专利名称：一种检测双烯雌酚的金标免疫层析半定量检测试纸的制作方法
技术领域：
本发明免疫检测和兽药残留检测技术领域。本发明涉及一种雌激素双烯雌酚残
留的快速检测工具，具体而言，本发明涉及一种双烯雌酚金标免疫层析半定量检测试纸 及其制备方法和使用方法。
背景技术：
双烯雌酚(dienestrol， DE)是一种人工合成的非甾体类雌激素，其化学名为3， 4-双(对羟基苯基)-2， 4-己二烯，含有酚羟基，是一种弱酸性化合物，主要应用于提高 奶牛产奶量和畜禽动物的生长催肥。相对于天然雌激素，人工合成雌激素通常比较稳 定，在体内滞留时间长，易在人和动物的脂肪及其他组织中残留，因此，可以通过食物 链危害人类健康。具体表现为女性幼儿提前发育，男性儿童乳腺发育成女性化；男性生 殖发育异常与病变及女性乳腺癌和子宫内膜异位症发生率上升，同时具有致癌作用。目 前，世界上许多国家禁止其应用。 现有的双烯雌酚检测方法为色谱法，但是这些方法需要有完善的实验室，有经 验的技术人员及昂贵的仪器设备，且检测过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于 抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。 基于此原理建立的酶联免疫吸附测定技术具有便捷，快速，灵敏等特点，但是该技术要 求检测人员具有较高的技术水准，也需要酶标仪等简单的设备，分析时间一般l-4小时， 仍然有其局限性。因此，需要我们研制更加简单快捷方便的检测工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便、快捷、灵敏、价格低廉的双烯雌酚免疫层析 半定量检测试纸及其使用方法。 本发明提供的双烯雌酚金标免疫层析半定量检测试纸是在涂有不干胶不吸水的 聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)背衬上依次贴有样品吸收垫、胶体金标记垫、检测反 应垫和吸水垫。 所述的胶体金标记垫为玻璃纤维或醋酸纤维或尼龙膜，其上标记的物质为双烯 雌酚多克隆抗体。 所述的检测反应垫上面包被有双烯雌酚人工抗原作为检测线，同时还包被有第
二抗体作为质控线。本发明中双烯雌酚人工抗原为双烯雌酚与载体蛋白的偶联物，载体
蛋白一般用牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)。 第二抗体是与双烯雌酚抗体不同种动物的抗双烯雌酚抗体的抗体。 本发明所述的双烯雌酚免疫层析半定量检测试纸的各部分制备方法与及功能如
下 1、背衬为一面涂有不干胶的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组 成部分的功能。
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2、样品吸收垫的制备将滤纸或玻璃纤维纸浸入pH7.4的PBS溶液中2分钟， 取出8(TC烘干或其他方式干燥，作为样品吸收垫，便于样品溶液向上移动。
3、胶体金标记物垫的制备该部分起承载胶体金标记抗体的作用。包括金溶胶 的制备，双烯雌酚抗体的金标记，胶体金标记物的处理。 (1)胶体金溶胶的制备将HAuCl4先配制成0.01 %水溶液，取100ml加热至 沸。搅动下准确加入1.2ml的1 %柠檬酸三钠(Na3C6H507.2H20)水溶液。继续加热煮沸 15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑 色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2 3min。冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。 电子显微镜观察金溶胶颗粒的均匀度，经测定所制备的胶体金溶胶颗粒直径为40nm。
