专利名称：：检测抗hcv药物细胞毒性的方法
技术领域：
：本发明属于抗病毒药物筛选领域，具体地，涉及一种检测抗HCV药物细胞毒性的方法。
背景技术：
：据估计全球约1.7亿人感染HCV，在初次感染HCV的约80X的病例中出现持久性感染和慢性肝病疾病，虽然慢性HCV感染可以保持无症状，但也可以造成严重的肝脏受损最终发展成为肝硬化和肝癌。目前没有对HCV有效的疫苗，临床治疗中采用干扰素-a(interferon-a，IFN_a)联合利巴韦林，病毒学持续应答达到50%，但长期使用利巴韦林会导致溶血性贫血等不良反应，所以开发新的治疗药物具有重大意义。用于抗HCV药物的筛选系统主要有复制子系统，能在细胞中自主复制的HCV基因组，可应用于针对结构蛋白作为药物靶点的的筛选；假病毒系统(HCVpp)用于HCV感染性的研究、抗体中和、作用于病毒E1和E2蛋白的药物筛选；HCV细胞培养系统(HCVcc)则是HCV完整增殖周期、抗HCV治疗方法和开发丙型肝炎疫苗的强有力技术平台。药物细胞毒性对于体外抗HCV药物的筛选药物的药效评价是必不可少的一步，以MTT法检测药物对细胞的毒性可计算出药物对细胞的生长抑制率，通过GraphpadPrism5计算得到IC5。(IC5。半数抑制浓度，将细胞生长抑制50%所需的浓度)。再与药物抗HCVEC5。相比，可得出TI值，进行体外抗病毒药效评价。迄今，现有技术中未见以HCV细胞培养系统(HCVcc)为基础，利用MTT法检测抗HCV药物的细胞毒性的方法的报道。
发明内容本发明目的是利用HCV细胞培养系统的Huh7.5.1细胞，对抗HCV药物进行MTT法细胞毒性检测，并为体外抗HCV药物的筛选提供实验依据。利用灵敏、经济的MTT法检测抗HCV药物对Huh7.5.1细胞毒性，为筛选抗HCV药物不可缺少的一步，并对抗HCV阳性药物干扰素(interferon,IFN)和利巴韦林(ribavirin,RBV)进行细胞毒性检测，为体外筛选抗HCV药物的顺利进行提供依据。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的检测抗HCV药物细胞毒性的方法，包括采用MTT法测定细胞生长曲线，确定实验细胞密度，然后用MTT法检测IFNa-lb及利巴韦林细胞毒性；利用2a型嵌合病毒J6/JFH1转染Huh7.5.1细胞产生有感染性的病毒颗粒这一HCV细胞培养体系(HCVcellculture,HCVcc)，利用分析细胞活性、细胞生长增殖的MTT法检测抗HCV药物的细胞毒性，计算出药物对细胞的生长抑制率，通过Gr即hpadPrism5计算得到IC5。。采用MTT法测定细胞生长曲线，确定实验细胞密度是用(1)取对数生长期的Huh7.5.1细胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim离心3min，血球计数板计数后，调整细胞浓度为9X10Wls/ml，铺于96孔板(lOOiU/well);(2)补加培养基至终体积为200iil/well，将培养板置于37°C5%C02培养，每三天补充50-100新鲜培养基，设3个重复孔，同时设空白调零组；(3)每天于实验孔加入20ii15mg/mlMTT溶液，37°C5%C02培养箱孵育4h后，吸弃上清，加入1501DMS0，震荡溶解10min，用酶标仪测各孔0D49。值；(4)绘制Huh7.5.1细胞生长曲线。用MTT法检测IFNa-lb及利巴韦林细胞毒性步骤是用(1)取对数生长期的Huh7.5.1细胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim离心3min，血球计数板计数后，调整细胞浓度为9Xl(^个/ml，铺于96孔板(lOOiU/well);(2)加入以无血清培养基稀释的药物，8个稀释梯度，每个梯度设三个重复孔，同时设置空白对照(只含培养基)、细胞对照及药物颜色对照，补加培养基至终体积为200iil/well，将培养板置于37°C5%C02培养箱培养；(3)第三天于实验孔加入20iil5mg/mlMTT溶液，37。C5%0)2培养箱孵育处后，吸弃上清，加入150ii1DMSO，震荡溶解10min，用酶标仪测各孔0D49。值；(4)计算细胞生长抑制率，及以Gr即hpadPrism5计算IC5。值。细胞生长抑制率(％)=a-5，，)xioo对照孔OD值。