专利名称：检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生化领域，具体涉及检测病毒的试剂。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS) 是以母猪的繁殖障碍、仔猪及成猪的呼吸道症状为主要特征的一种病毒性传染病，其高死 亡率在世界范围内给养猪业造成巨大的经济损失。自1987年在美国某个猪场发现PRRS以 来，该病先后席卷整个北美、欧洲及亚洲。1990-1991年间该病在欧洲暴发流行，5000多个 猪场发现本病，100多万头猪死亡。我国自1995年从加拿大引进种猪后，年底于华北地区爆 发PRRS，1996-1998年更是出现“流产风暴”，发病母猪流产率达10-50 %，母猪的死亡率高 达10%。由于没有有效的防治手段，PRRS在我国愈演愈烈，并于2006年出现严重疫情，26 省300多个县，379. 8万头猪发病，死亡99. 2万头，给养猪业带来沉重打击。PRRS爆发的原 因在于其病毒复制过程存在变异，一般的疫苗难于预防，早发现，早隔离成为预防爆发流行 的主要手段。经研究表明引起PRRS的病原体为猪繁殖于呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus, PRRSV),属于尼多病毒目(Nidovirales) 动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Arterivirus)。PRRSV的基因组为不分节段 的单股正链RNA，直径约40-80nm，大约为15kd，含9个开放读码框(ORFs)。病毒上的囊膜 蛋白是病毒的结构和保护性抗原的组成部分，在致病和免疫过程中发挥着重要的作用。根 据序列分析及血清学试验结果，将PRRSV分为两个亚型，即美洲型(代表株VR_2332)和欧 洲型(代表株Lelystad Virus, LV) 0 PRRSV存在较大的基因变异，造成二者抗原性的差异 也较大，因此两个亚型在血清学试验中很少有交叉反应。引起我国PRRS大规模暴发流行的 主要是美洲型，流行病学调查发现我国亦存在欧洲型PRRSV。随着病毒基因组的变异，抗原 决定簇的改变或转换，PRRSV的侵袭力和致病性可能还会不断增强，对养猪业将造成更大的 威胁。对猪繁殖与呼吸综合症做出快速、准确诊断，及时有效掌握PRRSV的流行特点和 监测其高致病毒株的出现，对流行趋势做出预测，尽早隔离并做出相应的防范，将能够最大 限度地减低疾病所造成的危害。PRRS病毒的检测方法主要有病毒分离鉴定、免疫过氧化酶技术及RT-PCR检测等。 病毒分离培养是最确切方法，但很多猪场不能开展，而且费时；RT-PCR检测技术含量及成 本较高，同时易出现假阳性结果；抗体检测方法以美国IDEXX和法国LSI最为经典，由于目 前各猪场均使用PRRS疫苗预防，上述两种方法都很难区分是疫苗免疫产生的抗体还是猪 感染PRRSV所产生，易出现假阳性；另外有些猪可能感染PRRS病毒但尚未产生抗体或曾感 染过而现在血清转阴等，出现假阴性。PRRSV基因组0RFs7编码的核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein，NP)包含所有 PRRSV毒株保守的共同抗原决定簇，又有具欧洲型和美洲型特异性的抗原决定簇。同时NP在病毒粒子中含量较高，约占病毒总蛋白的40%，具有极强的免疫原性。该蛋白是一种能够早期检测PRRSV感染的有效标志，及早确诊PRRSV感染，以便于快速采取有效的治疗和 隔离措施，是防止PRRSV感染的扩散及降低死亡率的前提，也是减少经济损失的有效措施， 而目前在国际上尚未有核衣壳蛋白抗原的检测方法。为此我们利用基因工程技术，表达该 PRRSV核衣壳蛋白，并制备抗该蛋白的单克隆抗体，在此基础上构建双抗体夹心ELISA法检 测PRRSV中的N蛋白，此抗原检测方法对于PRRS的早期诊断、预防PRRS的爆发流行、疫苗 评测以及流行病学调查具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提高检测PRRS病毒的灵敏度和特异性。本发明解决上述问题的技术方案是一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测抗体，该抗体由保藏号为CCTCC NO. C200851的杂交瘤细胞株G2C51A2分泌得到，记为单抗G2C51A2。一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的捕获抗体，该抗体由保藏号为CCTCC NO. C200850的杂交瘤细胞株V1C12A1分泌得到，记为单抗V1C12A1。