专利名称：：恩诺沙星药物的同步荧光测定方法
技术领域：
：本发明涉及恩诺沙星药物的检测方法，具体涉及一种恩诺沙星药物的同步荧光测定方法，属于药物分析
技术领域：
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背景技术：
：恩诺沙星(ENRX)，其化学名为1-环丙基-7-(4_乙基哌嗪_1_基)_6_氟_1，4_二氢_4-氧代_3-喹啉酸，是人工合成的含有4-喹诺酮母核的抗菌药物。恩诺沙星作为动物专用的氟喹诺酮类药物，主要用于治疗畜禽细菌和支原体感染。由于恩诺沙星具有抗菌谱广、杀菌活性强、毒副作用小与其它抗菌药无交叉耐药性且敏感微生物的MIC较低等优点，被广泛应用于各种动物感染性疾病的预防和治疗，因此探索一种快速、灵敏检测恩诺沙星药物的分析方法，对于动物食品中该类药物的残留检测以及它的药代动力学和药效动力学研究都具有重要的意义。关于恩诺沙星药物的测定方法，现有的报道中主要有紫外分光光度法、高效液相色谱、流动注射-化学发光法、酶联接免疫吸附剂(ELISA)快速测定法以及荧光光度法，其中关于ELISA快速测定法的报道较多。比如，申请号为200610007255.6的中国发明专利申请中公开了一种检测恩诺沙星的方法及其专用酶联免疫试剂盒。该检测恩诺沙星的酶联免疫试剂盒，包括恩诺沙星特异性抗体及包被有包被原的酶标板和酶标记物、恩诺沙星标准品溶液、底物显示液、终止液、浓縮复溶液；所述包被原为恩诺沙星抗抗体；所述酶标记物为酶标恩诺沙星抗原。该方法操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的定性、定量检测动物组织如动物组织、血清血浆、水产品等样品中恩诺沙星残留量。荧光光度法因其具有灵敏度高、快速的优点也被广泛应用于该类药物的检测，但是荧光法在分析含有多种荧光物质的组分时，特别是存在波段重叠的物质时，会对目标产物造成干扰，无法得到令人满意的结果。采用荧光光度法测定恩诺沙星也会存在上述问题，造成结果不准确。
发明内容本发明提供了一种快速、灵敏的恩诺沙星药物的同步荧光测定方法，利用稀土钇离子(Y3+)选择性增强恩诺沙星药物发出的荧光，结合同步荧光检测技术，消除其它会发射荧光的物质的干扰，实现样品中痕量恩诺沙星药物的测定。—种恩诺沙星药物的同步荧光测定方法，包括以下步骤(1)配制Y"贮备液将氧化钇溶于盐酸中，加热蒸发至近干，加水溶解并定容，配制Y3+浓度为1.0X10—31.0X10—'mol/L的Y3+贮备液；(2)将0.22.0mLpH=5.86.8、六亚甲基四胺浓度为0.52.0mol/L的六亚甲基四胺(HMA)-盐酸缓冲溶液，O.52.0mLY3+贮备液和待测样品混合，加水定容至lOmL，摇匀后在室温放置590min，得到Y3+浓度为5X10—52X10—4mol/L的供试液；(3)将供试液置于同步荧光分析仪的lcm石英比色池中，设定激发波长与发射波长的波长差AA为80lOOnm进行同步荧光扫描，扫描速度为3001000nm/min，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为515nm，测定荧光强度。作为优选，所述的恩诺沙星药物的同步荧光测定方法，包括以下步骤(1)配制Y"贮备液将氧化钇溶于盐酸中，加热蒸发至近干，加水溶解并定容，配制Y3+浓度为1.0X10—3mol/L的Y3+贮备液；(2)将0.22.OmLpH=6.3、六亚甲基四胺浓度为1.Omol/L的六亚甲基四胺-盐酸缓冲溶液，0.52.OmLf+贮备液和待测样品混合，加水定容至10mL，摇匀后在室温放置20min，得到Y3+浓度为1.0X10—4mol/L的供试液;(3)将供试液置于同步荧光分析仪的lcm石英比色池中，设定激发波长与发射波长的波长差AA为90nm进行同步荧光扫描，扫描速度为500nm/min，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为10nm，测定荧光强度。