本发明方法的主要步骤为(1)取对数生长期的Huh7.5.1细胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim离心3min，血球计数板计数后，调整细胞浓度为9X10Wls/ml，铺于96孔板(lOOiU/well);(2)加入以无血清培养基稀释的药物，8个稀释梯度，每个梯度设三个重复孔，同时设置空白对照(只含培养基)、细胞对照及药物颜色对照，补加培养基至终体积为200iil/well，将培养板置于37°C5%C02培养；(3)第三天于实验孔加入20iil5mg/mlMTT溶液，37。C5%0)2培养箱孵育处后，吸弃上清，加入150ii1DMSO，震荡溶解10min，用酶标仪测各孔0D49。值；(4)计算细胞生长抑制率，及以Gr即hpadPrism5计算IC5。值细胞生长抑制率(％)=(1-S，，)x100对照孔OD值。本发明以HCV细胞培养系统(HCVcc)为基础，利用MTT法检测抗HCV药物的细胞泰性。MTT全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，以PBS配制，过滤除菌保存。MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法，但不能测定细胞绝对数。其原理为活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(Formazan)，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。以二甲基亚砜(DMSO)溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。MTT比色法以简单、经济、快速、灵敏、无放射性污染为特色，成为分析细胞活性、细胞生长增殖的常用方法，近年来MTT法应用于抗癌药物、药敏实验的常用方法。但由于MTT法形成的蓝紫色结晶需要加入有机溶剂二甲基亚砜溶解才能比色，操作步骤也会对实验结果有所影响，但是与其它方法MTS、XTT法等比较，MTT法能检测细胞密度范围更宽，并且无放射性污染，也更经济，因此MTT法成为首选药物筛选细胞毒性的方法。图1为Huh7.5.1细胞生长曲线；图2为利巴韦林细胞毒性。具体实施例方式下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。实施例1:l、Huh7.5.1细胞生长曲线采用MTT法测定细胞生长曲线，确定实验细胞密度。(1)取对数生长期的Huh7.5.1细胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim离心3min，血球计数板计数后，调整细胞浓度为9X10Wls/ml，铺于96孔板(lOOiU/well)。(2)补加培养基至终体积为200iil/well，将培养板置于37°C5%C02培养，每三天补充50-1001新鲜培养基。设3个重复孔，同时设空白调零组。(3)每天于实验孔加入20ii15mg/mlMTT溶液，37°C5%C02培养箱孵育4h后，吸弃上清，加入1501DMSO，震荡溶解10min，用酶标仪测各孔0D49。值。(4)绘制Huh7.5.1细胞生长曲线。从图1可知从3-7天细胞处于指数生长期，并在第3天细胞占板底约70-80%，为药物筛选的最佳密度，因此选择9X10、ells/ml为实验最适细胞密度，并在第三天进行细胞毒性检测为最适时间。2、MTT法检测IFNa-lb及利巴韦林细胞毒性(1)取对数生长期的Huh7.5.1细胞，O.25%胰酶消化，800-1000rpm/mim离心3min，血球计数板计数后，调整细胞浓度为9X10、ells/ml，铺于96孔板(lOOiU/well)于37°C5%C02培养，贴壁5h。(2)加入以无血清培养基稀释的药物，8个稀释梯度，每个梯度设三个重复孔，同时设置空白对照(只含培养基)、细胞对照及药物颜色对照，补加培养基至终体积为200iil/well，将培养板置于37°C5%C02培养。(3)第三天于实验孔加入20ii15mg/mlMTT溶液，37°C5%C02培养箱孵育4h后，吸弃上清，加入1501DMSO，震荡溶解10min，用酶标仪测各孔0D49。值。(4)计算细胞生长抑制率，及以Gr即hpadPrism5计算IC5。值。(IC5。半数抑制浓度，将细胞生长抑制50%所需的浓度)的值。细胞生长抑制率(％)=(1-B，0D，)x100对照孔OD值。