专利名称：：一种能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种新型酶标记物的稀释液，用该稀释液配制酶标记物溶液，能有效的维护酶标记物在储存和使用中的稳定性，充分满足体外诊断试剂盒的质量要求。同时还涉及该酶标记物的稀释液的制备方法及其用途。
背景技术：
：利用标记抗原或抗体的免疫分析技术，是现代医学、生物学等领域广泛应用的一个体外超微量分析技术，可准确地测出10-9—10-15g的微量物质，从而解决了其他方法无法解决的问题，极大的推动了生物、医学领域的各项研究工作和临床检验的快速发展，为人类的科学进步和健康事业作出了非凡的贡献。这类分析方法自1959年yalow等人发明放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA)并在全世界范围内得到广泛推广以来(此技术的发明使yalow等人获诺贝尔奖)，现已开发了多种免疫分析方法，已得到实际应用的有酶联免疫分析(Enzymeimmunoassay,EIA)、化学发光免疫分析(Chemiluminescencei画noassay，CLIA)、日寸间分辨荧光免疫分析(Time-resolvedfluoroimraunoassay，TR-FIA)等，应用这些方法已开发出大量商用药盒(Kit),广泛应用于病毒学、内分泌学、肿瘤学、生殖生理学、血液学、遗传学等医学和生物学各科的临床和科研工作中，而且在饮食业，环保和刑事侦破中也发挥出十分重要的鉴定作用，其用途几乎涉及到人类生存和发展的各个重大领域。体外诊断试剂盒得以普及应用有赖于它的高质量，而稳定性则是重要的质量指标之一，它保证了试剂盒在规定的有效期内测定结果的准确性。有效期长则有利于推广应用。试剂盒是由检测所需要的各种试剂组成的，主要的有下面几种(1)标准物质对某种血清超微量物质进行定性测定，需要有标准参照物；进4行定量测定，还要有系列已知量的参照物作为标准。(2)HRP标记的标记物该物既参与免疫反应，又是促使化学发光物产生光信号的物质，是检测灵敏度的关键试剂之一。(3)固相试剂既参与免疫反应，又是反应后的分离剂。(4)化学发光底物溶液当免疫反应完成并分离后，加入此溶液，将产生可测光信号。(5)缓冲液免疫反应中调节溶液的pH值，并作为稀释液用。(6)洗液分离后用于洗去残留的未结合的标记物，以减小非特异光信号。由于试剂盒由多种试剂组成，其影响稳定性的因素很多，总的来说有环境因素和试剂本身的因素。本发明只涉及酶标记物溶液的稳定性，这里的稳定性主要是指酶标记物在储存期间活性的保存。这里的酶标记物是指辣根过氧化物酶(HRP)和抗体(Ab)的偶联物，它包含两部分，因而在免疫分析中起着两种作用，抗体与相应的抗原发生免疫结合，而酶则催化底物(过氧化氢)，稀释液的稳定作用就是保存抗体的免疫反应活性和酶的催化活性。辣根过氧化物酶是从辣根植物中提取的，其分子由主酶糖蛋白和辅酶正铁血红素K两部分组成，催化活性位点在辅酶上，而与抗体的偶联发生在主酶，故偶联不影响酶的催化活性。要保持催化活性稳定就要使辅酶不受损害。同时，主酶与抗体偶联，也需保证酶分子的完整性；辅酶对光尤其是紫外线敏感，要使在储存和免疫分析中避免光线的破坏。抗体是球蛋白，十分娇气，很多物理因素和化学因素都可引起蛋白质变性，在稀溶液状态下也易失去活性。目前不少体外诊断试剂盒产品常使用浓縮冷藏的酶标记物，浓縮的酶标记物相当稳定，常加入3040%甘油于-l(TC下保存，但这需要用户通过复溶或稀释的办法自行自备工作液，这不仅增加了用户的工作量，而且可能也会造成新的操作误差；同时通过简单的稀释后的酶标记物也只能现配现用，保存期限较短，给研究工作带来很大不便；由于在使用和保存过程中不可避免的需要将浓縮的酶标记物反复冻融，因此为了解决酶标记物稳定性问题，提高体外诊断试剂盒的质量，进行高稳定性的酶标记物溶液稀释液的研究很有必要。目前的酶标记物溶液稀释液大都包括缓冲液系统(如PBS磷酸盐缓冲液)和BSA(牛血清白蛋白)，或PBS-tween20等，这些稀释液只是基础的稀释液，还存在稀释后需要在12小时内马上用完的问题，对酶标记物并不能起到最大限度的保护作用，不方便实验的开展；同时还有部分体外诊断试剂盒中直接有酶标记物稀释液，但出于商业原因等并未给出其具体组成成分，给体外诊断试剂盒的广泛应用带来了不便。基于以上原因，本发明对能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液进行了一系列探索研究，以期为试剂盒商品化生产打下基础，同时为其它试剂盒的研制提供方法。