本发明所述的单抗G2C51A2和单抗V1C12A1均能特异性结合PRRSV核衣壳蛋白， 与临床PRRSV感染的猪血清及肺组织研磨液分离所获病毒培养上清反应均为阳性；而与其 他常见猪感染性病毒培养上清的反应均为阴性，如伪狂犬病毒、猪圆环病毒等。所述单抗G2C51A2和单抗V1C12A1可分别由杂交瘤细胞株V1C12A1和G2C51A2分 泌得到。杂交瘤细胞株V1C12A1和G2C51A2是分别用重组的PRRSV核衣壳蛋白免疫Balb/ c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞和商品化的小鼠骨髓瘤细胞NS-I融合，最后用HAT培养 基筛选得到，已于2008年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。所述单抗G2C51A2和单抗V1C12A1配对用于检测PRRSV，主要是结合双抗体夹心 方法的检测，如双抗体夹心ELISA方法、胶体金免疫层析或免疫化学发光方法的检测，其中 单抗V1C12A1作为捕获抗体，单抗G2C51A2单独或者结合各种能发出可检测信号的物质作 为检测抗体。基于上述原理，本发明所述的单抗用于制备成可产业化的检测PRRSV的试剂 盒，该试剂盒包括检测抗体和捕获抗体，其特征在于所述的检测抗体是保藏号为CCTCCN0. C200851的杂交瘤细胞株G2C51A2分泌的单抗G2C51A2，所述的捕获抗体是保藏号为CCTCC NO. C200850的杂交瘤细胞株V1C12A1分泌的单抗V1C12A1。所述的试剂盒可以是双抗体夹 心ELISA试剂盒、免疫化学放光试剂盒或胶体金快速免疫层析检测试纸等，例如双抗体夹 心ELISA试剂盒由以下试剂组成包被单抗V1C12A1的微孔反应板、样品处理液、与标记物 结合的单抗G2C51A2、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液，其中所述的标 记物是指能标记在抗体非活性部位且可定量分析的物质(如酶、生物素或发光物质等)；而 相应的显色液则含有能与所述标记物反应并产生颜色变化的物质(例如酶的底物)。可以 变换和选择相应标记物与显色液，如生物素亲和素系统，再如辣根过氧化物酶及其底物过 氧化氢尿素和四甲基联苯胺(简称TMB)，也同样适用于本发明。所述的样品处理液、浓缩洗 液和终止液均是双抗体夹心ELISA方法中的常用试剂，所述的阳性对照物是指PRRSV核衣 壳蛋白，所述的阴性对照物是不含PRRSV核衣壳蛋白的空白对照物。本发明所说的检测PRRSV的试剂盒操作简单、快速，特异性高，与其它猪易感性病毒无交叉反应，既可用于猪只进出口检疫及猪场的检测监控，又可用PRRSV的诊断及流行 病学调查。本发明试剂盒与现有检测PRRSV的技术相比有以下优点1、用于进出口检疫及猪场的检测监控，与现有PRRSV检测技术相比，可利用本发 明酶联免疫技术试剂盒，对进出口猪只进行检测严格控制PRRSV毒株的引入及输出，可以 对猪的排泄物及血清样本初步筛查，可简易、快速、准确地检测出样本中PRRSV ； 2、用于猪场的检测监控，可利用本发明酶联免疫技术试剂盒，对可疑感染PRRSV 的猪场大规模的初步筛查，可简易、快速、准确地检测出样本中PRRSV ；3、与目前用于诊断PRRSV的早期诊断试剂盒相比，具有相似的灵敏度，但技术要 求低，特异性好，与伪狂犬病毒、猪圆环病毒等无假阳性反应，成本低，适合各大猪场及兽医 防疫站使用。
图1是本发明获得单抗V1C12A1和单抗G2C51A2所用的免疫源，诱导表达纯化获 得重组PRRSV核衣壳蛋白的结果。其中条带M为低分子量Marker，条带1为经IPTG诱导后 蛋白表达菌体，条带2为经Glutathione Sepharose 4B结合柱纯化的重组PRRSV核衣壳蛋 白(箭头所示)。图2是本发明获得单抗V1C12A1和单抗G2C51A2所用的免疫源，诱导表达纯化获 得重组PRRSV核衣壳蛋白免疫印迹鉴定结果。其中条带1为Anti-GST单抗，条带2为PRRSV 减毒疫苗免疫小鼠血清，条带3为无关抗体。图 3 是本发明单抗 V1C12A1 和单抗 G2C51A2 对经 Glutathione Sepharose 4B 结 合柱纯化的重组PRRSV核衣壳蛋白进行免疫印迹的结果，其结合条带的分子量为41kDa ；其 中条带1是V1C12A1，条带2是单抗G2C51A2，条带5是单抗Anti-GST单抗，条带6是单抗 Marker,条带3，4为无关单抗。图4是诱导表达纯化获得重组欧洲株PRRSV核衣壳蛋白的结果。其中条带M为低 分子量Marker，条带1为经IPTG诱导后蛋白表达菌体，条带2为经Glutathione Sepharose 4B结合柱纯化的重组欧洲株PRRSV核衣壳蛋白(箭头所示)。图5是本发明获得单抗V1C12A1和单抗G2C51A2，与诱导表达纯化获得重组欧洲 株PRRSV核衣壳蛋白免疫印迹鉴定结果。其中条带1为无关单抗，条带2和3分别为本发 明获得单抗G2C51A2和单抗V1C12A1，条带4为PRRSV减毒疫苗免疫小鼠血清。图6是本发明检测PRRSV N蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒检测欧洲株及美洲株 N蛋白的结果曲线图，其中+表示美洲株N蛋白，+表示欧洲株N蛋白，★表示阴性对 照。
