法，该方法具有很好的敏感性、特异性、线性检测 范围、显色稳定性，为筛选和监测Hum j3进行分子免疫治疗的患者提供了全新的、易于标准 化的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测Hum j3特异性IgE抗体的ELISA试剂盒。为实现上述目的，本发明首先利用通过纯化主要致敏蛋白Hum j3免疫BALB/c 小鼠，经过筛选获得小鼠杂交瘤单抗，这种单抗要求能够能捕获Hum j3分子，但不与Hum j3-Specific-SIgE抗体竞争抑制。本发明通过筛选获得一株综合性状优良的杂交瘤细胞株 (Hum j3-#87-mAb)，该杂交瘤细胞已于2009年7月28日在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心保藏，分类命名为小鼠杂交瘤细胞，保藏号为CGMCC No. 3208。 基于上述单克隆抗体，本发明提供一种检测Hum j3特异性IgE抗体的ELISA试剂 盒，所述包括包被捕获抗体的酶标板，所述捕获抗体为Hum j3单克隆抗体，且该抗体不与 Hum j3特异性IgE抗体产生竞争抑制。本发明试剂盒还可包括以下试剂中的一种或多种1)洗涤液；2)底物显色液；3) 反应终止液；4)Hum j3标准品；5)检测抗体。所述检测抗体为酶标记抗人IgE抗体，如酶标记鼠抗人IgE单克隆抗体。所述检 测抗体的标记酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶或β “半乳糖苷酶。在使用具体的标记酶时，底物显色液、终止液应当相适应。例如使用辣根过氧化物 酶作为标记酶时，显色剂可由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧 化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1 2mol/L的硫酸或盐酸缓 冲液；碱性磷酸酶作为标记酶时，显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为1 2mol/L氢氧 化钠溶液。所述洗涤液可以是PBST，或者是其浓缩液。所述包被捕获抗体的酶标板的包被可按每孔添加100 μ 1 5 μ g/L的捕获抗体，于 4°C包被酶标板过夜(12h)，PBST洗涤后，用BSA-PBST封闭液封闭1. 5h。应当理解本发明单克隆抗体不仅限于制备上述检测试剂盒，其可以用于制备任何 检测Humj 3特异性IgE抗体的ELISA试剂。本发明首次在建立了检测潷草过敏患者血中针对Hum j3分子slgE水平的ELISA 方法，并提供相关的检测试剂盒；首次探讨了该方法在Hum j3过敏病人临床诊断方面的运 用，为监测潷草花粉主要致敏蛋白Hum j3过敏患者Hum j3特异性IgE水平以及以后的分 子免疫治疗提供了全新的、易于标准化的途径。
图l.Chimeric ELISA方法测定潷草花粉过敏患者血中Hum j3specific_sIgE水 平的ELISA方法示意图；图 2. UniCAP system 检测的 w22sIgE 水平与 Chimeric ELISA 方法测定 Hum j3 specific-sIgE水平之间的关系；图3. Chimeric ELISA方法测定潷草花粉过敏患者血中Hum j3specific-sIgE水 平的ROC曲线；图4. Chimeric ELISA方法测定潷草花粉过敏患者血中Hum j3specific_sIgE水 平的标准曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如 抗体技术实验指南，Ed Harlow, David Lane等著，沈关心，龚菲力等译，科学出版社，2000 年，第一版)，以及相关制造厂商所建议的要求。本发明中涉及到的百分号“ ％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分 比，除另有规定外，是指溶液IOOml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20°C时 容量的比例。实施例IChimeric ELISA方法的建立1、潷草花粉主要致敏蛋白Hum j3的获得通过分子凝胶层析、离子交换层析、亲和层析获得天然潷草花粉纯化主要 致敏蛋白Hum j3。具体工作参见尹佳等专利——潷草花粉主要致敏蛋白，申请号 200710122176. 4。2、针对Hum j3的小鼠杂交瘤单抗的获得获得天然纯化潷草主要致敏蛋白Hum j3后，参照“杂交瘤技术与单克隆抗体制 备”(巴德年主编，《当代免疫学技术与运用》，第十一章，P351-364)完成小鼠杂交瘤单抗的 制备与初筛。