专利名称：检测单细胞和群细胞行为的多尺度集成细胞阻抗传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于细胞的检测的领域，特别涉及检测细胞行为的阻抗传感器。
背景技术：
生物电子学的兴起为传统的检测细胞和生物大分子生物学行为提供了新的有效 的方法。传统生物检测方法包括一些生化和免疫学的方法，例如用荧光染料标记，可以检测 多种特征蛋白。用MTT/XTT比色法测定利用代谢正常细胞的线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将 四唑盐类物质(如MTT、XTT、WST-1等)还原为紫色的结晶状的物质的原理来反映细胞的活 性。细胞活性和增殖能力越强紫色结晶的物质越多，然后通过酶标仪读取0D值完成测试。 然而这类生物化学和免疫方法都是终点测试，不能连续，实时监测，需要进行标记，无法动 态反应细胞的中间过程状态。生物电子学的方法能够实时监测细胞生理状态，为实验提供 了更丰富的信息。 一种典型的应用是将细胞培养在微电极上，并测量细胞状态及外部剌激 对细胞的影响。 群体细胞所反映出的群体行为是众多单个细胞行为的平均， 一方面，群体细胞信 号更能准确反映真实的群体行为，能够一定程度抑制群体细胞培养中异质性造成的影响， 使信号更为稳定；另一方面，群体细胞无法精确反映单个细胞行为，尤其当群体细胞中存 在某些有特殊价值的细胞个体，对单细胞测试需要排除来自细胞之间相互影响所产生的信 号。因此，需要对个体细胞以及群体细胞多种参数同时测试才能更好的将细胞行为与外在 剌激及胞内变化关联起来。 国内外已有一些关于利用生物电阻抗技术来评价群体培养的细胞行为研究的描 述。例如，在2005年10月12日公开的公开号为CN1681938的中国专利里，以及在该专利 里包含的相关报道所描述的多种利用定位于绝缘基底的电极阵列来检测电极表面的细胞 或分子的装置，它能反映整个培养腔内的整体细胞响应，但无法精确测量某个细胞的行为。 因此急需一种能用于同时研究群体细胞以及单个细胞行为的细胞阻抗分析系统，以对单细 胞及群体细胞响应差异对比分析来更深入了解全面的细胞行为。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测单细胞和群细胞行为的多尺度集成细胞阻抗传 感器，可用于同时检测单细胞和群细胞行为。 为实现本发明目的，本发明所采取的技术方案是该检测单细胞和群细胞行为的 多尺度集成细胞阻抗传感器主要包括PCB板、绝缘基片、四个叉指电极阵列、连接垫、微电 极、培养容器和顶盖，所述四个叉指电极阵列对称地分布在绝缘基片上，在绝缘基片的边缘 位置分布有连接垫，每个叉指电极阵列的总线分别通过引线与相应的连接垫连接，所述微 电极相应地分布在各叉指电极阵列的总线的至少一个开口处，各微电极通过引线与相应的 连接垫连接；所述培养容器设有分别与四个叉指电极阵列所在的区域相匹配的四个培养 腔；顶盖设有分别与四个培养腔相匹配的四个腔盖；所述绝缘基片上的连接垫与PCB板连接，培养容器的四个培养腔分别对应地固定在四个叉指电极阵列所在的区域上，四个腔盖 分别对应地置于四个培养腔内。 进一步地，本发明所述绝缘基片呈矩形，各叉指电极阵列的总线的一个开口与所 述矩形的绝缘基片的相应直角相对。 进一步地，本发明所述微电极仅分布在各叉指电极阵列的总线的与所述矩形的绝 缘基片的相应直角相对的开口处。 与现有技术相比，本发明具有的优点是利用兼具群体细胞阻抗测试功能的叉指 电极作为参考电极，创造性的解决了单细胞阻抗检测中的参考电极集成问题，提高了传感 器的集成程度，使之能用于同时、无损、动态、实时监测群体细胞和单细胞的行为。该传感器 在检测群体细胞对外部剌激作用下的群体平均行为的同时，具有单细胞分辨率的微电极能 在排除细胞之间相互作用干扰下深入揭示单细胞的行为。