所述的待测样品若选用血清样品，需经乙腈沉淀去除蛋白质后用于测定。由于血清中含有大量的蛋白质，蛋白质能与恩诺沙星发生荧光猝灭反应，并且蛋白质本身也会发出荧光对测定产生干扰，因此当待测样品为含恩诺沙星的血清时，必须先去除血清中的大部分蛋白质以消除干扰，可采用现有技术去除血清中的大部分蛋白质，也可通过乙腈沉淀后离心分离出大部分蛋白质。此外，血清中还含有大量不能通过乙腈沉淀去除的有机物，其中有些组分也会发射荧光，对测定产生干扰。本发明通过研究多种稀土离子和金属离子对恩诺沙星荧光强度的影响，发现稀土钇离子(Y3+)能使恩诺沙星药物发出的荧光增强，可以提高荧光体系的检测灵敏度。同时引入同步荧光技术，消除血清用乙腈处理后残余的有机物的干扰，从而实现血清样品中痕量恩诺沙星药物的测定。pH的影响pH<5.8时，随pH的增大，测试体系的荧光强度增强，当pH=5.86.5时，测试体系的荧光强度达到最大并保持稳定，当pH>6.5时随pH的增大荧光强度逐渐变弱，因此，本发明选用pH=5.86.8的缓冲溶液，优选pH=6.3的缓冲溶液，以达到好的检测效果。由于常规的缓冲溶液如磷酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液等有熄灭荧光的作用，本发明选用HMA-盐酸缓冲溶液来调节供试液的PH值，使供试液pH值趋于稳定，且不会影响测试结果。所述的HMA-盐酸缓冲溶液的配制将HMA溶于水中，用盐酸调节pH值即可。供试液中￥3+浓度的影响Y3+浓度低于0.8X10—iol/L时，测试体系的荧光强度随着^+浓度增加而显著增强，当Y"浓度达到1.0X10—iol/L时，体系荧光强度达到最大并保持稳定，因此，本发明保证供试液中Y3+浓度为5X10—52X10—4mol/L，以达到好的检测效果。放置时间的影响配制供试液时需在摇匀后放置一定时间，本发明发现放置时间>5min，荧光强度就会一直保持稳定，稳定时间至少为3h，因此，本发明将供试液放置590min，以达到好的检测效果。线性关系的确定取恩诺沙星标准品溶于水配制一系列由低浓度到高浓度的ENRX标准溶液，按所述方法加入与供试液相同的其它试剂并在相同的同步荧光检测条件下分别测定荧光强度，以荧光强度为纵坐标、恩诺沙星的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，确定恩诺沙星的浓度为1.0X10—92.0X10—Smol/L时，荧光强度与ENRX浓度的线性关系，根4据线性关系得出供试液中恩诺沙星的浓度。本发明方法检测限的确定选择荧光强度接近空白的ENRX标准溶液，即ENRX浓度为1.0X10—9mol/L的ENRX标准溶液，在本发明优选的最佳实验条件下测定荧光强度，连续测定11次，按近似检测限的计算方法(3s/x)Xc进行计算，得到其检测限为3.OX10—"molL—1(S/N=3);其中s表示由11次测得的荧光强度计算得到的标准偏差，x表示11次测得的荧光强度的平均值，c表示选定的ENRX标准溶液的浓度，即为1.OX10—9mol/L。金属离子干扰试验在浓度为1.0X10—7mol/L的ENRX标准品溶液中添加金属离子，采用本发明方法进行检测，考察多种常见金属离子对Y"-ENRX体系荧光强度的影B向，结果如表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>备注表中AIf表示荧光偏差，"+"表示增强，"-"表示减弱。由表l可见，大部分金属离子需要达到很高的浓度才会对^+-￡服乂体系产生干扰，表明本发明方法具有很好的选择性。药物干扰试验在浓度为1.0X10—7mol/L的ENRX标准品溶液中添加常与ENRX配伍使用的药物，采用本发明方法进行检测，考察几种常与ENRX配伍使用的药物对Y3+-ENRX体系荧光强度的影响，结果如表2所示。