专利名称：药物中可被人体吸收的微量元素含量的模拟检测方法
技术领域：
本发明涉及一种模拟检 测方法，具体地涉及一种药物中可被人体吸收的微量元素 含量的模拟检测方法。
背景技术：
微量元素与人体健康密切相关，微量元素在人体内按照生理作用的不同可分为必 需微量元素和非必需微量元素，人体必需的微量元素包括铁、镁、锌、钙和铜等，在人体内具 有广泛的生理作用，如作为构成各种生物活性酶的辅助因子，参与激素、维生素的合成，及 作为重要的电子传递体等，微量元素还可在药物吸收中发挥作用，药物配位化学学说认为 微量元素配合物是真正的整体意义上的药物有效成分，这其中，铁、铜、锌等微量元素配合 物在国内外已用于临床治疗，又比如，锌、铬与黄芩苷形成的配合物的生物活性较黄芩苷提 高，疗效增强，此为微量元素配合物是药物有效性重要基础的有力佐证。但另一方面，药物安全性对人体健康至关重要，微量元素过量对机体造成损伤，乃 至致死，因此，世界卫生组织、美国环保署、美国食品与药物管理局高度重视微量元素的危 险性评价。中药作为一种含有大量微量元素的载体，其微量元素分析和测定已有大量报导， 但大多限于总量测定，在样品处理时则多采用固相微萃取、超临界流体萃取、加压液相萃 取、微波辅助萃取或固相萃取等。另外，药物中微量元素配合物只有具有生物可给性，即可 被胃、肠等主要消化器官所摄取，吸收，通过许多生物膜，才能到达作用部分，才能发挥其药 效，生物可给性是评价微量元素安全性和有效性重要基础。目前从事微量元素形态方面的研究甚少，现有的“形态研究”把微量元素形态界 定为分子量分布、无机态、有机态、悬浮态、可溶态、水溶态、碱溶态、稳定态、不稳定态、水提 取态或超临界CO2流体萃取态等，此类传统方法依据物理、化学性质上的差异性进行形态分 离，沿用“纯粹”、“传统”的物理及化学形态概念，与生物膜的结构特性无关、与微量元素配 合物在人体的消化和吸收情况无关，无法揭示各“形态”在生物可给性上的差异，无法为微 量元素作用机制的阐述和有效作用剂量的制定提供依据，无法为有效性和安全性评价提供 背景资料，忽视药物系统原理和人体消化系统对形态和生物可给性的影响。目前药物中微量元素的生物可给性评价方法有溶解性和吸收性两类。溶解性评价 的不足之处在于，不能测定被吸收或络合的微量元素，只能研究溶解性的非血红素微量元 素；在吸收性评价中，化学平衡法是研究人体中微量元素吸收的较好方法，但烦琐耗时、费 用高；全身示踪元素计数法(whole-body counting)具有辐射危害，且测量进药后血浆中 微量元素含量变化对比意义不大；人结肠癌细胞(Caco-2细胞)是近年来国外采用的一种 研究药物经肠吸收的体外模型，但绒毛细胞培养过程的操作难度较大；白鼠及其他动物活 体实验则与人体生理环境差异较大，用其来验证药物的药理效果，其准确性尚存有疑问。
发明内容
本发明的目的在于提供一种药物中可被人体吸收的微量元素含量的模拟检测方法，以解决现有技术中存在的上述问题。本发明可以基于药效模拟检测可被人体吸收的微
量元素含量。本发明提供的技术方案如下 药物中可被人体吸收的微量元素含量的模拟检测方法，包括如下的步骤1)在一容器中加入含有微量元素的药物，而后加入模拟唾液，在36 38°C下振荡 3 6分钟；2)而后向上述容器中加入模拟胃液，在36 38°C下继续振荡1 4小时，获得药 物的体外胃仿生消化液；3)向步骤2中获得的体外胃仿生消化液中加入模拟十二指肠液和模拟胆汁，在 36 38°C下继续振荡5 10小时，而后使用孔径为0. 