专利名称：益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性、定量测定方法
益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性、定量测定方法
技术领域：
本发明涉及含有益生菌的乳制品技术领域。更具体地，本发明涉及一种在益生菌 乳制品中干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的快速定性、定量测定方法。
背景技术：
益生乳制品因其丰富的营养价值和特殊的益生功效成为人们关注的热点。目前市 场上益生菌及含有益生菌的乳制品种类繁多，并且每年以高速度增长。对其质量的监管和 认证，尤其在定性、定量检测方面缺乏科学、合理、快速的方法。传统方法中对益生菌的定 性、定量检测，仍采用生理生化反应和选择性培养基纯培养分离计数的方法。传统方法易受 培养条件、菌种特性等因素影响，检测效率有限，而且受外界环境因素和培养基性能的影响 大，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时耗力。PCR技术一经出现就被广泛应用于分子生 物学和微生物学等领域。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的出现更是实现了 PCR技术 从定性到定量的飞跃，避免了传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题。具有特异性强、重复性 好、准确、快速等优点，成为了分子生物学和微生物学领域定量检测的重要方法。采用乳杆 菌种属特异性PCR和实时荧光定量PCR技术，建立简便、快速、准确的益生菌乳制品中干酪 乳杆菌的定性、定量测定方法，可以简化益生菌的检测程序、提高检测效率，能提高我国益 生菌的检测能力，完善保健食品的质量监管，并为益生菌产业的长远发展提供技术保障。
本发明针对益生菌乳制品中含有的干酪乳杆菌，依据参考文献自行设计干酪乳杆 菌的16S rRNA基因序列的种属特异性引物，应用此引物进行种属特异性PCR和实时荧光定 量PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析和实时荧光定量PCR图谱分析，建立益生菌乳制 品中干酪乳杆菌的简便、快速、准确的定性和定量测定方法。
发明内容[要解决的技术问题] 本发明的目的是提供一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性方法。
本发明的另一个目的是提供一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定量方法。
[技术方案] 本发明是通过下述技术方案实现的。 本发明涉及一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性测定方法。该方法的步骤 如下 A、模板DNA的制备 (1)取益生菌干酪乳样品于2.0mL离心管中，加入500iiLTE缓冲液，混合均匀， 再置于液氮中进行冻结，冻结后取出放入65t:水浴中进行融化4-6min，如此反复进行冻融 3-5次； (2)冻融结束后，往其中加入60.0iiL10X (质量体积比)的SDS和10.0iiL10mg/ mL蛋白酶K，在摇床中在温度37t:下以200r/min进行摇动4h ;
(3)加入100. 0 ii L 5M NaCl和100 ii L CTAB麵C1溶液(将4. IgNaCI溶于80ml 水中，再缓慢加入10g CTAB得到的溶液)，65。C水浴lOmin。 (4)然后，加入与在步骤(3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，它 们的体积比分别是25 : 24 : l，混匀，再以10000g/min离心10min，该溶液分成上层水相、 中间固相与下层有机相； (5)吸取上层水相，加入与所述水相等体积的上述苯氯仿和异戊醇混合物抽提一 次，分离上清液； (6)往所述的上清液中加入0. 1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇， 混合均匀静置30min，以10000g离心5min得到总DNA沉淀； (7)所述沉淀用70体积比％乙醇水溶液洗涤2次，再在室温下自然干燥，得到模板 DNA ;然后加入50. Oii L无菌超纯水回溶，在温度-2(TC下保存备用。
B、PCR扩增 反应体系25. Oii L :2. 5ii L 10XPCR Buffer、 1. 0 ii L 25mmol/L Mg2+、 2ii L2. 5mmol/L dNTPs、2. 5 ii L5mmol/L上下游引物、1. 0 ii L 50ng/ii LDNA模板，0. 25uL 5U/ ii LTaq酶，二次蒸馏水补足至25. 0 ii L ;PCR反应条件95。C预变性3min ;95。C变性40S，62。C退火30S，72。C延伸lmin，循 环40次；72t:延伸8min，得到PCR扩增产物，在温度fC下保存；
取3. 0 ii LPCR产物使用1 %琼脂糖凝胶进行检测；
