专利名称：用于微生物分析的装置的制作方法
用于微生物分析的装置 本发明涉及一种用于对可能含有微生物的载体进行微生物分析的装置，以便检测
是否存在那些微生物。 —种分析这样的载体的方法由如下操作构成在用所谓的荧光团或荧光团标记物
标记了微生物之后，通过分析那些微生物发出的荧光来检测微生物的存在。 这些标记物仅在事先被微生物中包含的化学酶激活时才具有发荧光的特性。 这些标记物一般包括荧光团基团以及能够隐蔽或防止荧光团基团的荧光显示出
来的基团。在存在微生物时，其化学酶的效果是使该第二基团改性，从而可以检测到第一基
团的荧光。 于是，如图7的频谱53和54所示，当这样标记的微生物受到适当的激发光作用 时，荧光团基团能够吸收峰值53'处于波长入2的吸收频谱53的光能，并以特征荧光发射 谱54的形式释放能量，发射谱的峰值54'处于不同于、的波长入3。
为了观察在存在这种标记物的情况下微生物发射的荧光，如图9所示，已经知道 有用于微生物分析的装置(集成到显微镜中)，其包括照明设备，用于发射激发光，激发光 的高斯分布形式的光谱50的峰值50'处在波长、，选择、使其等于波长入2，以利用充 分大的能量激发荧光团，从而在存在微生物的情况下使其发射具有其发射谱54的光。
这种装置设有输入滤波器，输入滤波器置于照明设备和待照明的载体之间，例如 是光谱51如图9所示的带通滤波器，该滤波器具有以波长A工为中心的非常窄的通带，以 便在给定照明设备的较宽谱宽对应于光谱50的条件下，仅选择对于以期望能量正确激发 荧光团有用的波长。 这种装置还包括置于被分析载体和用于观察来自载体的光的区域之间的滤波器， 该滤波器如图9的光谱52所示(这里是以波长A 2为中心的窄通带带通滤波器)，以便仅 让由荧光团响应于激发光发射的光通过，而滤除所有其他无关波长。
例如，在美国专利US 7， 397， 602中描述了这种布置的装置。 本发明涉及提供一种装置，像现有技术的装置那样，该装置用于检测荧光，但该装 置既更加经济又更加简单，同时提供了一样好的性能。 为此，提供了一种用于对适于包含被荧光团试剂标记的微生物的载体进行微生物 分析的装置，所述试剂在与所述微生物接触时适于以峰值处于预定吸收波长(入2)的吸收 谱吸收光能并通过以峰值处于与所述吸收波长(入2)不同的预定发射波长(入3)的发射谱 发射荧光来释放能量，所述装置包括照明设备，所述照明设备适于对所述载体照明，以便使 所述被标记微生物响应于那些照明设备发射的激发光来发射具有所述发射谱的光；其特征 在于来自所述照明设备的激发光光谱包括处于与所述荧光团试剂的所述吸收波长(入2)和 发射波长(A 3)不同的预定激发波长(A》处的峰值，使得所述吸收波长(A2)位于所述激 发波长(A》和发射波长(A3)之间，所述激发波长(A》和吸收波长(A2)之间具有预定
的差，利用这一特征，容易将所述荧光团试剂发射的光与来自所述照明设备的光区分开。
这样，在吸收波长、位于激发波长、和发射波长、之间的情况下，激发光谱
和吸收光谱之间的光谱偏移使得能够有利地将位于A工之外的激发光光谱部分定位于那些吸收和发射波长之间，以便在波长入2获得能量相当高的光来激发荧光团，使其通过荧光性 发光，并且使激发光谱与处于波长入3(和相邻波长)的发射光谱具有小的交迭，以便在存 在微生物的情况下，来自照明设备且在被分析载体上反射的光不会与荧光团试剂发射的光 产生重大寄生干扰，从而能够容易地将荧光团试剂发射的光与来自照明装置的光区分开。
更具体而言，就这样借助根据本发明的装置的光谱偏移使激发光谱和发射光谱之 间的交迭很小，使荧光团发射光谱的峰值与激发光的光谱峰值进一步分离，相当大程度上 改善了荧光团发射波长(来自照明设备在该波长处发射的光)处寄生能量和实际来自被标 记微生物的荧光性质的能量之间的比例。 于是能够容易地以充分大的对比度检测到载体上对应于被标记微生物的亮点，使 它们能够被清楚观察到，尤其是利用肉眼观察到。 于是，即使对于光谱色散不可忽略的照明设备(例如图7和9的光谱50和55所 示)而言，该光谱偏移也使得能够省去现有技术装置的输入滤波器，而不必由其他光谱色 散更低的照明设备(例如激光器，激光器通常极其昂贵)取代这种照明设备。
