专利名称：一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种在蛋白免疫印迹实验中实 现不同分子量蛋白同时显示的新型蛋白质分子量标准，此蛋白质分子量标
准由一系列串联不同数目SPA的重组蛋白组成。
背景技术：
蛋白免疫印迹法(Western Blot)在免疫学中有着极其广泛的应用，它 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤 维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离 的蛋白质类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质作为抗原，与 对应的抗体孵育结合，再与酶标记的第二抗体孵育结合，经过底物显色或 产生荧光并底片曝光以检测电泳分离的特异性蛋白的表达情况。
蛋白质分子量标准通常是由 一系列已知分子量但大小不同的蛋白质 组成，它主要应用于蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过分子量的比较从而判 断目的蛋白在凝胶上的位置。在免疫印迹法实验中，由于常规的蛋白质分 子量标准无法和目的蛋白的抗体及相应的第二抗体反应，从而无法显色， 尤其是无法产生荧光从而在底片上显影，导致无法通过蛋白质分子量标准 的辅助而正确判断目的蛋白在底片上的正确位置。
葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A， SPA)是致病性金黄色葡 萄球菌细胞表面一种特有的蛋白质，具有与多种哺乳动物IgG的Fc段结合 的能力，它的基因序列已经公开。因此，利用SPA蛋白的独特性质，采用基因工程技术优化其核苷酸序列，使不同数目的SPA串联表达并纯化，研 制出能够在蛋白免疫印迹实验中实现不同分子量蛋白同时显示的新型蛋 白质分子量标准，为蛋白免疫印迹法的广泛使用提供了一种重要试剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够在蛋白免疫印迹实验中实现不同分子量 蛋白同时结合多种哺乳动物IgG抗体，并且能够在底片上显示的新型蛋白 质分子量标准。这种蛋白质分子量标准是由一系列串联不同数目SPA的重 组蛋白组成。
为实现本发明的目的，拟采用以下技术方案(1)釆用大肠杆菌偏爱
密码子将天然SPA基因核苷酸序列优化，以利于目的蛋白在大肠杆菌中的 表达。(2)以优化过的SPA序列为模板进行引物设计、合成，通过拼接引 物并PCR扩增得到目的片段。(3)将目的片段以不同串联数目的方式插入 表达载体PET-28a(+)，并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。(4)通过镍 琼脂糖亲和层析纯化，得到一系列串联不同数目SPA的重组蛋白，即蛋白 质分子量标准。(5)通过蛋白免疫印迹实验证实该蛋白质分子量标准能与 多种哺乳动物IgG抗体结合。
与现有技术相比，本发明利用葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A， SPA)具有与多种哺乳动物IgG的Fc段结合的能力，采用基因工程技术优化 其核苷酸序列，使不同数目的SPA串联表达并纯化，研制出能够在蛋白免 疫印迹实验中实现不同分子量蛋白在底片上同时显示的新型蛋白质分子 量标准，克服了传统蛋白质分子量标准无法在胶片上显示的缺点，为蛋白 免疫印迹法的广泛使用提供了一种重要试剂，使得蛋白免疫印迹法的结果更具可信度和说服力。
图l是质粒构建过程示意图。
图2是鼠源性IgG抗体和兔源性IgG抗体在X光底片曝光、显影、定影 后的结果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步详细说明，所述实验例旨 在以举例方式具体阐明本发明。试剂、试剂的浓度、温度和其它变量的值 以及载体和宿主的选择只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的 限制。以下说明不用于限制本发明的范围。
1. 优化编码SPA蛋白的核苷酸序列
为了提高SPA蛋白的表达量，在SPA蛋白氨基酸序列不变的前提下,采 用大肠杆菌偏爱密码子将编码SPA蛋白的核苷酸序列优化，优化后的核苷 酸序列是序列表中SEQ ID NO: 1。
2. SPA多重串联质粒的构建
以优化后的SPA核苷酸序列为模板进行引物设计合成，通过引物退火 拼接并PCR扩增获得目的片段。PCR反应条件为94。C变性5分钟，55。C退 火20秒，72。C延伸30秒，总共35个循环，最后再72。C延伸10分钟。PCR 产物行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。引物序列如下所示
Fl of SPA:
5'-GGATCCGTGGATAAC嵐TTTMCAMGMCAGCAGAACGCCTTTTATGAAATTCTGCATCT-3'Rl of SPA:
5'-CAGGCTCTGMTAAAGGCGTTGCGCTGTTCTTCGTTCAGGTTCGGCAGATGCAGAATTTCATA-3' F2 of SPA:
5'-CGCCTTTATTCAGAGCCTGAAAGATGATCCGAGCCAGAGCGCCMCCTGCTGGCCGMGCCM-3' R2 Of SPANS' -GAATTCTTAGGTCTCGGATCACTTCGGGGCCTGGGCATCGTTCAGCTTCTTGGCTTCGGCCAGCAG-3' 将该目的片段连接pMD19-T载体，得到重组质粒pMD19-T-SPA*1 。由
于插入的目的片段末端设计有Bsal酶切位点，该内切酶的识别序列与剪
切序列不同，所以以pMD19-T-SPAW为出发质粒，可实现目的片段的再次
插入，得到重组质粒pMD19-T-SPA求2。同理类推，依次可得到SPA多重串
联的重组PMD19-T质粒(详细质粒构建过程参见图1)。
3. 重组表达载体的构建
将实施步骤2中的SPA多重串联的重组pMD-19T质粒用BamHI、 EcoRI 双酶切处理，胶回收试剂盒回收目的片段。BamHI、 EcoRI双酶切处理原核 表达质粒PET-28a(+),胶回收试剂盒回收载体。用T4 DNA连接酶将目的片 段和PET-28a(+)连接，经酶切鉴定后，得到多个表达SPA多重串联的原核 表达质粒。
4. 蛋白质分子量标准的表达及纯化
将实施步骤3中获得多个表达SPA多重串联的原核表达质粒转入大肠 杆菌BL21(DE3)中，得到一系列表达蛋白质分子量标准的菌种。将这些菌 种分别接种于含卡那青霉素的LB液体培养基中，250rpm/min， 37。C培养 12小时后加诱导剂异丙基硫代-e -D-半乳糖苷至终浓度为1. 0mmol/L，继 续培养4小时后，5000rpm/min，离心20分钟，富集菌体。菌体用lOmMPBS(ra7.4)缓冲液重悬，冰浴，超声波破碎5-10分钟，高速冷冻离心并 收集上清。收集到的上清分别和镍琼脂糖混和后，先用低浓度咪唑溶液 (50mM)洗涤杂蛋白，再用高浓度咪唑溶液(300mM)洗脱并收集目的蛋 白，透析后于-2(TC备用，得到一系列串联不同数目SPA的重组蛋白，即 蛋白质分子量标准，各个蛋白的分子量分别为15kD、 21kD、 30kD、 40kD、 60kD、 95kD。 5. Western Blot
纯化后的蛋白质分子量标准行12%SDS-PAGE,电转移到PVDF膜，一 抗分别为随机挑选的鼠源性IgG抗体和兔源性IgG抗体，二抗为相对应的 HRP标记的羊抗鼠抗体和羊抗兔抗体，底物为Western Blot常用的鲁咪诺 荧光底物。X光底片曝光、显影、定影(结果参见图2)。 相关溶液配方
1. 电泳缓冲液
Glyl 8. 8g, Tris 3. 03g， SDS lg，加双蒸水定容至1000ral。
2. 转膜缓冲液
Gly 2. 9g， Tris 5. 8g， SDS 0. 37g，甲醇200ml，加双蒸水定容至 1000ml。
3. 洗漆液
Tris 3g, NaCl 8g， KC1 0.2g， Tween-20 1ml ，定容至1000ml (pH7.8)。
4. 荧光底物
Pierce公司产品(货号Prodtt34075)。序列表
〈101 〉杭州松华生物科技有限公司 <120>—种新型蛋白质分子量标准及其制备方法
<160〉2
<210〉1
<211〉174
<212〉腿
〈400〉1
GTGGATAACA AATTTAACAA AGAACAGCAG MCGCCTTTT ATGMATTCT 50
GCATCTGCCG AACCTGMCG AAGAACAGCG CAACGCCTTT ATTCAGAGCC 100
TGAAAGATGA TCCGAGCCAG AGCGCCAACC TGCTGGCCGA AGCCAAGAAG 150
CTGAACGATG CCCAGGCCCC GAAG 174
<210〉2
<211〉58
<212>PRT
<400〉2Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu 15 10 15
lie Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Ala Phe
20 25 30
lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin Ser Ala Asn Leu Leu
35 40 45
Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gin Ala Pro Lys
50 55 End
权利要求