下面结合附图和实例对本发明作进一步说明。
图1是本发明绝缘基片上的电极分布示意图；
图2是本发明传感器结构分解示意图； 图3是用于连接绝缘基片和PCB板的金属夹子的结构示意图，其中，图3中的右图 是左图的右视图； 图4(a)是单细胞在微电极上的阻抗模型；
图4(b)是多细胞在叉指电极上的阻抗模型； 图5是群细胞在本发明的叉指电极表面贴附前后测得的阻抗和相位曲线图；
图6是单个细胞在本发明的微电极表面贴附前后所测得的阻抗和相位曲线图；
图7是本发明传感器的叉指电极连续动态监测细胞生长贴附过程的细胞阻抗变 化曲线图； 图8是本发明传感器的微电极连续动态监测细胞生长贴附过程的细胞阻抗变化 曲线图。
具体实施例方式
本发明提供了一种多尺度集成细胞阻抗传感器，通过同时测量由单细胞导致的阻 抗变化和群体细胞的平均行为来检测电极表面的细胞。该传感器包括PCB板11、绝缘基片 1、四个叉指电极阵列4、连接垫2、微电极5、培养容器10和顶盖9，四个叉指电极阵列4对 称地分布在绝缘基片1上，在绝缘基片1的边缘位置分布有连接垫2，每个叉指电极阵列的 总线3分别通过相应的引线7与相应的连接垫2连接，微电极5相应地分布在各叉指电极 阵列4的总线的至少一个开口 8处，各微电极通过相应的引线7与相应的连接垫2连接；培 养容器10设有分别与四个叉指电极阵列所在的区域6相匹配的四个培养腔101 ;顶盖9设 有分别与四个培养腔101相匹配的四个腔盖91 ;绝缘基片1的连接垫2与PCB板连接，培 养容器10的四个培养腔101分别对应地固定在四个叉指电极阵列所在的区域6上，四个腔 盖91分别对应地置于四个培养腔101内。 如图1所示，交替排列的多个电极分别与两根总线3相连形成叉指电极阵列4，两根总线3互不相连，两根总线的端部之间相应地形成两个开口 8。四个叉指电极阵列4对称 地分布在绝缘基片1上。叉指电极阵列4的单个电极的宽度以及相邻两个电极的间距会影 响测试的灵敏度和一致性。在本发明的一种优选实施方式中，选取叉指电极阵列4中的各 电极的宽度为40微米，相邻两个电极间距为40微米，既能提高阻抗检测灵敏度，又能使细 胞阻抗变化的响应频段处于较低频。如图5所示，细胞贴附后阻抗变化最明显的频段一般 在500kHz频率以下，降低了对测试系统的频率范围要求。 微电极5的大小与细胞大小相当，用于测试贴附在其表面的单个细胞阻抗。在图 l所示的一个优选实施方式中，有八个微电极，其中包括四个大小相同的直径为50微米的 微电极和另四个大小相同的直径为20微米的微电极，均分布于叉指电极阵列4的总线3的 其中一个开口 8处。作为本发明的另一种实施方式，也可以同时在叉指电极阵列4的总线 3的另一个开口 8处分布有微电极。每个微电极5分别通过相应的引线7与分布在绝缘基 片1的边缘位置的一个连接垫2相连，并且各引线7之间互不交错。在所述的实施方式中， 两种不同大小的微电极5可用于不同种类的细胞研究，并且该布局可最大程度减小微电极 5的引线7的长度，从而减小了引线带来的阻抗和干扰。并且该设计中，利用叉指电极作为 参考电极，去除了传统的大面积的参考电极，大大提高了传感器的集成程度，并且叉指电极 能减小细胞或溶液对参考电极的影响，提高了作为参考电极的稳定性。