于是这样就能够显著降低这种装置的制造成本，同时使光能损失最小化，因为输 入滤波器，尤其是窄通带滤波器的存在必定导致这种装置的能量处理量的显著降低(从而 降低到达要照明的载体的光量)。 由于根据本发明的装置中的光能损失较小，从而对于消耗的同样的电能，能够比 应用到现有技术的装置的显微镜中照明更大的被分析载体表面(例如微孔滤膜的表面)。
出于制造和使用都简单而方便的原因，根据本发明优选如下特征
-所述激发波长(A 1)短于所述吸收波长(入2)，所述吸收波长(A2)短于所述发 射波长(入3);-激发光的所述光谱包括以所述激发波长(A 1)为中心的最大光强峰值；-所述激发波长(A 1)和吸收波长(A 2)之间的差小于所述荧光团试剂的所述吸
收波长(A 2)和发射波长(A 3)之间的差；-所述装置还包括用于观察所述荧光团试剂发射的光的窗口 ，所述窗口设有滤波 器，适于让最长的波长通过，其截止波长位于所述吸收波长(A 2)和所述发射波长(A 3)之 间；-所述照明设备包括至少一个基座，所述基座上安装至少一组光源，该组所述光源 彼此规则间隔，以形成用于所述载体的照明阵列；-所述照明设备包括两个所述基座，所述基座向预定位置的方向相对于彼此倾斜 用于接收所述装置中的所述载体；-每个所述基座相对于用于接收所述载体的所述预定位置倾斜40°和50°之间 的角度；-所述光源为发光二极管；和/或-所述照明设备包括适于发射多色光的灯和滤波器，所述滤波器适于让最小的波 长通过，且其截止波长位于所述吸收波长(A 2)和所述发射波长(A3)之间。
参考附图，从通过优选但非限制性范例的方式给出的以下描述中将明了本发明的 特征和优点，附图中-
图1是根据本发明的装置的图示；
-图2是该装置的透视图，在其旁边示出了装置中用于分析的滤波单元；-图3和4分别是从下方获得的透视图以及从该装置的对称正中平面截取的正截
面图；-图5是该装置两个印刷电路板之一的透视图，其上固定了两组发光二极管，每组 发光二极管都在预定波长发射光；-图6是根据本发明的装置的另一个实施例的透视图；-图7示出了根据本发明的不同光学构件的光谱图以及该装置用于标记微生物的
荧光团试剂的光谱图，沿x轴为共同比例的波长，沿y轴为共同比例的相对光强； _图8是根据本发明的装置的又一实施例的部分的图示；以及-图9示出了类似于图7但针对前述根据现有技术的装置的光谱图。 在借助图7所示光谱图详述其工作模式之前，现在将在借助图1到5给出根据本
发明的装置的优选实施例的描述。 图1到5所示的装置1包括外壳2、由两个照明构件4形成的照明设备3、滑动抽 屉5和观察窗口 7。 外壳是大致平行六面体形状，具有上壁10和四个侧壁11到14，故意没有示出壁 14的一部分，以便示出装置的内部。 在这里，观察窗口 7由低通滤波器6构成(即，其允许最低频率，即最长的波长通 过)，外壳2的上壁10中形成开口 9，以在其中接收滤波器6。 在下面将会看到，由壁10到14和30界定的该外壳2的内部形成分析室，分析室 与环境光隔离，其中容纳要分析的载体。这里，要分析的载体是属于滤波器单元40的微孔滤膜4l，这里是由MilliporeO以
Milliflex㊣为商标出售的单元。这个膜41直径为55mm，被滤波器单元的主体42所围绕。 这里使用的膜41是纤维素酯，其孔径适于维持期望检测其存在的微生物，大部分
常常在0. 10和100微米之间。 抽屉5具有主体30、轴环31和握柄32。 在主体30中，形成柱形腔33，用于接收滤波器单元40。 现在将借助图3到5描述照明设备3 。 这些设备3包括两个独立的照明构件4。 每个构件4包括梯形截面的底座20、其上设置有两组27和28 二极管22和23的 印刷电路板21、覆盖那些二极管的漫射体24以及电路板21的边缘和漫射体24边缘之间的 两个暗色滤光镜26。 底座20固定于外壳2内部的外壳壁10上，而电路板21固定到底座20远离靠着 壁10设置的那些面的其倾斜面上，使得那些电路板沿着载体41的接收区域33的方向朝向 彼此倾斜。 于是这样提供了每个底座20，使得当单元40处于装置外壳33中时(图1)，每个