(2)胶体金标记双烯雌酚抗体取两支试管，向其中各加入1.2ml步骤(1)中制 备的40nm胶体金溶胶，加入适量25mMK2C03把pH调整为90，分别加入10iU浓度 为lmg/ml双烯雌酚抗体，混匀，室温放置10min，分别加入12iU 2% PEG20000，室温 放置5min， 10000rpm离心20min，轻轻吸除上清，用20 y 1 PBS溶液重悬浮松散的胶体 金沉淀，并集中到新管中，分别加20iU甘油，充分混匀，即为胶体金标记双烯雌酚抗 体，-201:保存备用。 (3)胶体金标记垫的制备用Biodot点膜机将胶体金标记双烯雌酚抗体喷点在胶 体金结合垫上，将双烯雌酚-BSA偶联物和羊抗兔IgG包被在硝酸纤维素膜的检测区和质 控区，充分干燥。 4.吸水垫的制备将玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸室温干燥后，即为吸水垫。吸 水垫的主要作用是吸收移动上来的多余样品溶液。 本发明所述双烯雌酚免疫层析半定量检测试纸的组装在背衬上依次贴有样品 吸收垫、胶体金标记垫、检测反应垫和吸水垫，即得本发明所述的双烯雌酚免疫层析半 定量检测试纸。检测时，可根据需要将所述试纸切成合适宽度的试剂条。
另一方面，本发明提供了一种检测双烯雌酚残留的方法，该方法优选使用本发 明所述的检测试纸。所述检测方法包括(l)任选地，检测前先将冻存的待检样本和试剂 条在室温下放置一段时间，通常为l小时以上，使其恢复至室温；(2)将试纸条浸入样品 溶液4-6秒，液面不得超过试纸条上的MARK线，平放在试验台上，5分钟后观察结果。 如果是试剂板，在加样孔中滴加3滴样品溶液，5分钟后即可观察结果。结果判断如 果样品中有双烯雌酚存在，则只出现红色的质控线条带，此时结果为阳性。如果检测线 和质控线都出现红色条带，则结果为阴性。如果质控线没有出现红色条带则试剂失效。
具体实施例方式
检测线包被有浓度为0.2-20 ii g/ml的双稀雌酚单克隆抗体或双稀雌酚检测用抗原 l条，宽lmm;两条线包被有浓度为2-6mm。当检测线比对照线颜色浅时，则样品为阳 性。对照线始终显色，若对照线不显色，表明试纸失败。
本发明的有益效果 ①特异性强。该试纸检测方法特异性极强，与己稀雌酚、雌二醇等药物基本没
有交叉反应，避免了其它药物对检测的干扰。 ②灵敏度高。本试纸最低检测限为10iig/kg。
③能够实现半定量检测。本检测方法不但能够定性检测，更重要的是根据检测 线颜色与对照线颜色对比达到定量检测目的。 ④操作简单方便。对牛奶、动物尿液可直接检测，肉类等组织样品简单处理后 即可检测。本试纸不需任何专业培训，不需任何仪器设备，普通人员都可操作，只要将 试纸插入检测液中，用肉眼判读。因此，本方法适用面宽，卫生检测监督部门、动物养 殖单位、屠宰场以及消费者个人均可使用。 ⑤速度快，通量大，颜色稳定。试纸插入样液中，5min以后便可观察结果，一 个人可以同时、连续检测，检测通量远远高于HPLC法，比双稀雌酚ELTSA试剂盒检测 速度则快50倍以上，并且其颜色可永久保存，而不会象ELISA底物那样很快就变色。
⑥温度适宜范围宽。在4-35t:均可使用，结果正常，不需在低温下进行，不需 采取保温措施，室内野外均可使用。 ⑦试纸保质期长。据加速老化试验结果，干燥条件下试纸保质期可达2年。
⑧成本低廉。本方法检测成本远远低于双稀雌酚ELISA试剂盒检测法，随着规 模化生产后，其成本还会大幅度降低。 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保
护范围构成任何限制。 实施例 实施例1免疫原的合成及免疫血清的制备
1.1双稀雌酚人工抗原的制备 双稀雌酚偶合抗原分为免疫用抗原和检测用抗原，前者用于免疫动物，后者用
于抗体制备中抗体的检测筛选和试纸制备中的胶体金标记或检测线包被。 免疫用抗原制备称取26.6毫克(O.lmmol)双烯雌酚溶于lmlDMSO中，充分搅拌使其完全溶解， 加入11.7毫克氯乙酸钠，室温搅拌1小时； 称取50毫克KLH，以O.lmol/L的PBS溶解，缓慢滴加DMSO充分搅拌，使其 占总溶液的50%，将氯乙酸钠活化的双烯雌酚加入到KLH溶液中，以10M氢氧化钠调溶 液pH值至ll，加入EDC0.2-0.3M(约100mg)，搅拌反应过夜，即得双烯雌酚-KLH偶联物。然后，将偶联物过SephadexG-25M凝胶层析纯化，用0.01M pH 7.4PBS三倍柱床
体积平衡，调节流速至3ml/min，样品浓縮至5ml加入到平衡好的层析柱中层析提纯偶联
物，洗脱液用pH7.4 0.01MPBS。 提纯后的免疫原分装后-20°〇冻存。 1.2包被用抗原的制备 称取26.6毫克(O.lmmol)的双烯雌酚溶于lml无水吡啶中，加入10毫克琥珀酸 酐，室温下搅拌4小时，W吹干，以一定体积DMSO复溶。 称取40毫克卵清蛋白(OVA)，以O.lmol/L的PBS溶解，缓慢滴加DMSO充分搅 拌，使其占总溶液的50%，将琥珀酸酐活化的双烯雌酚加入到OVA溶液中，以10M氢氧 化钠调溶液pH值至ll，加入EDC0.2-0.3M(约100-150mg)，搅拌反应过夜，即得双烯雌 酚-卵清蛋白偶联物(DE-OVA)。