发明内容本发明的目的是提供一种能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液，这里的稳定性是指酶标记物在储存期间活性的保存。本发明的目的还在于提供一种能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液的制备方法及其用途。本发明的目的是通过以下技术方案实现的-一种能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液，其特征在于该稀释液由缓冲液、蛋白基质溶液、氨基酸溶液、糖溶液、特效添加剂和防腐剂组成，其中缓冲液选用磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、巴比妥缓冲液或硼酸盐缓冲液；蛋白基质溶液选用牛血清、羊血清或兔血清，或用牛血清白蛋白、酪蛋白、水解明胶、鱼皮胶、可溶性植物蛋白配制；氨基酸溶液选用复合氨基酸，由0.050.3M的甘氨酸、0.050.3M的赖氨酸和O.050.3M的精氨酸组成；糖溶液由质量百分比为0.12%的木糖、0.12%的葡糖胺和0.12%的蔗糖组成；特效添加剂由质量百分比为0.12%植物提取液、0.110%鼠血清、0.12%葡萄糖酸钾、0.050.1%辛酸钠和0.050.1%吐温-20组成；防腐剂PROCLIN300诊断试剂防腐剂或庆大霉素。本发明的目的还可以通过以下技术方案实现所述的植物提取液为芦荟提取液。所述的稀释液为酶标记单克隆抗体的稀释液，其中缓冲液选用0.010.1MPH7.2PBS磷酸盐生理盐水缓冲液；蛋白基质溶液选用质量百分比为550%小牛血清；氨基酸溶液选用复合氨基酸，由0.050.3M的甘氨酸、0.050.3M的赖氨酸和0.050.3M的精氨酸组成；糖溶液由质量百分比为0.12%的木糖、0.12%的葡糖胺和0.12%的蔗糖组成；特效添加剂由质量百分比为0.12%植物提取液、0.110%鼠血清、0.12%葡萄糖酸钾、0.050.1%辛酸钠和0.050.1%吐温-20组成；防腐剂质量百分比为0.050.1%PR0CLIN300诊断试剂防腐剂。本发明能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液的制备方法为首先在0.05Mra7.2PBS磷酸盐生理盐水缓冲液中加入0.05%PROCLIN300诊断试剂防腐剂和1%的木糖、葡糖胺和蔗糖及0.1M的甘氨酸、赖氨酸和精氨酸，溶解后混匀；再加入1%芦荟提取液、5%鼠血清、1%葡萄糖酸钾、0.05%辛酸钠和0.05%吐温-20;最后加进20%小牛血清，混匀即可。此外，本发明能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液具体用途为在乙肝'两对半，的检测中，用作酶标记物Anti-HBs-HRP、Anti-HBe-服P及Anti-HBc-HRP的稀释液，用以检测乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒e抗原、乙型肝炎病毒e抗体、乙型肝炎病毒核心抗体中的应用。本发明的能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液，是根据抗体蛋白和酶蛋白的特点而研究出的一种新型酶标记物的稀释液，用该稀释液配制酶标记物溶液，能有效的维护酶标记物在储存和使用中的稳定性，充分满足体外诊断试剂盒的质量要求。它7通过在现有技术的酶标记物稀释液中增加了新的有效成分，提高了保护酶标记物的能力，经试验本发明酶标记物稀释液，能使酶标记物更加稳定，在37"C下可保存一周以上。