C、结果及判断 检测时设以含有目的扩增片断的质粒DNA作为模板为阳性对照，以灭菌水作为模
板为阴性对照；根据在784bp处出现预期特征条带，确定该益生菌乳制品中含有干酪乳杆
菌，相反地则不含有干酪乳杆菌。 在本发明中，所述的上下游引物分别是 上游引物Cf为5' -CACCGAGATTCAACATGG-3'， 下游引物Cr为5， -GAAGGGCGGAAACCCTCC-3'，扩增片断长度为784bp。 根据本发明的一种优选实施方式，所述的检测是在5V/cm的电压下进行电泳
20-30min，再用EB染色，然后进行紫外照相。 本发明还涉及一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定量测定方法。该方法的步 骤如下 A、样品总RNA的制备 采用Trizol法提取发酵乳制品总RNA，发酵样品500mg在盛有液氮的研钵中研磨 后，迅速加入lmL Trizol试剂，按Trizol试剂盒说明书提取样品RNA。然后用DNaseI处理 两次，确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样品，使用微量紫外分光光度仪测 定浓度，采用1X琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，然后将样本保存于-8(TC ;
B、反转录扩增 反应体系10. 0 ii L :2. 0 ii L 5XPrimerScript Buf f er (TakaRa DRR063A) 、0. 5 ii L PrimerScript RT Enzyme Mix 1、0. 5uL Random 6mers (100 u M)、总RNA ( < 500ng) ， RNase Free dH20补足至10. 0 ii L ; 反转录扩增反应条件37t:反应15min ;85。C变性5S，在温度-2(TC下保存；
C、实时荧光定量PCR 反应体系25. Oil L :12. 5ii L 2 X SYBR Premix Ex Taq ，各0. 5 ii L10 ii mol/L上、 下游引物Cf和Cr， 2. 0 ii L cDNA模板，9. 5 ii LH20 ; 荧光定量PCR反应参数95。C变性25S ;95。C变性IOS，60。C退火22S，40个循环；
在温度4t:保存；每个样品重复3次； D、外标准品的制备和标准曲线的绘制 外标准品的制备提取含有以干酪乳杆菌(L. casei)模式菌株ATCC393 (购自中国 普通微生物菌种保藏中心)目的扩增片断的质粒DNA，紫外分光光度计测定A值后，计算出 拷贝数，进行IO倍系列稀释，梯度稀释至109-102拷贝数/i！ L的浓度，以此作为外标准品进 行荧光定量PCR反应； 标准曲线的绘制以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中 到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到干酪乳杆菌的标准曲线，作为待测样品定 量测定的参照标准；
E、结果及判断 以待测样品cDNA和标准品的DNA为模板，用干酪乳杆菌的种特异性引物，以相同 的体系同时进行干酪乳杆菌的16S rRNA的基因片段的荧光定量PCR扩增；通过标准曲线和 待测样品的Ct值进行益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定量检测。
在本发明中，所述干酪乳杆菌种属特异性引物序列如下
上游引物Cf为5' -CACCGAGATTCAACATGG-3'， 下游引物Cr为5， -GAAGGGCGGAAACCCTCC-3'，扩增片断长度为784bp。
下面将详细地说明本发明。 本发明涉及一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性测定方法。 采用液氮冻融-CTAB法抽提样品中益生菌总DNA和纯培养乳酸菌(包括L. casei
模式菌ATCC393，购自中国普通微生物菌种保藏中心)的总DNA。所述的液氮冻融-CTAB法
是一种本技术领域的技术人员熟知的方法，主要是利用CTAB缓冲液提取生物DNA的方法。 该方法的步骤如下 A、模板DNA的制备 (1)取益生菌干酪乳样品于2.0mL离心管中，加入500iiLTE缓冲液，混合均匀， 再置于液氮中进行冻结，冻结后取出放入65t:水浴中进行融化4-6min，如此反复进行冻融 3-5次。 所述的TE提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制 DNase活性； (2)冻融结束后，往其中加入60. OiiL质量体积比为10X的SDS和10. OiiL 10mg/ mL蛋白酶K，在摇床中在温度37t:下以200r/min进行摇动4h ; 所述的SDS是十二烷基硫酸钠，它是日本关东化学株式会社以商品名SDS销售的