45 μ m的滤膜抽滤，获得体外胃肠全 仿生消化液；4)取蛋黄卵磷脂，将其溶于氯仿中，获得蛋黄卵磷脂的氯仿溶液；将上述溶液移 入具塞的圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发，使之形成均勻的多层脂质膜，而后 向其中充入氮气以防止多层脂质膜被氧化；向其中加入步骤3中获得的体外胃肠全仿生消 化液，将其加入水浴恒温振荡器中，在36 38°C下振荡，使多层脂质膜全部进入全仿生消 化液中，而后在-80 -71°C冷冻lh，在36 38°C下融化，反复冻融3次后，得到含单层脂 质体的冻融液，该单层脂质体中负载有微量元素；5)依次用孔径为0. 45 μ m和0. 22 μ m的滤膜抽滤冻融液，从溶液中分离获得负载 有微量元素的单层脂质体(单层脂质体粒径为0. 3 0. 35 μ m)；6)取上述制得的单层脂质体膜放置于聚氯乙烯消解罐中，每克单层脂质体膜依 次加入7. 5 8. 5mL浓HNO3和3. 5 4. 5mL30% H2O2，于70 90°C的水浴中预处理20 30min，待黄烟散尽，再向每克单层脂质体膜依次加入3. 5 4. 5mL浓HNO3和1. 5 2. 5mL 30% H2O2，加盖安全膜后，旋紧外盖后进入密闭微波消解系统消解，获得消解液，应用原子吸 收光谱法、紫外可见分光光度法或电感耦合等离子质谱法对消解液中微量元素含量进行测 定后获得。本发明中所述的含有微量元素的药物不涉及药物的具体种类，可以是西药，也可 以是中药，一般是指需要做微量元素含量检测的中药。本发明建立的体外全仿生消化技术在不同消化阶段按照不同消化器官在一定时 间内分泌出的消化液的成份和量，加入相应的仿生消化液，再根据药物的不同剂型在人体 消化器官中的排空时间合理安排各个阶段的消化时间，并模拟消化器官有规律的蠕动，建 立微量元素的模拟消化过程，以此来获得全仿生消化液，合乎中医药理论的系统观、整体 观；另外，鉴于消化管和血管间的生物膜是类脂质膜，因此，本发明建立细胞膜仿生萃取技 术，提取可与模拟细胞膜(即单层脂质体)结合的微量元素配合物，微量元素配合物的形态 不同，靶位环境不同，亲脂性和亲水性不同，在生物膜上的吸收性能不同，生物可给性和药 效必然不同，微量元素配合物对生物膜的亲合性对其有效性和安全性起着关键作用，机体 对不同形态的微量元素配合物的吸收能力和吸收量亦不同。模拟唾液、模拟胃液，模拟十二指肠液和模拟胆汁的组成成分及制备方法可如表1 中所示表1模拟唾液、模拟胃液、模拟十二指肠液及模拟胆汁的组成成份及制备方法
“模拟唾液 模拟胃液模拟十二指肠液模拟胆汁
IOmL 15.7mL40mL 30 mL
89.6g/LKCI NaCl 175.3g/LNaCl 175.3g/L NaCl 175.3g/L
IOmL 3.0mL40mL 68.3 mL
KSCN20g/L NaH2P0488.8g/LNaHCO3 84.7g/L NaHCO3 84.7g/L
IOmL 9.2 mLIOmL 4.2 mL
NaH2P0488.8g/L KCl 89.6gKH2PO4 8g/L KCl 89.6g/L
J IOmL 18mL6.3 mL 0.2 mL
2 Na3P0457g/L CaCl2.2H20 2.2g/LKCl 89.6g/L HQ 37%g/g
= 1.7 mL IOmLIOmL IOmL
刑 NaC1175.3g/L NH4Cl 30.6g/LMgCl2 5g/L CaCl2.2H20 22.2g/L
1.8 mL 8.3 mL0.18 mL
NaOH40g/L HCl 37%g/gHCl 37%g/g
9mL
CaCl2.2H20 22.2g/L
有 8 mL IOmL4 mL