然后，将上述DE-OVA过SephadexG-25M凝胶层析纯化，用0.01M pH 7.4PBS三
倍柱床体积平衡，调节流速至3ml/min，样品浓縮至5ml加入到平衡好的层析柱中层析提 纯偶联物，洗脱液用pH 7.4 0.01M PBS。
提纯后的包被抗原分装后-2(TC保存。
1.3双稀雌酚单克隆抗体制备 取健康4周龄雌性二级Balb/c小鼠5只进行免疫。第一次基础免疫将O.lmL双 稀雌酚免疫用抗原与等量完全弗氏佐剂用搅拌器充分混匀乳化，进行腹腔注射，注射量 0.2mL/只。2周后开始进行加强免疫，佐剂换为不完全弗氏佐剂，每隔两周加强免疫一 次，末次免疫3d后取脾脏融合。先将HAT培养液、TMDM不完全培养液、IMDM完全培养液和50% PEG-2000
溶液于37t:水浴中预温，同时将另一盛水的烧杯放入37t:水浴中预温。将上述制备好的 脾细胞和骨髓细胞和脾细胞按1 : 4的比例混合，在50mL的塑料离心管内用不完全培养 液洗1次，1000r/min离心8min，弃上清，用滴吸净残留液体。置37。C水浴中，将吸管 插入管底，在60s内边搅拌边加入预热的1M1、 50%PEG-2000。 静置60s后，于37"水 浴中60s内加入10mL预热的完全培养液。轻轻轻悬浮一次，以1000r/min离心6min弃 去上清，先用6mL左右完全培养液。轻轻混匀，将混匀悬液接种于有饲养细胞的96孔 板中，每孔O.lmL， 一次接种8块板。将培养板置于37t:、 5%0)2培养箱中培养。融 合后7d，用HT培养液半量换液1次，在13d后根据增值情况改用20XNBS的完全培养 液。约7d后出现杂交瘤细胞集落，细胞大、圆且透亮。待集落长至孔底l/3时，在培 养板的盖板上克隆生长标记，此时即可取上清检测相应的特异性抗体。细胞完全克隆化 后，将细胞注入小鼠腹腔，间隔一段时间等腹水足够多时，取腹水，将腹水用蛋白A免 疫亲和层析纯化后，即得到双稀雌酚单克隆抗体。
1.4单克隆抗体效价和特异性测定
1.4.1间接ELISA检测抗体效价 以10 ii g/ml的DE-BSA按每孔100 ii 1包被酶标板，4"包被24h，洗涤5次，拍 干，每孔加入200iU2X的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液(封闭液)，fC下封闭12h，洗涤3 次，拍干。加入不同稀释倍数的单克隆抗体100iU， 37t:孵育2h，洗涤三次，立即加入 100iU酶标羊抗鼠抗体，37t:孵育30min，洗涤三次，加50 y 1显色剂A液和50 y 1显色 剂B液，室温避光作用15min，加50 y 1终止液终止反应，酶标仪检测OD值(450nm)。 同时设置阴性血清对照孔和平行重复孔。抗体以1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、 16000倍、32000倍稀释。以两倍于阴性血清OD值的抗体稀释度为抗体效价。检测结 果见表-1 表-1抗体效价检测结果(平均OD值)
抗体稀 释倍数10002000 德OO 8000160測32000阴性对照
01.)但.2. t)822,0671.574 1.2750, 6390.2890. 0870, 048
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从表-l可知，抗体效价为32000以上，满足实验要求。
1.4.2间接竞争ELISA检测抗体特异性 ELISA操作方法同l。 每孔加入100iU不同浓度的游离双烯雌酚与包被物竞 争随后加入抗体，得出不同的OD值。根据1.4.1的结果，所用多克隆抗体最佳浓度为 1 : 2000。双烯雌酚系列浓度和试验孔的排列顺序见表-2，同时设置平行重复孔和空白 对照孔。以0抑制孔的OD值为最大值B。，其它抑制浓度孔OD值为B， B/B。二50X时 对应的双烯雌酚浓度为此抗体的IC5。值。检测结果见表-2 [OO55] 表-2抗体特异性检测结果(OD平均值)
抑制浓度yg013927空白对照
s爆雌驗2, 047l.卿1.5450,9280,德20J10. 053
己烯雌齢2,1182,,2.0672.0552,1282. 0750. 06