具体工作参见尹佳等专利——潷草花粉主要致敏蛋白单克隆抗体，申请号 200710122175. X。通过筛选获得多株稳定分泌抗Hum j3的单克隆抗体，通过单抗抑制血清与Hum j3 结合的抑制ELISA可以推知单抗与Hum j3分子的非slgE结合位点结合。实验操作程序和 条件如下100 μ 1 1 μ g/ml纯化的Hum j3于4°C包被12h ；1% BSA-PBST封闭1. 5小时后； 加入50 μ 1 0. lmg/ml的单抗，再加入50 μ 1 1/4稀释的混合血清池(20位潷草过敏患者血 清混合，原血清池w22sIgE检测为4级，48. 5kUA/ml，CAP System)，混勻单抗与血清，37°C温 育3h (对照仅加入50ul 1/4稀释的混合血清池，然后加入50 μ 1 1% BSA-PBST封闭液)； 加入HRP标记的1 2000稀释的鼠抗人IgE单抗，37°C温育2h;最后显色，于0D492nm处 读数。计算抑制率。通过该方法获得一株综合性状优良的杂交瘤细胞株，其抑制率仅为 4. 74%，该株已于2009年7月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保 藏进行了保藏。故可以以该单抗捕获Hum j3后，结合患者血清中的Hum j3-specific-sIgE 抗体，然后以HRP酶标的抗IgE小鼠单抗作为二抗结合，最后显色的方式构建检测Hum j3-specific-sIgE水平的方法。由于#87号单抗能特异识别Hum j3分子，所以该Chimeric ELISA也可以直接以经过标定的潷草花粉变应原浸液替代纯化的Hum j3分子作为标准品， 省却了需要纯化Hum j3分子的繁琐过程。3、潷草过敏患者标准混合血清池、阴性对照血清池、待测血清的搜集以及诊断标 准(1)潷草花粉过敏患者临床综合诊断标准，参见文献[25] 1)典型夏秋季花粉过敏 病史季节性鼻炎、眼结膜炎和或支气管哮喘，夏秋季节(7月 10月)发病，潷草花粉浸液 皮内试验≥+，同时潷草花粉RAST slgE≥I级(0. 35kUa/l)；或2)病史和症状典型，单纯 潷草花粉浸液皮内试验≥ ++者；或3)病史和症状典型，单纯潷草花粉RASTsIgE ≥ II级(0. 70kUa/l)。(2)不对潷草花粉过敏但对其它花粉过敏患者的诊断标准(例如树木花粉、其它 杂草花粉、牧草花粉)1)典型花粉过敏病史季节性鼻炎、眼结膜炎和或支气管哮喘；2) 致敏花粉浸液皮内试验彡++;3)致敏花粉RAST SlgE彡II级(0. 70kU/l) ；4)潷草花粉 RAST slgE检测为阴性。(3)健康对照受试者标准1)无花粉过敏病史；2)潷草花粉浸液皮内试验阴性； 3)潷草花粉RAST试验阴性。按照上述诊断标准，搜集受试者血清。其中，潷草花粉过敏患者30例，其它花粉过 敏但潷草花粉不过敏者15例，健康患者10例。4、检测 Hum j3-specific_sIgE 水平的 Chimeric ELISA 方法的构建优化ELISA方法检测潷草花粉主要致敏蛋白过敏患者血中Humj3-SpeCific-sIgE 水平的条件包被单抗浓度、潷草变应原浸液或纯化潷草花粉主要致敏蛋白的稀释浓度，标 准血清池的梯度稀释范围，酶标鼠抗人IgE单抗的稀释浓度，显色时间；相关实验条件和操作确定如下(1)以 100 μ l#87-mAb (0· 5 μ g/ 孔)4°C包被酶标板 12h 过夜；
(2) 1 XPBST洗液洗涤液洗板5次，1 % BSA-PBST封闭液1. 5h ；(3) IXPBST洗液洗涤液洗板5次，加入连续11个2X梯度稀释的初始浓度为 0. 05 μ g/ml的天然纯化潷草主要致敏蛋白Hum j3标准品100 μ 1 (或者是Hum j3含量经过 标定的潷草变应原浸液标准品)；(4) 1 XPBST洗液洗涤液洗板5次，加入由20位潷草过敏患者混合血清池稀释度从 1 2. 5开始做10个2X的倍比稀释直至1 1280;然后加入30份潷草过敏患者待测血 清、15份其它花粉过敏但潷草花粉不过敏者血清、10份非过敏健康空白对照。检测时待测 血清稀释度均为1 10。(5) IX PBST洗液洗涤液洗板5次，加入1 2000稀释的辣根过氧化物酶标记鼠抗 人IgE单抗100 μ 1。(6)加入OPD-H2O2显色液缓冲液，5min后终止显色，0D492读数。(7)以潷草主要致敏蛋白Hum j3标准品的剂量-效应曲线为标准曲线，计算样品 Hum j3含量。5、确定ELISA检测潷草花粉过敏患者血中Hum j3 specific-sIgE的各种方法学 指标敏感性、特异性、线性范围。1)按照临床综合诊断标准将入选受试者分为患病和未患病，以标准血清池的稀释 度(或对应的OD显色值)为不同的分界点，拟合ROC曲线，确定该Chimeric ELISA诊断试 验有最佳灵敏度和特异度的cut-off值。