A 口 广PR o 所述的蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香 族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的降解。这种酶经纯化去除了 RNA酶和DNA 酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛。本发明使用的蛋白酶K是AMRESCO公司以商品名Proteinase K销售的产品。
所述的摇床是上海智城分析仪器制造有限公司以商品名Z冊Y-200D恒温培养振 荡器销售的产品。 (3)加入100. 0 ii L 5M NaCl禾P 100 ii L 10% CTAB溶液(将4. IgNaCI溶于80ml
水中，再缓慢加入10g CTAB得到的溶液)，65。C水浴10min。 所述的NaCl提供一个盐环境，使DNA充分溶解而存在于液相中。 所述的CTAB为十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度
的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液
里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，
只是不能沉淀核酸。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 (4)然后，加入与在步骤(3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，它
们的体积比分别是25 : 24 : l，混匀，再以10000g/min离心10min，该溶液分成上层水相、
中间固相与下层有机相。 (5)吸取上层水相，加入与所述水相等体积的上述苯酚、氯仿和异戊醇混合物抽提 一次，分离上清液。 (6)往所述的上清液中加入0. 1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇， 混合均匀，再静置30min，以10000g离心5min，得到总DNA沉淀； (7)所述沉淀用70体积％乙醇水溶液洗涤2次，再在室温下自然干燥，得到模板 DNA ;然后加入50ii L无菌超纯水回溶，在温度-2(TC下保存备用。
B、PCR扩增 PCR扩增是一种体外高效复制DNA的技术，该技术几乎贯穿于现在分子生物学的 各个领域。PCR体系由模板、特异性引物、高温聚合酶、脱氧核糖核酸几部分组成。PCR扩增 过程可以分模板高温变性、引物与模板低温退火、引物在高温聚合酶的作用下延伸。
该反应体系25. Oii L :2. 5ii L 10XPCR Buffer、 1. 0 ii L 25mmol/L Mg2+、 2ii L2. 5mmol/L dNTPs、2.5iiL 5mmol/L上下游引物、1. 0 ii L 50ng/ii L DNA模板，0.25uL 5U/ ii L Taq酶，二次蒸馏水补足至25. 0 ii L。
在本发明中，所述的上下游引物分别是
上游引物Cf为5' -CACCGAGATTCAACATGG-3'， 下游引物Cr为5， -GAAGGGCGGAAACCCTCC-3'，扩增片断长度为784bp。PCR反应条件95。C预变性3min ;95。C变性40S，62。C退火30S，72。C延伸lmin，循
环40次；72t:延伸8min，得到PCR扩增产物，在温度fC下保存； 取3. Oii LPCR产物使用1%琼脂糖凝胶进行检测。琼脂糖凝胶电泳图谱分析是使 用UVP公司以商品名CDS-8000凝胶成像仪销售的仪器进行的。
C、结果及判断 检测时设以含有目的扩增片断的质粒DNA作为阳性对照模板，以灭菌水作为阴性 对照模板；根据在784bp处出现预期特征条带，确定该益生菌乳制品中含有干酪乳杆菌，相 反地则不含有干酪乳杆菌。具体可参见附图l。 本发明还涉及一种益生菌乳制品中干 乳杆菌的快速定量测定方法。该方法的步 骤如下
A、样品总RNA的制备 采用Trizol法提取发酵乳制品总RNA，发酵样品500mg在盛有液氮的研钵中研磨 后，迅速加入lmL Trizol试剂，按Trizol试剂说明书提取样品RNA。然后用DNasel处理 两次，确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样品，测定浓度，在温度-S(TC下保 存； 所述的Trizol试剂是由Invitrogen公司专供提取RNA的产品；DNase I是TaKaRa 公司产品；此过程中使用的氯仿、异丙醇、无水乙醇等试剂是天津市化学试剂三厂生产的产 RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，用DEPC_dH20溶解的RNA样品可以 直接使用例如NanoDrop-1000微量紫外分光光度计测定在260nm波长处的RNA浓度和纯 度，DEPC-H20为空白对照，RNA浓度可以直接读数，RNA纯度通过0D26。/28。来检测。若比值在 1. 9-2. 1间，认为纯度较好，比值小于1. 8说明有杂蛋白质较多；比值大于2. 2，则表明RNA
已经降解。 RNA完整性通过1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