它可以直接用于制备体外诊断试剂盒，满足日益增大的体外诊断试剂盒的市场需求。具体实施例方式本发明能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液是由多种物质组成的透明溶液，组方中的主要内容是缓冲液系统，可用磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、巴比妥缓冲液、硼酸盐缓冲液等；蛋白基质溶液，可用适量浓度的牛血清、羊血清、兔血清等，也可用牛血清白蛋白、酪蛋白、水解明胶、鱼皮胶、可溶性植物蛋白等配制；氨基酸及糖溶液，用必要的氨基酸和糖配制；特效添加剂，含光敏抑制剂、标记物分子保护剂、环境维护剂等；防腐剂PR0CLIN300诊断试剂防腐剂、庆大霉素等。稀释液中采用的原料均为市售。实施例1酶标记单克隆抗体的稀释液缓冲液系统采用0.010.1MPH7.2PBS(磷酸盐生理盐水缓冲液)；蛋白基质溶液550%小牛血清；氨基酸及糖溶液复合氨基酸，主要是0.050.3M的甘氨酸、赖氨酸、精氨酸；0.12%的木糖、葡糖胺、蔗糖；特效添加剂0.12%植物提取液，0.110%鼠血清，0.12%葡萄糖酸钾，0.050.ly。辛酸钠；0.050.1%吐温-20;防腐剂0.050.1%PROCLIN300诊断试剂防腐剂；稀释液制备方法如下在0.05MPH7.2PBS中加入0.05%PR0CLIN300诊断试剂防腐剂和1%的木糖、1%的葡糖胺和1%的蔗糖及0.1M的甘氨酸、0.1M的赖氨酸和0.1M的精氨酸，溶解后混匀，再加1%芦荟提取液，5%鼠血清，1%葡萄糖酸钾，0.05%辛酸钠和0.05%吐温-20;最后加进20%小牛血清，混匀即可。其中芦荟提取液可以由市购的芦荟素结晶配制，鼠血清也可以市购。该稀释液在乙肝'两对半，的检测中，可用作酶标记物Anti-HBs-HRP、Anti-HBe-HRP及Anti-HBc-HRP的稀释液，用以检测乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒e抗原、乙型肝炎病毒e抗体、乙型肝炎病毒核心抗体。把稀释液配方中的鼠血清变换一下可用作酶标记物HBsAg-朋P的稀释液，用以检测乙型肝炎病毒表面抗体。该稀释液原则上也可直接用于其它单克隆抗体的酶标记物，稍作变换也可用作其它酶标记物的稀释液。此外，体外诊断试剂社会需要量大，仅国内一年就有几十亿的市场，而本发明的酶标记物稀释液可直接用于制备体外诊断试剂盒，具有较大的社会效益和经济效益。本发明的酶标记物的稀释液中，增加了新的有效成分，提高了保护酶标记物活性的能力；能使酶标记物更加稳定，经试验在37'C下可保存一周以上。以Anti-HBs-服P为例，用缓冲液加BSA等的稀释液(1)和本发明的稀释液(2)配制，其稳定性相差显著，见下表。不同稀释液的标记物的稳定性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>说明根据《中国生物制品检定规程》(2000年版)的规定，采用加速破坏试验来考核稳定性，即将其在37。C下放置3天，相当于28'C下储存6个月。检验时，将两种稀释液配制的标记物封好，放入37。C恒温培养箱中，连续保温7天，从第3天起每天检测其活性。表中所列为RLU(相对发光值)，与保温前相比，此值下降的越多，说明稳定性越差。权利要求1、一种能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液，其特征在于该稀释液由缓冲液、蛋白基质溶液、氨基酸溶液、糖溶液、特效添加剂和防腐剂组成，其中缓冲液选用磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、巴比妥缓冲液或硼酸盐缓冲液；蛋白基质溶液选用牛血清、羊血清或兔血清，或用牛血清白蛋白、酪蛋白、水解明胶、鱼皮胶、可溶性植物蛋白配制；氨基酸溶液选用复合氨基酸，由0.05～0.3M的甘氨酸、0.05～0.3M的赖氨酸和0.05～0.3M的精氨酸组成；糖溶液由质量百分比为0.1～2％的木糖、0.1～2％的葡糖胺和0.1～2％的蔗糖组成；特效添加剂由质量百分比为0.1～2％植物提取液、0.1～10％鼠血清、0.1～2％葡萄糖酸钾、0.05～0.1％辛酸钠和0.05～0.1％吐温-20组成；防腐剂PROCLIN300诊断试剂防腐剂或庆大霉素。