具体实施例方式例1本发明单克隆抗体的制备和鉴定1、单抗V1C12A1和单抗G2C51A2的制备1)猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原制备利用基因工程技术，设计美洲株PRRSV基因组0RFs7编码的核衣壳蛋白基因两端 引物，上游引物5，-CGCGGATCCGTATGCCAAATAACAACGGCAAG-3，引入BamH I限制性内切酶位点，下游引物5，-CCGCTCGAG TTATCATGCTGAGGGTGATGCTGT-3，引入Xhol限制性内切酶位点， 以PRRSV(ch-la株，与美洲株同源性为93. 5% )扩增所得细胞上清提取RNA为反转录模板， 合成N蛋白基因CDNA，进而获得其dsDNA，构建进入PGEX-5X-3原核表达系统，IM IPTG，28°C 诱导表达PRRSV核衣壳蛋白，并纯化获得该蛋白(图1所示)，同时以PRRSV减毒疫苗免疫 小鼠血清及Anti-GST单抗、无关抗体鉴定所得重组蛋白后(图2所示)，并储存于-80°C备 用。
2)免疫小鼠取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐剂与等体积PRRSV核衣壳蛋 白抗原混勻乳化，皮下注射100 μ g/只小鼠，以后每10天以弗氏不完全佐剂与50 μ g抗原 等体积乳化，腹腔和皮下多点注射，小鼠免疫4次后，于融合前3天静脉加强100 μ g/只抗原。3)免疫血清效价测定采用间接ELISA法测定免疫血清效价。配制10yg/ml PRRSV核衣壳蛋白抗原的 50mMpH9. 6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ 1/孔，4°C过夜。次日，含0. 25% 酪蛋白(Sigma)的封闭液300 μ 1/孔4°C过夜，甩干包被板条，真空干燥12 24h，用铝膜 袋真空包装4°C保存，用于鼠免疫血清效价测定。于第三次免疫后10天眼眶采血，鼠免疫 血清用含BSA IOmM PBS以1(Γ3 1(Γ6倍稀释，加入96孔板，100 μ 1/孔37°C 30min, IOmM PBS含0. Tween-20洗涤液洗板四次后，加入1 1000倍稀释辣根过氧化物酶标 记羊抗小鼠IgG(Sigma, INC)，100 μ 1/孔37°C 30min,同上洗板后，加入含有0. 05% (W/V) TMB和0.06% (W/V)双氧pH5. O柠檬酸缓冲液，100 μ 1/孔，室温避光lOmin，加100 μ 1/孔 IM H2SO2终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值 得比> 2. 1为阳性来判断免疫血清的效价。4)杂交瘤制备选择血清抗体效价达1 X IO5的小鼠，于融合前3天尾静脉注射100 μ g PRRSV核衣 壳蛋白抗原。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-I按 10 1的比例混合，用45%聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)作用下进行融合。按下述步骤 将聚乙二醇溶液加入细胞。在37°C水浴中，在l-2min内缓慢加入1. Oml PEG，边加边轻轻 摇勻，分别于 lmin、2min、3min、4min、5min 内加 lml、2ml、3ml、4ml、5ml 无血清 RPMI-1640 培 养基终止融合，最后加入IOml含15% FBS的二合一培养基，室温IOOOrpm离心5min，弃上 清，用36ml含15%胎牛血清的培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入6块96孔培养板 上，在二氧化碳培养箱中温度为37°C、5% C02的培养箱中。一天以后，于每孔加入100 μ 1 含次黄嘌呤、氨基喋呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT，Sigma)筛选培养基。以后每3天用此筛 选培养基给培养物换液一次，直到克隆细胞形成。5)筛选分泌抗PRRSV核衣壳蛋白抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择强阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并 用有限稀释法连续克隆化2-3次，得到2株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。将克隆化后阳 性率达100%的细胞扩增培养后液氮冻存。小鼠体内接种阳性杂交瘤细胞，制备腹水，并采用辛酸_硫酸铵沉淀法纯化腹水 中的抗体。