B、反转录扩增 反应体系10. 0ii L :2. 0ii L5XPrimerScript Buffer(TakaRa DRR063A) 、0. 5 ii L PrimerScript RT Enzyme Mix I、0. 5uL Random 6mers (100 u M)、总RNA ( < 500ng) ， RNase Free dH20补足至10. 0 ii L ; 反转录扩增反应条件37t:反应15min ;85"C变性5S，在温度-2(TC下保存；
C、实时荧光定量PCR 反应体系25. Oil L :12. 5ii L2XSYBR⑧Premix Ex TaqTM，各0. 5 ii L10 ii mol/L上、 下游引物Cf和Cr， 2. 0 ii L cDNA模板，9. 5 ii L dH20 ; 荧光定量PCR反应参数95。C变性25S ;95。C变性10S， 6(TC退火22S， 40个循环；
在温度4t:保存；每个样品重复3次； D、外标准品的制备和标准曲线的绘制 外标准品的制备提取含有以干酪乳杆菌模式菌株ATCC393目的扩增片断的质粒 DNA，紫外分光光度计测定A值后，计算出拷贝数，进行IO倍系列稀释，梯度稀释至109_102 拷贝数/uL的浓度。 标准曲线的绘制将外标准品进行10倍系列稀释，使其成为具一定梯度拷贝数含 量的模板，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应。以不同拷贝数的阳性模板的对数为 横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到干酪乳杆菌的标 准曲线(参见附图2和3)，作为待测样品定量测定提供参照标准；
E、结果及判断 以待测样品的cDNA和标准品的DNA为模板，用干酪乳杆菌的种特异性引物，以相
同的体系同时进行干酪乳杆菌的16S rRNA的基因片段的荧光定量PCR扩增；通过标准曲线
和待测样品的Ct值进行益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定量检测。 实时荧光定量PCR图谱分析是使用Bio-Red公司以商品名iQ 5销售的仪器进行的。 在本发明中，所述干酪乳杆菌种属特异性引物序列如下
上游引物Cf为5' -CACCGAGATTCAACATGG-3'， 下游引物Cr为5， -GAAGGGCGGAAACCCTCC-3'，扩增片断长度为784bp。 本发明益生菌乳制品中干酪乳杆菌快速定量测定方法的误差分析如下 与传统的PCR相比，定量PCR更加快速、灵敏，并能有效地减少实验过程中产生的
交叉污染。由于定量PCR具有特异性强、敏感性高、精确性好的优点，所以其操作每一过程
都可能造成定量PCR实验结果的可靠性差。如样本采集和存储、提取RNA、定量PCR检测过
程的加样等，所以应用定量PCR技术时，务必做到实验的标准化、合理化、细致化和有效化，
使定量PCR技术更好地为我们服务。 标准品的制备是建立实时荧光定量PCR的关键环节，常用的标准品有三种构建方
法一是按照扩增片段序列人工合成一段寡核苷酸；二是回收纯化含有荧光定量PCR扩增
片段的常规PCR扩增产物；三是将含有荧光定量PCR扩增片段克隆到质粒中回收质粒。本
发明选择第三种方法，构建了含有目的条带的重组质粒作为标准品，以此为标准品制作标
准曲线对未知样品的绝对量(拷贝数)进行测定。[有益效果] 本发明的有益效果是 可以在不进行益生菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量检测益生菌 乳制品中的干酪乳杆菌，整个过程对益生菌乳制品中干酪乳杆菌的检测程序简单、检测效 率高、准确性好。
图1、干酪乳杆菌的引物特异性验证及样品的定性检测 M :DL2000Marker ;1. pCT作为阳性对照；2. H20作阴性对照；3. L. casei ATCC393 ; 4.酸奶样12#(L. casei Zhang禾口 Bifidobacterium animalisSubsp. Lactis V9混合发 酵)；5.酸奶样36#(从西藏采的传统发酵乳)；6. L. plantarum 1. 2437 ;7. L. rhamnosus 1. 2134 ;8.L.acidophilus ATCC 4356。 图2、干酪乳杆菌标准品的扩增曲线，从左到右曲线包含的拷贝数为109到102。
图3、实时荧光定量检测干酪乳杆菌的标准曲线和待检样本的定量检测
图4、实时荧光定量检测干酪乳杆菌的融溶解曲线单峰图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性检测 该实施例使用含有目的扩增片断的质粒pCT作为阳性对照；dH20作阴性对照；另 外使用L. casei ATCC393、L plantarum 1. 2437、L. rhamnosusl. 2134、L. acidophilus ATCC 4356、酸奶样12#(L. casei Zhang禾P Bifidobacterium animalis Subsp. Lactis V9混合发 酵)、酸奶样36#(从西藏采的传统发酵乳)、作为样品进行。 所述的L. rhamnosus 1. 2134、 L. plantarum 1. 2437购自中国普通微生物菌种保 藏中心；L. acidophilus ATCC 4356、 L. casei ATCC393购自美国American Type CultureCollection ;L casei Zhang禾口 Bifidobacterium animalisSubsp丄actis V9为内蒙古农