机 尿素25%/L· 葡萄糖65g/L尿素25g/L 试 IOmL 剂 葡萄糖醛酸2g/L
3.4 mL 尿素25g/L IOmL
33g/L葡萄糖胺盐酸
盐
生 145mga-淀粉酶Ig牛血清蛋白Ig牛血清蛋白 1.8g牛血清蛋白
物 15mg尿酸 Ig胃蛋白海3g胰酶 6g胆汁
酶 50mg粘液素 3g粘液素0.5 g脂肪酶
pH 6.5±0.2 1.07±0.077.8±0.2 8.0tt0.2 备用盐酸或氢氧化钾稀溶液调pH值，用超纯水定容至500mL,在4·0下保存。
_Μ_
----- \根据药物中微量元素有效作用剂量胃、肠含量的加和值(胃和肠全仿生消化 液单层脂质体结合态金属加和值)和微量元素日推荐允许摄入量(Reference Daily Allowance，RDA，美国食品与药物管理局(USFDA)制定，见表2)，制订推荐剂量，保证用药安 全，实现安全性评价；据药物中微量元素有效作用剂量胃、肠含量的加和值和微量元素日摄 入上限(Tolerable Upper Intake Level，UL，USFDA制定，见下表)，制订限制剂量，做为危 险性评价的依据。 表2微量元素日推荐允许摄入量
\__
微量元素RDA (mg/day)UL(mg/day)
铜0.910
碘0.151.1
铁8(男性和51岁以上女生)18(19-50岁女性) 45
银0.0452
硒0.0550.4
锌11 (男性)8(女性) 40 本发明中使用的蛋黄卵磷脂与全仿生消化液的重量体积比为0.005 0. 015g/1000mL，优选为0. 01g/1000mL。蛋黄卵磷脂模拟细胞膜吸收，消化管和血管间的生 物膜是类脂质膜，微量元素配合物只有具有细胞膜亲合性，才能进入人体，因此可用细胞膜 仿生萃取技术得出能进入人体的微量元素的量。且0. 005 0. 015g的蛋黄卵磷脂所形成 的模拟细胞膜的体积大约为2000 6000mL，远大于IOOOmL的全仿生消化液体积，足以吸收 全部具有细胞膜亲和性的微量元素配合物。
在推荐的实施例中，还包括将步骤2中获得的体外胃仿生消化液用孔径为 0. 45 μ m的滤膜过滤的步骤。本发明中涉及的含有微量元素的药物可以是中药材或中药复方的粉剂或水煎液 等，且每日/每次给药量的粉剂或水煎液中均含有有效剂量的药物有效成分，在使用粉剂 时，每克粉剂中依次加入模拟唾液2. 0 3. OmL,模拟胃液90 IlOmL,模拟十二指肠液 110 135mL和模拟胆汁40 60mL ；在使用水煎液时，每mL水煎液中依次加入模拟唾液 0. 01 0. 03mL,模拟胃液0. 5 0. 7mL,模拟十二直肠液0. 7 0. 9mL和模拟胆汁0. 28 0. 35mL。另外，相对于粉剂而言，水煎剂在模拟胃液、模拟十二直肠液和模拟胆汁中的消化 时间均有所下降。本发明中所述的超纯水是指将水中的导电介质几乎完全去除，又将水中不离 解的胶体物质、气体及有机物均去除至很低程度的水，电阻率大于18MQ*cm，或接近 18. 3MQ*cm 极限值。与现有技术相比，本发明以单层脂质体为细胞生物膜模型，以单层脂质体-水分 配体系模拟药物中的微量元素在胃、肠中的全仿生消化液分别在人体胃肠中的分配、吸收 情况，以单层脂质体为固相萃取剂，提取负载有微量元素的单层脂质体，而后使用消解法消 解，并应用原子吸收光谱法、紫外可见分光光度法或电感耦合等离子质谱法测定微量元素 含量，依此给出基于药效角度的药物中微量元素配合物有效作用剂量的评价新方法，模拟 检测可被人体吸收的微量元素含量。本发明有助于微量元素配合物剂量标准的制订，并可 用于药物中微量元素配合物有效性、安全性、危险性评价。