板子21相对于壁10和膜41所占据的预定位置具有45°的倾角A(图1)。 电路板21的上边缘25彼此相距100mm的距离，而那些边缘25距壁1023mm的距离。 发光二极管22和23的顶点位于距漫射体2415mm距离处。
这里，这些漫射体24是由玻璃板制成的，玻璃板的一面(转向二极管的面)经喷 沙处理。 在每个印刷电路板上，如图5所示，设置由十六个二极管22构成的第一组二极管 27以及由四个二极管23构成的第二组二极管28。 二极管22彼此规则地间隔并设置成四个二极管一排等间距的四排，使得每个二 极管22距与其直接相邻的二极管2216mm的距离。于是这一组27形成二极管阵列，使得在 将其置于外壳2中其预定位置时能够均匀地对膜41进行照明，阵列的中心29位于距离该 预定位置54. 75mm的高度H处(图1)。 二极管23分布于在二极管22的阵列中心隔行形成的正方形的四个角中，每个二 极管23位于距直接与其相邻的两个二极管2332mm距离处并处于正方形的中心处，在正方 形的角部有四个二极管22(图5)。这个阵列的中心与二极管22构成的阵列中心29重合。
二极管22是来自LUMILED②公司以LXHL-PB01作为参考销售的二极管，图7中 示出了其发射谱55，这一高斯分布形式的光谱峰值55'处于470nm的波长A工处，于是发 射蓝光。 二极管23是来自同一公司以参考LXHL-PD01销售的二极管，图中未示出其发射 谱，其发射谱也是高斯分布形式，在625nm波长处具有峰值，于是发射红光。
对于25%的相对强度值而言，这些二极管具有140°的发射立体角，对于60%的 相对强度值，具有90。的发射立体角。 二极管23具有基本为二极管22四倍的发射功率，从而它们的数量比二极管22少 四倍。 隔行设置二极管22和23的阵列(即彼此嵌套)，从而在要照明的滤波器单元那里 获得可能最均匀的光，无论光是来自二极管22还是来自二极管23 。 每组二极管都产生以预定波长为中心的光谱，以便能够激发不同预定类型的荧光 团。 每个电路板21上的导电迹线电连接到用于装置的命令和控制单元(未示出)。
现在将简要介绍要分析样本的制备。 在实际检测步骤之前，操作员通过单元40的膜41进行过滤，以采集要分析的样品 (可能含有微生物)。 —旦微生物被过滤并保留在膜上，可以包括任选步骤，即使与适当生长培养基接
触的微生物生长。生长培养基优选为凝胶介质，在过滤之后在其上沉积膜。该步骤是任选
的，使得能够获得一开始过滤的每种微生物菌落，这增大了要检测的细胞数量。 然后使膜及其包含的微生物与使微生物细胞壁可渗透的成分接触，随后将荧光团
标记物加入实现可渗透的成分中，以便进入要检测的微生物内部。 现在将介绍基于根据本发明的装置判断如此制备的样品上是否存在微生物的实 施方式。 在第一阶段中，拉出抽屉5，操作员在该抽屉的腔33中放入滤波器单元40(其可能 被未示出的透明盖板覆盖以保护膜不受外部污染物影响)。然后推入抽屉5，直到轴环31 抵靠壁13为止，使得膜41置于外壳2中其预定位置，以便被照明。 根据用于标记微生物的荧光团，操作员接下来选择(例如通过图中未示出的开关)对应的二极管22或23以将其导通(在图示的范例中为二极管22)，以便均匀地照明膜 41的整个表面，并在正确波长激发用于进行标记的荧光团。 漫射体24以及二极管在电路板21上的空间分布使得无论使用哪组二极管，都能 够对膜41的整个表面进行特别均匀的照明。 由于电路板21置于接收滤波器6的开口 9的每个边上，因此响应于来自二极管的 激发光从滤波器单元40发射的光如图1所示通过该滤波器，从而能够用肉眼或经由摄像机 通过滤波器6观察膜41的光响应。 现在将描述利用图7所示不同光谱图在存在微生物的情况下获得的光响应。