业大学"乳品生物技术与工程"教育部重点实验室保藏。
a.模板DNA的制备采用液氮冻融-CTAB法抽提样品DNA，具体步骤如下 (1)取0.5g益生菌发酵乳样品或MRS培养基培养的乳酸菌(包括模式菌 L. caseiATCC393)于2. 0mL离心管中，加入500 y L TE缓冲液，混合均匀，再置于液氮中进行 冻结，冻结后取出放入65t:水浴中进行融化5min，如此反复进行冻融4次；
(2)冻融结束后，往其中加入60. 0 ii L10% (质量体积比)的SDS和10. 0 y L10mg/mL 蛋白酶K，在摇床中在温度37t:下以200r/min进行摇动4h ; (3)加入100. 0 ii L 5M NaCl和100 ii LCTAB/NaCl (将4. IgNaCI溶于80ml水中，再 缓慢加入10g CTAB得到的溶液)，65。C水浴lOmin。 (4)然后，加入与在步骤(3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，它 们的体积比分别是25 : 24 : l，混匀，再以10000g/min离心10min，该溶液分成上层水相、 中间固相与下层有机相； (5)吸取上层水相，加入与所述水相等体积的上述苯氯仿和异戊醇混合物抽提一 次，分离上清液； (6)往所述的上清液中加入0. 1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇， 混合均匀静置30min，以10000g离心5min得到总DNA沉淀； (7)所述沉淀用70体积％乙醇水溶液洗涤2次，再在室温下自然干燥，得到模板 DNA ;然后加入50. Oii L无菌超纯水回溶，在温度-2(TC下保存备。
b. PCR检测 反应体系25. Oii L :2. 5ii L 10XPCR Buffer (含Mg2+) ， 2 ii L 2. 5mmol/Ld證s，共 2. 5 ii L 5mmol/L上下游引物(Cf和Cr) ， 1. 0 ii L 50ng/ ii L DNA模板，0. 25 ii L 5U/ ii L Taq 酶(TakaRa)，用二次蒸馏水补足至25. 0 y L。将PCR产物于1 %琼脂糖凝胶中以5V/cm的电 压，电泳20-30min， EB染色，紫外拍照。 c.将L. casei ATCC393的PCR产物与pMD18连接转化DH5 a ，获得阳性克隆子pCT。
d.结果及判断 经干酪乳杆菌的种属特异性引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检验结果见图l，泳 道1以含有目的扩增片断的质粒PCT作为阳性对照，泳道2以灭菌水作为阴性对照。 一般 认为阳性特征在784bp处出现预期扩增条带，说明此样本中含有干酪乳杆菌；阴性对照无 特征条带。泳道3为干酪乳杆菌的标准菌，泳道4中样本12#是本实验室利用2株益生菌 (L.casei Zhang禾P Bifidobacterium animalis Subsp. Lactis V9)混合发酵制得的酸奶， 其中含有干酪乳杆菌，这些结果与预期结果一致，具有阳性特征；泳道5为从西藏采的自然 发酵乳36#样本，结果为阴性，说明此样本不含L. casei。泳道6、7、8为L. casei外的其他 种乳酸菌，结果为阴性，说明引物特异性好，与预期结果一致。
实施例2. 益生菌乳制品中干酪乳杆菌的定量测定 对实施例1中提到的不同样品进行了干酪乳杆菌的定量测定。其测定步骤如下
a.样品总RNA的制备
采用Trizol法提取发酵乳制品500mg在盛有液氮的研钵中研磨后，迅速加入lmL Trizol试剂，按Trizol试剂盒说明书提取样品RNA，然后用DNasel处理两次，确保完全消 除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样品，按照本申请说明书说明的方法进行浓度测定， RNA完整性通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。
b.反转录扩增 反应体系10. Oil L :2. Oil L5XPrimerScript Buf f er (TakaRa DRR063A) 、0. 5 ii L PrimerScript RT Enzyme Mix I、0. 5uL Random 6mers (100 u M)、总RNA ( < 500ng) ， RNase Free dH20补足至10. 0 ii L ; 反转录扩增反应条件37t:反应15min ;85。C变性5S，在温度-2(TC下保存；