具体实施例方式实施例1
按传统煎煮方法获得中药水煎液，称取红花粉末300g，放入600mL的烧杯中，每次 加超纯水400mL，加热至沸腾并保持微沸约lh，煎煮三次，合并三次煎煮液并加热浓缩，用
0.45 μ m滤膜过滤定容至IOOOmL,获得红花的水煎液IOOOmL 取红花的水煎液250mL加入容量瓶中，而后向其中加入模拟唾液5mL，在37°C下恒 温下振荡5min ；而后加150mL模拟胃液，继续在37°C下振荡2h，获得405mL体外胃仿生消 化液；在所获得的405mL红花水煎液体外胃仿生消化液中，加入195mL十二指肠模拟液 和75mL模拟胆汁，在37°C下继续振荡7h，取消化液用0. 45 μ m滤膜抽滤，获得675mL体外 胃肠全仿生消化液；将体外胃肠全仿生消化液在4°C下恒温保存。取0. 250mg蛋黄卵磷脂，将其溶于5mL氯仿中，获得蛋黄卵磷脂的氯仿溶液；将上 述溶液移入具塞的圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发lOmin，使之形成均勻的多 层脂质膜，而后向其中充入氮气以防止多层脂质膜被氧化；向其中加入上述步骤中获得的 全仿生消化液25mL，将其加入水浴恒温振荡器中，在37°C下振荡0. 5h，使多层脂质膜全部 进入全仿生消化液中，而后在-71 °C冷冻lh，在37°C下融化，反复冻融3次后，得到含单层脂 质体的冻融液，该单层脂质体中负载有微量元素；依次用孔径为0. 45 μ m和0. 22 μ m的滤膜 抽滤所获得的全部冻融液，从冻融液中分离获得负载有微量元素的单层脂质体(固体，粒 径为0. 3 0. 35 μ m)，冷冻干燥后得到1. 25mg负载有红花水煎液仿生消化液中微量元素的 单层脂质体；而后重复上述步骤，每次加全仿生消化液25mL，直到675mL的胃肠全仿生消化 液都制成冷冻干燥的单层脂质体，此时微量元素负载在单层脂质体上，即为单层脂质体结 合态微量元素。取上述制得的单层脂质体膜放置于聚氯乙烯消解罐中，每克单层脂质体膜依次加 入8. OmL浓HNO3和4. 0mL30% H2O2，于80°C的水浴中预处理20min，待黄烟散尽，再向每克 单层脂质体膜依次加入4. OmL浓HN03、2. OmL 30% H2O2，加盖安全膜后，旋紧外盖，放入控 制罐，将其置于MK-III型光纤压力自控密闭微波消解系统(上海新科微波溶样测试技术 研究所)的微波炉内的旋转盘上，调节压力档2档(IOatm)，5min;3档(15atm)，5min ;4档 (20atm)，5min，取出消解液，定容，于4°C下保存。应用原子吸收光谱法测定消解液中微量 元素含量，300g红花粉末中含有单层脂质体结合态的Fe为6. 852mg、Mn为1. 062mg, Zn为
1.446mg。红花水煎液胃、肠全仿生消化液单层脂质体结合态金属与美国日推荐量(RDA)、最 高日摄取量(UL)比较结果如表3中所示。表3红花水煎液胃、肠全仿生消化液单层脂质体结合态金属与美国日推荐量 (RDA)、最高日摄取量(UL)比较
权利要求