2、本发明单克隆抗体的特异性鉴定 (1)实验材料猪繁殖与呼吸综合症减毒疫苗(ch-la株)(购自广州市动物防疫 监督所)(2)抗原制备利用基因工程技术，设计PRRSV核衣壳蛋白基因两端引物，合成NP蛋白基因，构建 入PGEX-5X-3原核表达载体，ImM IPTG 37°C诱导4h，，并纯化获得PRRSV核衣壳蛋白，并储 存于-80°C备用。(3)抗体亚类鉴定Ig亚类鉴定采用间接ELISA，包被PRRSV核衣壳蛋白抗原，封闭后与杂交瘤细胞 培养上清孵育，再分别与为1 1000倍稀释HRP标记的兔抗小鼠不同亚类特异性免疫球 蛋白，这些抗体包括兔抗小鼠IgGl (Sigma, Inc)，兔抗小鼠IgG2a(Sigma，Inc)，兔抗小鼠 IgG2b(Sigma, Inc)，兔抗小鼠 IgG3 (Sigma，Inc)，兔抗小鼠 IgM (Sigma，Inc)。检测结果两 株杂交瘤细胞株均为IgGl阳性(4)间接ELISA法进行单克隆抗体特异性分析用PRRSV核衣壳蛋白抗原包被微孔板，按照常规的间接ELISA法进行检测。在包 被的微孔板中加入本专利发明的杂交瘤细胞培养上清液，37°C再孵育lh，加入1 1000稀 释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG (Sigma，Inc)，100 μ 1/孔37°C 30min，加TMB显色液 室温避光IOminJn IM H2SO2终止反应，测450nm吸收值(A45tl)。表1结果显示本专利发明 的单克隆抗体与PRRSV核衣壳蛋白抗原产生很强的特异性的免疫反应。表1 =PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体与PRRSV核衣壳蛋白抗原反应间接ELISA结果
权利要求
一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测抗体，该抗体由保藏号为CCTCCNO.C200851的杂交瘤细胞株G2C51A2分泌得到。
2.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的捕获抗体，该抗体由保藏号为CCTCCN0. C200850的杂交瘤细胞株V1C12A1分泌得到。
3.—种产生权利要求1所述抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号是CCTCC N0.C200851。
4.一种产生权利要求2所述抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号是CCTCC N0.C200850。
5.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，该试剂盒包括检测抗体和捕获抗体， 其特征在于权利要求1所述的单克隆抗体，所述的捕获抗体是权利要求2所述的单克隆抗 体。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒是双抗体夹心ELISA试剂盒。
全文摘要
本发明提供了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的检测抗体和捕获抗体，这两种抗体分别由保藏号为CCTCC NO.C200851的杂交瘤细胞株G2C51A2分泌得到和由保藏号为CCTCC NO.C200850的杂交瘤细胞株V1C12A1分泌得到。上述抗体均能特异性结合PRRSV核衣壳蛋白，可用于制备PRRSV的试剂。本发明还提供了一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，该试剂盒包括检测抗体和捕获抗体，其特征在于所述的检测抗体由保藏号为CCTCC NO.C200851的杂交瘤细胞株G2C51A2分泌的抗体，所述的捕获抗体由保藏号为CCTCC NO.C200850的杂交瘤细胞株V1C12A1分泌得到。该试剂盒对PRRSV的美洲株和欧洲株都具有较高的准确度和灵敏度。
文档编号G01N33/577GK101955531SQ20091016162
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月17日 优先权日2009年7月17日
发明者王压娣, 蔡建飘, 袁国勇, 车小燕 申请人:南方医科大学;香港大学