c.实时荧光定量PCR 荧光定量PCR按照SYBI^PrimeScriptTM RT-PCR Kit (大连宝生物工程有限公司， TaKaRa DRR063A)说明书进行。反应体系25. 0 ii L :12. 5 ii LSYBR Premix Ex TaqTM(2X)、 各0. 5 ii L 10 ii mol/L上、下游引物(Cf和Cr) 、2. 0 y L cDNA模板、9. 5 y L 二次蒸馏水。荧 光定量PCR反应参数95。C变性25S ;95。C变性5S，6(TC退火22S，40个循环；在温度4。C保 存。 d.外标准品的制备和标准曲线的绘制 提取以含有目的扩增片断的质粒pCT总DNA，紫外分光光度计测定A值后，计算出 拷贝数，做10倍系列稀释，梯度稀释至109-102拷贝数/uL的浓度，以此作为外标准品进行 荧光定量PCR反应，见附图2。以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程 中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到干酪乳杆菌的标准曲线，见附图3。
e.待测样本的检测 以待测样品的cDNA和标准品DNA为模板，用实施例1描述的干酪乳杆菌的种特异 性引物，以相同的体系同时进行干酪乳杆菌的16S rRNA的基因片段的荧光定量PCR扩增， 通过标准曲线和采用Bio-Red公司的iQ 5多重实时荧光定量PCR仪的计算机软件分析进 行益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定量检测，见附图3 。
f、结果和分析 由图2可见，干酪乳杆菌标准品的扩增曲线光滑。由图3可见，Ct值和拷贝数呈较 好的线性关系，以模板初始拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制出的荧光定量PCR 标准曲线方程Y = -3. 151X+39(Y代表Ct值，x代表模板初始拷贝数的对数)，模板初始拷 贝数与Ct值之间线性相关系数为0. 994，斜率为-3. 151，所建立的L. casei标准曲线符合 Real-Time PCR定量的要求。由图4可见，样品扩增产物的融解曲线一致，且都为单一峰型 的曲线，证明荧光染料的定量反应系统特异性良好，引物和PCR反映条件都适合进行荧光 定量。 把待测样品的Ct值带入标准曲线方程，以确定未知样品的量。结果与分析误差结 果一并列于下表l中。 表l L.caaei发酵乳样品的Real-time测定结果
11样本X+SD拷贝数/g发酵乳
L caseiZhang单菌发酵9. 5±0. 6
L caseiZhang禾口 Bif idobacteriumanimalisSubsp. LactisV9混合发酵8. 9±0. 7 由表1的结果清楚地表明，定量PCR能准确定量发酵乳中活性干酪乳杆菌。 序列表 〈110〉内蒙古农业大学 〈120〉益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性、定量测定方法 〈130〉 〈160>2 〈210>1 〈211>18 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉对人工序列的描述本发明所设计和使用的上游引物Cf 。 〈400〉 1 CACCGAGATT CAACATGG 18 〈210>2 〈211>18 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉对人工序列的描述本发明所设计和使用的下游引物Cr。 〈400>2 GAAGGGCGGA AACCCTCC 18
权利要求
一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性测定方法，其特征在于该方法的步骤如下A、模板DNA的制备(1)取益生菌干酪乳样品于2.0mL离心管中，加入500.0μL TE缓冲液，混合均匀，再置于液氮中进行完全冻结，冻结后取出放入65℃水浴中进行融化4-6min，如此反复进行冻融3-5次；(2)冻融结束后，往其中加入60.0μL 10％(质量体积比)SDS和10.0μL10mg/mL蛋白酶K，在摇床中在温度37℃下以200r/min进行摇动4h；(3)加入100.0μL 5M NaCl和100.0μL10％CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min；(4)加入与在步骤(3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，它们的体积比分别是25∶24∶1，混匀，再以10000g/min离心10min，该溶液分成上层水相、中间固相与下层有机相；(5)吸取上层水相，加入与所述水相等体积的上述苯酚、氯仿和异戊醇混合物抽提一次，分离上清液；(6)往所述的上清液中加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇，混合均匀，再静置30min，以10000g/min离心5min，得到总DNA沉淀；(7)所述沉淀用70％(体积比)乙醇水溶液洗涤2次，再在室温下自然干燥，得到模板DNA；然后加入50.0μL无菌超纯水回溶，在温度-20℃下保存备用；B、PCR扩增反应体系25.0μL2.5μL 10×PCR Buffer、1.0μL 25mmol/L Mg2+、2.0μL2.5mmol/L dNTPs、2.5μL 5mmol/L上下游引物、1.0μL 50ng/μL DNA模板，0.25uL 5U/μL Taq酶，二次蒸馏水补足至25.0μL；PCR反应条件95℃预变性3min；95℃变性40S，62℃退火30S，72℃延伸1min，循环40次；72℃延伸8min，得到PCR扩增产物，在温度4℃下保存；取3.0μL PCR产物使用1％琼脂糖凝胶进行检测；C、结果及判断检测时设以含有目的扩增片断的质粒DNA作为模板为阳性对照，以灭菌水作为模板为阴性对照；根据在784bp处出现预期特征条带，确定该益生菌乳制品中含有干酪乳杆菌，相反地则不含有干酪乳杆菌。