结果(图3)，最佳血清稀释度的阳性阈值定在1 320稀释度处，此时0D492吸 光度值为0.18。低于此值，则判断为Hum j3Specific-SIgE检测结果阴性。在该cut-off 值时，以Hum j3作为分子标记和Chimeric ELISA方法作为检测方法来诊断潷草花粉过敏 的敏感度为93.1%，特异性为90. 9 %，阳性预期值是93. 5 %，其阴性预期值是90. 5 %。而 当0D492 > 0. 63时，其诊断特异性为95% ；当OD > 1. 5时，有100%的诊断特异性。说明 Hum j3可以作为潷草花粉过敏的一个分子标记；拟合的ROC曲线显示，该诊断试验ROC曲线下面积A为0.901，说明其诊断价值较高，Chimeric ELISA可以作为潷草花粉过敏的诊断试验。2)在最佳cut-off值时，以Chimeric ELISA检测结果与UniCAPSystem检测的结 果作一致性分析，判断以Hum j3作为分子标记和Chimeric ELISA方法作为检测方法来诊 断潷草花粉过敏时是否合适。在最佳血清稀释度的阳性阈值为1 320稀释度时对应的吸光度值为0.18为界 限，Chimeric ELISA检测的结果与UniCAP System的检测结果(≥1级为阳性判断标准)， 两个诊断试验的一致性为κ = 0. 840，有很好的一致性(图2)。3)在Chimeric ELISA中，将标准血清池所拟合的标准曲线进行分析，判断最好的 线性范围，以便对待测血清的Hum j3 specific-sIgE进行分级。表1潷草过敏患者血清样本基本信息与检测结果
权利要求
一种用于检测Hum j3特异性IgE抗体的ELISA试剂盒，其包括包被捕获抗体的酶标板，所述捕获抗体为Hum j3单克隆抗体，且该抗体不与Hum j3特异性IgE抗体产生竞争抑制。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体为杂交瘤细胞Hum j3-#87-mAb CGMCC No. 3208 分泌获得。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其还包括以下试剂中的一种或多种1)洗涤液；2)底物显色液；3)反应终止液；4)Hum j3标准品；5)检测抗体。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体为酶标记鼠抗人IgE单克隆 抗体。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体的标记酶为辣根过氧化物 酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶或β-半乳糖苷酶。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为PBST。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述底物显色液为OPD-H2O2显色液、终止 液为2mol/L H2SO4，所述检测抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
8.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述包被捕获抗体的酶标板的包被 方法是每孔添加100 μ 1 5 μ g/L的捕获抗体4°C包被酶标板12h过夜，PBST洗涤后，用 BSA-PBST封闭液封闭1. 5h。
9.由杂交瘤细胞Humj3-#87-mAb CGMCC No. 3208分泌产生的单克隆抗体。
10.权利要求9所述单克隆抗体在制备检测Humj3特异性slgE抗体的ELISA试剂中 的应用。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测葎草花粉过敏患者血中Hum j3specific-sIgE(Hum j3特异性IgE)水平的ELISA试剂盒。该试剂盒的捕获抗体为Hum j3单克隆抗体，该抗体不与Hum j3特异性IgE抗体产生竞争抑制。该试剂盒具有良好的敏感性、特异性、线性检测范围、显色稳定性，为监测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3过敏患者血样本中Hum j3特异性IgE水平以及以后的分子免疫治疗提供了全新的、易于标准化的途径。
文档编号G01N33/577GK101988925SQ200910090768
公开日2011年3月23日 申请日期2009年8月6日 优先权日2009年8月6日
发明者周俊雄, 尹佳 申请人:中国医学科学院北京协和医院