药物中可被人体吸收的微量元素含量的模拟检测方法，包括如下的步骤1)在一容器中加入含有微量元素的药物，而后加入模拟唾液，在36～38℃下振荡3～6分钟；2)而后向上述容器中加入模拟胃液，在36～38℃下继续振荡1～4小时，获得药物的体外胃仿生消化液；3)向步骤2中获得的体外胃仿生消化液中加入模拟十二指肠液和模拟胆汁，在36～38℃下继续振荡5～10小时，而后使用孔径为0.45μm的滤膜抽滤，获得体外胃肠全仿生消化液；4)取蛋黄卵磷脂，将其溶于氯仿中，获得蛋黄卵磷脂的氯仿溶液；将上述溶液移入具塞的圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上抽真空旋转蒸发，使之形成均匀的多层脂质膜，而后向其中充入氮气以防止多层脂质膜被氧化；向其中加入步骤3中获得的体外胃肠全仿生消化液，将其加入水浴恒温振荡器中，在36～38℃下振荡，使多层脂质膜全部进入全仿生消化液中，而后在 80～ 71℃冷冻1h，在36～38℃下融化，反复冻融3次后，得到含单层脂质体的冻融液，该单层脂质体中负载有微量元素；5)依次用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜抽滤冻融液，从溶液中分离获得负载有微量元素的粒径为0.3～0.35μm的单层脂质体；6)取上述制得的单层脂质体膜放置于聚氯乙烯消解罐中，每克单层脂质体膜依次加入7.5～8.5mL浓HNO3和3.5～4.5mL30％H2O2，于70～90℃的水浴中预处理20～30min，待黄烟散尽，再向每克单层脂质体膜依次加入3.5～4.5mL浓HNO3和1.5～2.5mL30％H2O2，加盖安全膜后，旋紧外盖后进入密闭微波消解系统消解，获得消解液，应用原子吸收光谱法、紫外可见分光光度法或电感耦合等离子质谱法对消解液中微量元素含量进行测定后获得。
2.根据权利要求1中所述的药物中可被人体吸收的微量元素含量的模拟检测方法，其 特征在于所使用的蛋黄卵磷脂与全仿生消化液的重量体积比为0. 005 0. 015g/1000mL。
3.根据权利要求2中所述的药物中可被人体吸收的微量元素含量的模拟检测方法，其 特征在于所使用的蛋黄卵磷脂与全仿生消化液的重量体积比优选为0. 01g/1000mL。
4.根据权利要求1或2或3中所述的药物中可被人体吸收的微量元素含量的模拟检测 方法，其特征在于还包括将步骤2中获得的体外胃仿生消化液用孔径为0. 45 μ m的滤膜过 滤的步骤。
5.根据权利要求1或2或3中所述的药物中可被人体吸收的微量元素含量的模拟检测 方法，其特征在于所述的药物为粉剂，每克粉剂中所依次加入的模拟唾液为2. 0 3. OmL, 模拟胃液为90 IlOmL,模拟十二指肠液为110 135mL，模拟胆汁为40 60mL。
6.根据权利要求1或2或3中所述的药物中可被人体吸收的微量元素含量的模拟检测 方法，其特征在于所述的药物为水煎液，每HiL水煎液中所依次加入的模拟唾液为0. 01 0. 03mL,模拟胃液为0. 5 0. ImL,模拟十二直肠液为0. 7 0. 9mL和模拟胆汁为0. 28 0.35mL。
全文摘要
本发明提供了一种药物中可被人体吸收的微量元素含量的模拟检测方法，它主要包括以下的步骤在不同消化阶段按照不同消化器官在一定时间内分泌出的消化液的成份和量，加入相应的仿生消化液(模拟唾液、模拟胃液、模拟十二指肠液和模拟胆汁)，再根据药物不同剂型在人体消化器官中的排空时间合理安排各个阶段的消化时间，获得全仿生消化液；而后以单层脂质体-水分配体系模拟全仿生消化液在人体胃肠中的分配、吸收情况，得到负载有微量元素的单层脂质体，而后使用消解法消解，并测定微量元素含量，依此给出基于药效角度的药物中微量元素配合物有效作用剂量的评价新方法，模拟检测可被人体吸收的微量元素含量。
文档编号G01N1/28GK101968480SQ200910112738
公开日2011年2月9日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者李顺兴, 郑凤英 申请人:漳州师范学院