在培养容器10内设有四个通孔作为培养腔101，培养容器10垂直粘结在绝缘基片 1上，使四个培养腔101的底部正好与叉指电极阵列4所在的区域6重合，由此形成4个不 漏液的彼此独立的培养腔101。每个叉指电极阵列4所在的区域6包含该叉指电极阵列4 和位于该叉指电极阵列4的总线3的开口 8处的微电极5。在一个优选的方式中，培养容器 10采用Teflon材料。顶盖9上设有四个凸起作为四个培养腔101的腔盖，该四个腔盖91 分别与四个培养腔101相匹配，使得当四个腔盖91分别对应地置于四个培养腔101内时可 防止测试过程中细菌污染和溶液蒸发。 如图l所示，连接垫2用于使绝缘基片l上的各电极与外部测试系统连接，每个连 接垫2可用一个如图3所示的金属夹子的咬合端13咬合，该金属夹子的另一端焊接于PCB 电路板11上，从而与外部测试系统相连。在一个优选的实施方式中，连接垫2的长度与宽 度须与金属夹子大小匹配，并且金属夹子的咬合端13的口径须略小于绝缘基片1的厚度， 在本实施方式中，绝缘基片1的厚度为500微米，金属夹子的咬合端13的口径为450微米。
传感器的外部测试系统包括一个多通道阻抗分析仪，它们分别与PCB电路板11的 全部或多个焊盘12相连，从而监测叉指电极阵列4和微电极5上的阻抗变化。
单细胞与多细胞检测结果通过基于图4的阻抗等效电路，可以得出细胞贴附时间 隙阻抗、细胞连接以及细胞膜阻抗。 本发明是在利用微加工技术制作的器件上进行细胞培养，在绝缘基片1的相应电 极上施加一个微弱的正弦激励，细胞贴附对电极表面电场会有阻碍作用，当细胞生长、分裂 增殖、凋亡以及受到药物作用引起相应的形态变化时，经过细胞调制的微弱的正弦激励便 可以间接反映细胞的生物变化。单细胞贴附在微电极上，使电极与溶液无直接接触，则电极 的阻抗变化大部分反应了细胞膜及细胞内部状态的改变，比如，对细胞基因的改变从而改 变细胞骨架蛋白的表达，引起细胞形态的变化，又如，线粒体酶活性改变引起细胞代谢水平 的改变也同样能反应在细胞阻抗的变化上；另外，当细胞之间相互作用形成特定连接时，它们的性质会随之改变，利用叉指电极可以有效的研究群体细胞的行为特征。本发明传感器 的制备方法 选择4英寸Co皿ing 7740玻璃作绝缘基底1，经过标准工艺清洗甩干。采用磁控 溅射的方法，首先沉积20nm厚的黏附层，用于该目的的优选材料包括镍、铬、ITO、钨、钛以 及这些金属的合金。然后采用真空蒸发或磁控溅射的方法，正面沉积300nm厚的电极层，该 优选材料的例子包括金、钼、铂黑、钯和银。并用保护膜(抗光蚀剂PR)覆盖在金层上。然 后，利用照相平版印刷术将保护膜光刻出图案，然后利用保护膜作为金层掩膜湿法腐蚀要 求的电极图案。采用PECVD方法沉积100nm/500nm/100nm厚的Si3N4/Si02/Si3N4作为绝缘 层。然后，利用照相平版印刷术将保护膜光刻出图案，然后利用保护膜作为绝缘层掩膜反 应离子刻蚀法(RIE)刻蚀出要求的绝缘层图案。最后将保护膜洗去，划片得到独立的传感 器芯片。用无毒的环氧树脂将具有四个独立腔室的有机玻璃10对应电极区域6粘到传感 器芯片上，形成四个独立的细胞生长空间，然后将金属夹子对应传感器芯片边缘的连接垫2 啮合并把另一端焊接于一块电路板10上完成最后的制作。
本发明传感器对细胞行为的测试