表2其它药物对Y3+_ENRX体系荧光强度的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>备注表中AIf表示荧光偏差，"+"表示增强，"-"表示减弱。由表2可见，常用的配伍药物对ENRX的测定干扰较小；在相同浓度下，不同氟喹诺酮类药物的干扰差异较大，其中氧氟沙星和依诺沙星对体系荧光强度影响不大；而环丙沙星和诺氟沙星则干扰较大，影响测定。本发明所用的试剂均选用分析纯，所用的水均选用纯水或蒸馏水。本发明具有以下有益效果1.通过加入f+，使ENRX的荧光强度提高了3倍，提高了检测的灵敏度，检测限达3.0X10—10mol/L。2.利用f+对ENRX的荧光增强作用，结合同步荧光检测技术，消除了血清用乙腈处理后残余的有机物的干扰，从而实现了血清样品中痕量恩诺沙星药物的测定。3.本发明方法简单、快速、准确，具有高的灵敏度与好的选择性，应用范围广泛，是ENRX药物测定的理想方法。图1为本发明实施例1检测的同步荧光光谱；其中，l表示HMA-Y"体系，2表示HMA-ENRX体系，3表示HMA_Y3+-ENRX体系；图2为本发明实施例1中的标准工作曲线；图3为本发明实施例3检测的人血清同步荧光光谱；图4为对比例1中检测的人血清普通荧光光谱；图5为本发明实施例3检测的鸡血清同步荧光光谱；图6为对比例1中检测的鸡血清普通荧光光谱；图3和图4中，1表示HMA-ENRX-Y3+-人血清体系，2表示HMA-ENRX_Y3+体系，3表示人血清；图5和图6中，1表示HMA-ENRX-Y3+-鸡血清体系，2表示HMA-ENRX_Y3+体系，3表示鸡血清。具体实施方式实施例1于一25mL比色管中依次加入1.OmLpH=6.3、浓度为1.Omol/L的薩-盐酸缓冲溶液和1.OmL浓度为1.0X10—^Ql/L的f+贮备液，用纯水定容至lOmL后摇匀，室温放置20min后得到Y3+浓度为1.0X10—4mol/L的HMA_Y3+体系。于另一25mL比色管中依次加入1.OmLpH=6.3、浓度为1.Omol/L的薩-盐酸缓冲溶液和l.OmL1.0X10—6mol/LENRX标准溶液，，用纯水定容至lOmL后摇匀，室温放置20min后得到不含Y3+的HMA-ENRX体系。于另一25mL比色管中依次加入1.OmLpH=6.3、浓度为1.Omol/L的薩-盐酸缓冲溶液、1.OmL1.0X10—3mol/L的Y3+贮备液和1.OmL1.0X10—6mol/LENRX标准溶液，用纯水定容至10mL后摇匀，室温放置20min后得到Y3+浓度为1.0X10—4mol/L的HMA_Y3+-ENRX体系。将HMA-Y3+体系、HMA-ENRX体系和HMA_Y3+_ENRX体系分别置于同步荧光分析仪的lcm石英比色池中，设定激发波长与发射波长的波长差AA为90nm进行同步荧光扫描，扫描速度为500nm/min，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为10nm，分别测定三者的荧光强度，同步荧光光谱如图l，可见Y3+能够显著增强ENRX的荧光强度。根据标准工作曲线的绘制方法，取恩诺沙星标准品溶于水配制一系列由低浓度到高浓度的ENRX标准溶液:5.OX10—8mol/L，1.0X10—7mol/L，2.0X10—7mol/L，5.0X10—7mol/L，1.0X10—6mol/L，2.0X10—6mol/L，5.0X10—6mol/L的ENRX标准溶液，分别加入与HMA-Y3+-ENRX体系相同的HMA-盐酸缓冲溶液和Y3+贮备液进行处理，处理方法同HMA-Y3+-ENRX体系，并在上述同步荧光检测条件下分别测定荧光强度，以荧光强度为纵坐标、恩诺沙星的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，如图2。