2、根据权利要求1所述能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液，其特征在于.-所述的植物提取液为芦荟提取液。3、根据权利要求1所述能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液，其特征在于所述的稀释液为酶标记单克隆抗体的稀释液，其中.-缓冲液选用0.010.1MPH7.2PBS磷酸盐生理盐水缓冲液；蛋白基质溶液选用质量百分比为550%小牛血清；氨基酸溶液选用复合氨基酸，由0.050.3M的甘氨酸、0.050.3M的赖氨酸和0.050.3M的精氨酸组成；糖溶液由质量百分比为0.12%的木糖、0.12%的葡糖胺和0.12%的蔗糖组成；特效添加剂由质量百分比为0.12%植物提取液、0.110%鼠血清、0.12%葡萄糖酸钾、0.050.1%辛酸钠和0.050.1%吐温-20组成；防腐剂质量百分比为0.050.1%PR0CLIN300诊断试剂防腐剂。4、根据权利要求3所述能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液，其特征在于所述的植物提取液为芦荟提取液。5、根据权利要求3或4所述能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液，其特征在于其中缓冲液选用0.05MPH7.2PBS磷酸盐生理盐水缓冲液；蛋白基质溶液选用质量百分比为20%小牛血清；氨基酸溶液选用复合氨基酸，由0.1M的甘氨酸、0.1M的赖氨酸和0.1M的精氨酸组成；糖溶液由质量百分比为1%的木糖、1%的葡糖胺和1%的蔗糖组成；特效添加剂由质量百分比为1%芦荟提取液、5%鼠血清、1%葡萄糖酸钾、0.05%辛酸钠和0.05°/。吐温-20组成；防腐剂质量百分比为0.05%PR0CLIN300诊断试剂防腐剂。6、权利要求5所述的能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液的制备方法，其特征在于首先在0.05MPH7.2PBS磷酸盐生理盐水缓冲液中加入0.05%PR0CLIN300诊断试剂防腐剂和1%的木糖、葡糖胺和蔗糖及0.1M的甘氨酸、赖氨酸和精氨酸，溶解后混匀；再加入1%产荟提取液、5%鼠血清、1%葡萄糖酸钾、0.05%辛酸钠和0.05%吐温-20;最后加进20。/。小牛血清，混匀即可。7、权利要求5所述的能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液在乙肝'两对半，的检测中，用作酶标记物Anti-HBs-服P、Anti-HBe-HRP及Anti-HBc-HRP的稀释液，用以检测乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒e抗原、乙型肝炎病毒e抗体、乙型肝炎病毒核心抗体中的应用。全文摘要本发明涉及一种能够维护酶标记物溶液高稳定性的稀释液，同时还涉及该稀释液的制备方法及其用途。该稀释液由缓冲液、蛋白基质溶液、氨基酸溶液、糖溶液、特效添加剂和防腐剂组成。本发明是根据抗体蛋白和酶蛋白的特点而研究出的一种新型酶标记物的稀释液，用该稀释液配制酶标记物溶液，能有效的维护酶标记物在储存和使用中的稳定性，经试验本发明酶标记物稀释液，在37℃下可保存一周以上，可充分满足体外诊断试剂盒的质量要求。它可以直接用于制备体外诊断试剂盒，满足日益增大的体外诊断试剂盒的市场需求。文档编号G01N33/576GK101561432SQ20091014363公开日2009年10月21日申请日期2009年5月27日优先权日2009年5月27日发明者高淑舫申请人:福建省洪诚生物药业有限公司