在图7中，光谱55是高斯形的，对应于激发光的光谱(这里为二极管22产生的光 谱)，并具有一峰，其与最大光强值对应的峰值55'处于等于470nm的波长A工处。
光谱53和54分别对应于这里选择用于标记膜上存在的微生物的荧光团的吸收谱 和发射谱。 这里描述的荧光团是5-6CFDA(羧基-荧光素_Di_乙酸)。 吸收谱53在大于A工的波长A 2处具有峰值53 '，发射谱54在大于A 2的波长 入3处具有峰值54'。 在图示的范例中，、等于492nm，、等于517nm，这里、和、之间的差小于入2 和、之间的差。 有意识地选择激发波长A p使其小于A 2，使得光谱55的峰值55'相对于光谱53 的峰值53'在光谱54的相对侧上偏移。选择这一偏移，以便使来自照明设备的光具有足够 高能量来激发荧光团，而光不会与荧光团响应于激发光而发射的光产生严重寄生干扰。
光谱56是观察窗口的滤波器6的光谱，选择其截止频率(这里大约为550nm)以 使荧光团发射的光(光谱54)基本通过，并阻挡更短波长的光，尤其是来自二极管22的在 单元40上反射之后的光。 这一输出滤波器(彩色滤波器)有弱选择性，以允许充分多的光返回用户眼睛，给 出大致明亮的景色，于是观察起来让人舒适，同时确保对比度水平适于用肉眼观察。
当来自照明设备3的激发光照射滤波器单元40的膜41时，使得具有被荧光团标 记的微生物的该膜的每个位置以小尺寸(几百微米)亮斑的形式变得可见，亮斑可以直接 由滤波器6之外的肉眼观察到。 角度A和高度H的值为无论用肉眼或通过摄像机读取膜41上的亮斑提供了最佳 表现。 这些值是通过以下操作确定的向控制膜施加黑标记和荧光黄标记，并针对角度 A和高度H的不同值寻找荧光频带亮度最大同时使黑标记上的寄生亮度最小的配置A、 H。
这样做已经令人惊讶地证实，范围[40° -50° ]的角度A给出了荧光标记的最大 强度并且对于黑标记实际上不存在的寄生光，从而对应于阅读舒适度方面的最佳值。
因此，为了相对于安装装置期间的作用具有特定安全裕度，从而在此选择了平均 值45° 。 至于高度值H，这是被照明对象尺寸的函数，已测试的不同配置表明，对于直径为 55mm的膜以及角度A的值范围在40。到50°而言，在39. 75mm和69. 75mm的高度范围上获 得了最佳结果。在此，类似地，在该范例中选择的是平均值54. 75mm。
通过调节高度H，该装置还适于照明除膜之外的其他类型样品以及基本任何适于 (无论是在表面上或是在体积中)包含微生物且希望通过荧光性检测其存在的载体。
图6中示出了该装置的另一个实施例。
—般而言，将增加了 100的相同附图标记用于类似部分。 装置101与装置1具有相同特征，只是其缺少抽屉5 (例如这里，滤波器单元40直 接放在例如台上)，并且这里观察窗口 107是由靠着外壳102的壁110设置的矩形形式滑块 108以及四个滤波器106到106〃 '形成的，每个滤波器都容纳在滑块108的对应开口中。
每个光学滤波器都是低通滤波器，从而允许低频(最长的波长)通过，其截止频率 与其他截止频率不同。 滑块108配合在该装置的导轨(未示出)中，从而能够将四个滤波器106到 106〃 '中任何选定的一个放置成与壁110的开口 109对准。 于是，根据所选的荧光团以及导通的二极管，能够从四个可用滤波器中选择具有 最适合截止频率的一个(例如，以获得最佳对比度)。 在一个未示出的实施例中，滤波器6不是低通滤波器，而是通带以波长入2为中心 的带通滤波器。 在图8示意性示出的又一实施例中，照明设备的光谱峰值不必一定是局域化的， 于是，例如利用多色光灯204而不是二极管作为照明设备203在更大波长范围上扩展光谱， 灯204与高通滤波器234相关联，高通滤波器234允许最高频率，即最短的波长通过，比现 有技术的带通滤波器成本更低，其截止波长入。位于吸收波长、和发射波长入3之间(图 8)。 最后，要指出的是，也可以针对很多其他应用按照不同版本生产这种照明系统，其 他应用例如是通过显微镜分析、扫描生物芯片、借助荧光性读取板子、式细胞术、透照器、 PCR实时读取进行分析，那么用于这些应用的每种的装置几何配置将是对相关应用特定的 版本。基座21固定于其上的装置框架未必是像图示外壳2的外壳；例如它可以是围绕显微 镜光学装置的环带。 本发明不限于所述和图示的实施例，而是涵盖其任何变体。