除了将1.OmL1.0X10—6mol/LENRX标准溶液替换成1.OmL浙江新昌县古峰兽药有限公司生产的恩诺沙星注射液外，其它操作同HMA-Y"-ENRX体系的处理方法，并在上述同步荧光检测条件下测定体系的荧光强度，通过图2的标准曲线得出恩诺沙星注射液中的ENRX的浓度，进一步计算ENRX的含量(以质量计)；同时采用现有的铽离子(Tb3+)荧光探针法对浙江新昌县古峰兽药有限公司生产的恩诺沙星注射液中的恩诺沙星含量(以质量计)进行测定。测定结果见表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从表4和表5样品的加标回收率来看，回收率都在96.5102.0%，回收率良好，表明该检测方法抗干扰力较好，方法可靠，准确度高。对比例1除了采用普通荧光检测，设定激发波长(ex)为274nm，激发与发射狭缝宽度均为10nm外，其余操作均同实施例2，对鸡血清和人血清进行荧光检测，荧光光谱如图4和图6。对比图3和图4，图5和图6，发现同步荧光检测方法抗干扰能力很好，方法可靠，准确度高，灵敏度高。权利要求一种恩诺沙星药物的同步荧光测定方法，其特征在于，包括以下步骤(1)配制Y3+贮备液将氧化钇溶于盐酸中，加热蒸发至近干，加水溶解并定容，配制Y3+浓度为1.0×10-3～1.0×10-1mol/L的Y3+贮备液；(2)将0.2～2.0mLpH＝5.8～6.8、六亚甲基四胺浓度为0.5～2.0mol/L的六亚甲基四胺-盐酸缓冲溶液，0.5～2.0mLY3+贮备液和待测样品混合，加水定容至10mL，摇匀后在室温放置5～90min，得到Y3+浓度为5×10-5～2×10-4mol/L的供试液；(3)将供试液置于同步荧光分析仪的1cm石英比色池中，设定激发波长与发射波长的波长差Δλ为80～100nm进行同步荧光扫描，扫描速度为300～1000nm/min，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为5～15nm，测定荧光强度。2.根据权利要求1所述的恩诺沙星药物的同步荧光测定方法，其特征在于，包括以下步骤(1)配制Y"贮备液将氧化钇溶于盐酸中，加热蒸发至近干，加水溶解并定容，配制Y3+浓度为1.OX10—3mol/L的Y3+贮备液；(2)将O.22.0mLpH=6.3、六亚甲基四胺浓度为1.Omol/L的六亚甲基四胺-盐酸缓冲溶液，0.52.OmLY3+贮备液和待测样品混合，加水定容至10mL，摇匀后在室温放置20min，得到Y3+浓度为1.0X10—4mol/L的供试液;(3)将供试液置于同步荧光分析仪的lcm石英比色池中，设定激发波长与发射波长的波长差AA为90nm进行同步荧光扫描，扫描速度为500nm/min，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为10nm，测定荧光强度。3.根据权利要求1或2所述的恩诺沙星药物的同步荧光测定方法，其特征在于，所述的待测样品为经乙腈沉淀去除蛋白质的血清。全文摘要本发明公开了一种恩诺沙星药物的同步荧光测定方法，包括将0.2～2.0mLpH＝5.8～6.8、浓度为0.5～2.0mol/L的六亚甲基四胺-盐酸缓冲溶液，0.5～2.0mLY3+贮备液和待测样品混合，加水定容至10mL，摇匀后在室温放置5～90min，配制Y3+浓度为5×10-5～2×10-4mol/L的供试液；将供试液置于同步荧光分析仪中，测定荧光值。该方法采用稀土钇离子选择性增强恩诺沙星药物发出的荧光，结合同步荧光检测技术，消除其它会发射荧光的物质的干扰，实现样品中痕量恩诺沙星药物的检测，操作简便，快捷、灵敏，应用范围广泛。文档编号G01N21/64GK101694465SQ200910154020公开日2010年4月14日申请日期2009年10月22日优先权日2009年10月22日发明者卓霞军,童裳伦申请人:浙江大学;