(1)阻抗和相位测试 将封装好的传感器用酒精浸泡半个小时，然后用去离子水清洗干净，用氮气吹干。 向每个培养腔101中加入100 ii L细胞培养液，将其置于培养箱内静置5分钟，然后开始进 行频谱扫描测试，测试频率范围为从lkHz到lMHz，每十倍频取5个频率点，正弦交流电压 幅值为峰峰值50mV.单次频率扫描可在五分钟内完成.对未加入细胞的芯片进行频率扫描 的结果记为Z。.然后加入100 ii L密度为2万/mL 3T3细胞悬液，将传感器置于培养箱培养 10小时后，取出再次进行频谱扫描.图5和图6分别为相同条件下测得的群细胞和单细胞 的阻抗和相位曲线图，它们具有不同的特征，结合图4所示的模型可以综合分析出细胞膜 和膜间阻抗以及细胞内部生理状况的改变。
(2)细胞动态贴附监测实验 于传感器的培养腔101中加入100 ii L细胞培养液，将其置于培养箱内静置5分 钟，然后分别加入100ii L浓度为2万/mL、1万/mL、5000/mL、2500/mL的细胞悬液于细胞的 培养腔101中，在频率为500kHz、幅值为峰峰值50mV的正弦激励下对芯片阻抗进行长时程 监测。图7和图8分别为相同条件下测得的群细胞和单细胞的动态贴附过程。
权利要求
一种检测单细胞和群细胞行为的多尺度集成细胞阻抗传感器，其特征是包括PCB板(11)、绝缘基片(1)、四个叉指电极阵列(4)、连接垫(2)、微电极(5)、培养容器(10)和顶盖(9)，所述四个叉指电极阵列(4)对称地分布在绝缘基片(1)上，在绝缘基片(1)的边缘位置分布有连接垫(2)，每个叉指电极阵列的总线(3)分别通过引线与相应的连接垫(2)连接，所述微电极(5)相应地分布在各叉指电极阵列(4)的总线的至少一个开口(8)处，各微电极(5)通过引线与相应的连接垫(2)连接；所述培养容器(10)设有分别与四个叉指电极阵列所在的区域(6)相匹配的四个培养腔(101)；顶盖(9)设有分别与四个培养腔(101)相匹配的四个腔盖(91)；所述绝缘基片(1)上的连接垫(2)与PCB板(11)连接，培养容器(10)的四个培养腔(101)分别对应地固定在四个叉指电极阵列所在的区域(6)上，四个腔盖(91)分别对应地置于四个培养腔(101)内。
2. 根据权利要求1所述的检测单细胞和群细胞行为的多尺度集成细胞阻抗传感器，其特征是所述绝缘基片(1)呈矩形，各叉指电极阵列(4)的总线的一个开口 (8)与所述矩形的绝缘基片(1)的相应直角相对。
3. 根据权利要求2所述的检测单细胞和群细胞行为的多尺度集成细胞阻抗传感器，其特征是所述微电极(5)仅分布在各叉指电极阵列(4)的总线的与所述矩形的绝缘基片(1)的相应直角相对的开口 (8)处。
全文摘要
本发明公开了一种检测单细胞和群细胞行为的多尺度集成细胞阻抗传感器，它有四个叉指电极阵列对称地分布在绝缘基片上，在绝缘基片的边缘位置分布有连接垫，每个叉指电极阵列的总线分别通过引线与相应的连接垫连接，微电极相应地分布在各叉指电极阵列的总线的至少一个开口处，各微电极通过引线与相应的连接垫连接；培养容器设有分别与四个叉指电极阵列所在的区域相匹配的四个培养腔；顶盖设有分别与四个培养腔相匹配的四个腔盖；绝缘基片上的连接垫与PCB板连接，培养容器的四个培养腔分别对应地固定在四个叉指电极阵列所在的区域上，四个腔盖分别对应地置于四个培养腔内。该传感器不仅提高了集成程度，且能同时检测群体细胞和单细胞的行为。
文档编号G01N27/02GK101712925SQ200910154679
公开日2010年5月26日 申请日期2009年11月23日 优先权日2009年11月23日
发明者刘清君, 吴成雄, 王平, 胡朝颖, 蔡华 申请人:浙江大学