权利要求
一种用于对适于包含被荧光团试剂标记的微生物的载体(41)进行微生物分析的装置，所述试剂在与所述微生物接触时适于以峰值(53′)处于预定吸收波长(λ2)的吸收谱吸收光能并通过以峰值(54′)处于与所述吸收波长(λ2)不同的预定发射波长(λ3)的发射谱(54)发射荧光来释放该能量，所述装置包括照明设备(3；203)，所述照明设备适于对所述载体(41)照明，以便使所述被标记的微生物响应于那些照明装置(3；203)发射的激发光来发射具有所述发射谱(54)的光；其特征在于，来自所述照明设备(3；203)的所述激发光的光谱(55)包括处于与所述荧光团试剂的所述吸收波长(λ2)和发射波长(λ3)不同的预定激发波长(λ1)的峰值(55′)，使得所述吸收波长(λ2)位于所述激发波长(λ1)和发射波长(λ3)之间，并且所述激发波长(λ1)和吸收波长(λ2)之间具有预定的差，利用这一特征，容易将所述荧光团试剂发射的光与来自所述照明设备(3；203)的光区分开。
2. 根据权利要求l所述的装置，其特征在于，所述激发波长(A》短于所述吸收波长 (入2)，所述吸收波长(A 2)短于所述发射波长(A 3)。
3. 根据权利要求1或2的任一项所述的装置，其特征在于，所述激发光的所述光谱 (55)包括以所述激发波长(A》为中心的最大光强峰值(55')。
4. 根据权利要求1到3的任一项所述的装置，其特征在于，所述激发波长(A》和吸收 波长(入2)之间的差小于所述荧光团试剂的所述吸收波长(A2)和发射波长(A3)之间的 差。
5. 根据权利要求1到4的任一项所述的装置，其特征在于，其还包括用于观察所述荧光 团试剂发射的光的窗口 (7;107)，所述窗口设有滤波器(6;106)，所述滤波器适于让最长的 波长通过，且其截止波长位于所述吸收波长(入2)和所述发射波长(A3)之间。
6. 根据权利要求1到5的任一项所述的装置，其特征在于，所述照明设备(3)包括至少 一个基座(21)，所述基座上安装至少一组(27)光源(22)，该组(27)所述光源(22)彼此规 则间隔，以形成用于所述载体(41)的照明阵列。
7. 根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述照明设备(3)包括两个所述基座(21) ，所述基座向所述装置中用于接收所述载体(41)的预定位置的方向相对于彼此倾斜。
8. 根据权利要求7所述的装置，其特征在于，每个所述基座(21)相对于用于接收所述 载体(41)的所述预定位置倾斜40。和50°之间的角度(A)。
9. 根据权利要求6到8的任一项所述的装置，其特征在于，所述光源为发光二极管(22) 。
10. 根据权利要求1到5的任一项所述的装置，其特征在于，所述照明设备(203)包括 适于发射多色光的灯(204)和滤波器(234)，所述滤波器适于让最小的波长通过，且其截止 波长(A。)位于所述吸收波长(入2)和所述发射波长(A 3)之间。
全文摘要
一种用于对适于包含被荧光团试剂标记的微生物的载体进行微生物分析的装置，所述试剂适于以具有峰值(53′)处于预定吸收波长(λ2)的吸收谱(53)吸收光能并通过以峰值(54′)处于与所述吸收波长(λ2)不同的预定发射波长(λ3)的发射谱(54)发射荧光来释放能量，所述装置包括照明设备；来自照明设备的激发光的光谱(55)在预定激发波长(λ1)处具有峰值(55′)，激发波长(λ1)和吸收波长(λ2)之间具有预定的差，借助这一特征，能够容易地将所述荧光团试剂发射的光与来自照明设备的光区分开。
文档编号G01N21/64GK101712926SQ20091017329
公开日2010年5月26日 申请日期2009年9月22日 优先权日2008年9月23日
发明者G·魏彻 申请人:米利波尔公司