1.一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将天然SPA基因采用大肠杆菌偏爱密码子将其核苷酸序列优化，优化后的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO1。(2)以优化后的SPA基因序列为模板设计引物并化学合成，通过引物拼接并PCR扩增的方法得到目的片段。(3)将目的片段以不同串联数目的方式插入表达载体PET-28a(+)，并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。(4)通过镍琼脂糖亲和层析纯化，得到一系列串联不同数目SPA的重组蛋白，即蛋白质分子量标准。(5)通过蛋白免疫印迹实验证实该蛋白质分子量标准能与多种哺乳动物IgG抗体结合。
2. 根据权利要求1所述的一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法，其 特征在于蛋白质分子量标准中的每个蛋白均串联不同数目的SPA， SPA的 氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO: 2。
3. 根据权利要求1所述的一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法，其特 征在于步骤(1)将天然SPA基因采用大肠杆菌偏爱密码子将其核苷酸序 列优化。
4. 根据权利要求1所述的一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法，其特 征在于步骤(2)中以步骤(1)优化后的SPA基因序列为模板设计引物并 化学合成，通过引物拼接并PCR扩增的方法得到目的片段，，最终得到的 目的片段包含步骤(1)所述的SPA核苷酸序列。
5. 根据权利要求1所述的一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法，其特征在于步骤(3)将步骤(2)获得的目的片段以不同串联数目的方式插入 表达载体PET-28a (+)，具体的串联数目不限。
6. 根据权利要求1所述的一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法，其特 征在于步骤(3)还包括将步骤(2)获得的目的片段以不同串联数目的方 式插入表达载体PET-28a(+)后，转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到一系列表 达蛋白质分子量标准的菌种。
7. 根据权利要求1所述的一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法，其 特征在于步骤(3)还包括将权利要求6所述的一系列表达蛋白质分子量 标准的菌种分别接种于含卡那青霉素的LB液体培养基中，250rpm/inin， 37。C培养12小时后加诱导剂异丙基硫代-D-半乳糖苷至终浓度为 1. O咖ol/L，继续培养4小时后，5000rpm/min，离心20分钟，富集菌体。 菌体用10mMPBS(ra7.4)缓冲液重悬，冰浴，超声波破碎5-10分钟，高速 冷冻离心并收集上清。
8. 根据权利要求1所述的一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法，其 特征在于步骤(4)将权利要求7所述得到的上清混和镍琼脂糖，先用低 浓度咪唑溶液(50mM)洗涤杂蛋白，再用高浓度咪唑溶液(300mM)洗脱 并收集目的蛋白，得到一系列串联不同数目SPA的重组蛋白，即蛋白质分 子量标准。
9. 根据权利要求1所述的一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法，其 特征在于步骤(5)蛋白免疫印迹实验中所用的蛋白质分子量标准为步骤(4)得到的蛋白质分子量标准。免疫印迹实验中， 一抗分别为多种哺乳 动物IgG抗体，二抗为相对应的HRP标记或其它标记的IgG抗体，催化底物为鲁咪诺等荧光底物，胶片曝光并显影、定影。
10.根据权利要求l所述的一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法，其 特征在于所述的蛋白质分子量标准可用于哺乳动物IgG抗体的结合、检测、 分离、纯化。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域。本发明公开了一种新型蛋白质分子量标准及其制备方法。具体方法是将不同数目SPA(金黄色葡萄球菌蛋白A，Staphylococcal protein A)串联表达得到的重组蛋白作为蛋白质分子量标准。本发明还公开了利用SPA具有与多种哺乳动物IgG的Fc段结合的能力，应用该新型蛋白质分子量标准并最终使其在胶片上显影的方法。本发明还公开了通过基因工程技术优化SPA核苷酸序列的方法及其优化后的核苷酸序列。本发明还公开了利用BsaI酶切位点将多个SPA串联表达并纯化的方法。
文档编号G01N33/68GK101556287SQ20091009598
公开日2009年10月14日 申请日期2009年2月26日 优先权日2009年2月26日
发明者卫 余, 余铭恩, 冯俊涛, 吴琼杉, 翔 敖, 李晓照 申请人:杭州松华生物科技有限公司