通过细胞生长抑制率，以Gr即hpadPrism5软件计算得出IFNa-lb无实际细胞毒性，利巴韦林IC5。=20.14iig/ml。表1为IFNa-lb及利巴韦林细胞毒性结果。表lIFNa-lb与利巴韦林细胞IC5。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注n.d.:nonedetective.从上述试验可得出结论本发明利用2a型嵌合病毒J6/JFH1转染Huh7.5.1细胞产生有感染性的病毒颗粒这一HCV细胞培养体系(HCVcellculture,HCVcc)，利用分析细胞活性、细胞生长增殖的MTT法检测抗HCV药物的细胞毒性，计算出药物对细胞的生长抑制率，通过Gr即hpadPrism5计算得到IC5。。实验得出最佳实验细胞密度为9X104cells/ml，正常细胞对照OD，值于O.45-0.55之间，同时IFNa-lb无实际细胞毒性，利巴韦林细胞ICs。为20.14iig/ml。本发明操作简单、经济、快速、灵敏、无放射性污染，并能准确检测药物细胞毒性，有较好的重复性，能为体外抗病毒药效评价的顺利进行提供准确的检测方法。权利要求检测抗HCV药物细胞毒性的方法，包括采用MTT法测定细胞生长曲线，确定实验细胞密度，然后用MTT法检测IFNα-1b及利巴韦林细胞毒性；利用2a型嵌合病毒J6/JFH1转染Huh7.5.1细胞产生有感染性的病毒颗粒这一HCV细胞培养体系，利用分析细胞活性、细胞生长增殖的MTT法检测抗HCV药物的细胞毒性，计算出药物对细胞的生长抑制率，通过GraphpadPrism5计算得到IC50。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于用MTT法测定细胞生长曲线，确定实验细胞密度(1)取对数生长期的Huh7.5.l细胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim离心3min，血球计数板计数后，调整细胞浓度为9X10、ells/ml，铺于96孔板lOOiU/well;(2)补加培养基至终体积为200iil/well，将培养板置于37°C5%C02培养，每三天补充50-1001新鲜培养基；设3个重复孔，同时设空白调零组；(3)每天于实验孔加入20ii15mg/mlMTT溶液，37°C5%C02培养箱孵育4h后，吸弃上清，加入150ii1DMSO，震荡溶解10min，用酶标仪测各孔0D49。值；(4)绘制Huh7.5.1细胞生长曲线。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于用MTT法检测IFNa-lb及利巴韦林细胞毒性步骤为(1)取对数生长期的Huh7.5.l细胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim离心3min，血球计数板计数后，调整细胞浓度为9X10、ells/ml，铺于96孔板lOOiU/well;(2)加入以无血清培养基稀释的药物，8个稀释梯度，每个梯度设三个重复孔，同时设置只含培养基的空白对照、细胞对照及药物颜色对照，补加培养基至终体积为200iU/well，将培养板置于37°C5%C02培养箱培养；(3)第三天于实验孔加入20ii15mg/mlMTT溶液，37°C5%C02培养箱孵育4h后，吸弃上清，加入150ii1DMSO，震荡溶解10min，用酶标仪测各孔0D49。值；(4)计算细胞生长抑制率，及以Gr即hpadPrism5计算IC5。值，细胞生长抑制率(％)=(1-=)xlOO全文摘要本发明利用2a型嵌合病毒J6/JFH1转染Huh7.5.1细胞产生有感染性的病毒颗粒这一HCV细胞培养体系(HCVcellculture，HCVcc)，利用分析细胞活性、细胞生长增殖的MTT法检测抗HCV药物的细胞毒性，计算出药物对细胞的生长抑制率，通过GraphpadPrism5计算得到IC50。本发明操作简单、经济、快速、灵敏、无放射性污染，并能准确检测药物细胞毒性，有较好的重复性，能为体外抗病毒药效评价的顺利进行提供准确的检测方法。文档编号G01N21/31GK101775432SQ20091016325公开日2010年7月14日申请日期2009年12月29日优先权日2009年12月29日发明者冯悦,刘丽,唐颖蕾,夏雪山,魏大巧申请人:昆明理工大学