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的上下游引物分别是 上游引物Cf为5' -CACCGAGATTCAACATGG-3'，下游引物Cr为5' GAAGGGCGGAAACCCTCC-3'，扩增片断长度为784bp。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于含有目的扩增片断的质粒DNA是通过将 L. casei ATCC 393的PCR产物与pMD18连接转化大肠杆菌DH5 a获得的阳性克隆子。
4. 一种益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定量测定方法，其特征在于该方法的步骤如下A、样品总RNA的制备采用Trizol法提取发酵乳制品总RNA :发酵样品500mg在盛有液氮的研钵中研磨后， 迅速加入lmL Trizol试剂，按Trizol试剂盒说明书提取样品RNA，然后用DNaseI处理两次，确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样品，使用微量紫外分光光度仪测定 浓度，采用1X琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，然后将样本保存于-8(TC ;B、 反转录扩增反应体系10. 0ii L :2. 0ii L 5XPrimerScript Buf f er (TakaRa DRR063A) 、0. 5 ii L PrimerScript RT Enzyme Mix I、0.5uL Random 6mers (100 u M) 、 TotalRNA ( < 500ng)， RNase Free dH20补足至10. 0 ii L ;反转录扩增反应条件37t:反应15min ;85。C变性5S，在温度-2(TC下保存；C、 实时荧光定量PCR反应体系25. 0ii L :12. 5ii L2xSYBR PremixEx Taq ，各0. 5 y L 10践ol/L上、下 游引物Cf和Cr， 2. 0 ii L cDNA模板，9. 5 ii LdH20 ;荧光定量PCR反应参数95。C变性25S ;95。C变性10S，6(TC退火22S，40个循环；每个样品重复3次；在温度4t:保存；D、 外标准品的制备和标准曲线的绘制外标准品的制备提取含有以干酪乳杆菌模式菌株ATCC393目的扩增片断的质粒DNA， 紫外分光光度计测定A值后，计算出拷贝数，进行IO倍系列稀释，梯度稀释至109-102拷贝 数/uL的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应；标准曲线的绘制以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达 荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到干酪乳杆菌的标准曲线，作为待测样品定量测 定的参照标准；E、 结果及判断以待测样品cDNA和标准品的DNA为模板，用干酪乳杆菌的种特异性引物，以相同的体 系同时进行干酪乳杆菌的16S rRNA的基因片段的荧光定量PCR扩增；通过标准曲线和待测 样品的Ct值求出益生菌乳制品中干酪乳杆菌的起始模板量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述干酪乳杆菌种属特异性引物序列如下上游引物Cf为5' -CACCGAGATTCAACATGG-3'，下游引物Cr为5' -GAAGGGCGGAAACCCTCC-3'，扩增片断长度为784bp。
全文摘要
本发明涉及一种在益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性、定量测定方法。该方法针对益生菌乳制品中含有的干酪乳杆菌，自行设计干酪乳杆菌的16S rRNA基因序列的种属特异性引物，应用此引物进行种属特异性PCR和实时荧光定量PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析和实时荧光定量PCR图谱分析，建立益生菌乳制品中干酪乳杆菌的简便、快速、准确的定性和定量测定方法。
文档编号G01N21/64GK101712989SQ200910177910
公开日2010年5月26日 申请日期2009年9月21日 优先权日2009年9月21日
发明者包秋华, 张和平, 张家超 申请人:内蒙古农业大学