己烷雌酚2,1032, 0682.0142.0162.1152, 0560.057 由表-2数据可知，双烯雌酚多克隆抗体IQ。值在9yg/L左右，其它几个类似物 的IQ。值在所试验的浓度范围内未见明显抑制，此范围内，几乎没有交叉反应性，表明 本发明制备的抗体特异性符合要求。 实施例2双烯雌酚免疫层析半定量检测试纸的制备
2.1样液吸收垫处理将滤纸或玻璃纤维浸入0.2mol/L pH7.4的PBS中2min，取出，8(TC烘干或其他
方式干燥，即成样液吸收垫。 2.2胶体金标记垫的制备和处理 胶体金标记垫的制备和处理包括胶体金溶胶制备、胶体金标双稀雌酚抗体、胶 体金标记垫处理。 胶体金溶胶制备将HAuCl4先配制成0.01X水溶液，取100ml加热至沸。搅动 下准确加入1.2ml的1 %柠檬酸三钠(Na3C6H507 2H20)水溶液。继续加热煮沸15min。 此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随 后逐渐稳定成红色。全过程约2 3min。冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。电子 显微镜观察金溶胶颗粒的均匀度，经测定所制备的胶体金溶胶颗粒直径为40nm。
胶体金标记双稀雌酚单克隆抗体制备取两支试管，向其中各加入1.2ml步骤 (1)中制备的40nm胶体金溶胶，加入适量25mMK2C03把pH调整为9.0，分别加入10iU 浓度为lmg/ml双烯雌酚抗体，混匀，室温放置10min，分别加入12 y 1 2% PEG20000， 室温放置5min， 10000rpm离心20min，轻轻吸除上清，用20 y 1 PBS溶液重悬浮松散的胶 体金沉淀，并集中到新管中，分别加20iU甘油，充分混匀，即为胶体金标记双烯雌酚抗 体，-201:保存备用。 金标双稀雌酚单克隆抗体倒入一槽中，将玻璃纤维或滤纸浸入lmin，取出，室 温干燥或真空冷冻干燥，即成为胶体金标记垫。
2.3双烯雌酚免疫层析半定量检测试纸的组装 在背衬上依次贴有样品吸收垫、胶体金标记垫、检测反应垫和吸水垫，即得本发明所述的双烯雌酚免疫层析半定量检测试纸。检测时，可根据需要将所述试纸切成合适宽度的试剂条。 实施例3双烯雌酚金标免疫层析半定量检测试纸灵敏度实验取双稀雌酚浓度分别为5ng/ml、 10ng/ml、 15ng/ml的标准溶液，每个浓度准备
IO份制备好的试纸条，按要求将试纸条插入上述溶液中，5分钟后观察结果。 结果显示插入10ng/ml和15ng/ml的标准溶液中的试纸条上的检测线不可见，
而插入5ng/ml标准溶液的试纸条上的出现的检测线颜色与对照线差别不明显。 从此可见，本发明所述的双烯雌酚金标免疫层析半定量检测试纸灵敏度很高，
检测限为10ng/ml。 实验例4试纸条保存期试验 试纸条保存条件为2-『C，经过12个月的测定，试纸条的质量没变化、对照线、检测线显色正常，检测灵敏度没有变化。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试纸条在37t:保存条件下放置两周，进行破坏实验，结果表明该试纸条各项指标完全正常。从以上结果可得出试纸条可以在2-『C保存12个月以上。
实施例5样品中双烯雌酚添加检测试验
5.1、样品前处理 准确称取lg鱼肉样品于5ml离心管中，研磨成粥状，加入双稀雌酚标准品100ng，混匀，随后加入10ml甲醇超声振荡1小时，离心取上清，氮气吹干，用lmlDMSO溶解样品，用样品稀释液稀释10倍，制备样品溶液。
5.2、用试纸条进行检测 将试纸条插入上述制备好的溶液中，5分钟后观察结果，出现一条带的为阳性，出现两条带的为阴性。结果表明，添加样品只有一条带显色，样品判定为阴性。
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权利要求
一种检测双烯雌酚的一种检测双烯雌酚的金标免疫层析半定量检测试纸，其中包括双烯雌酚特异性单克隆抗体、双烯雌酚-载体蛋白偶联物。
2. 根据权利要求1所述的双烯雌酚的金标免疫层析半定量检测试纸，其特征在于 所述检测试纸还包括背衬、背衬上的样品吸收垫、胶体金标记物垫、层析垫及吸水垫。
3. 根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于所述双烯雌酚特异性抗体为单克 隆抗体。
4. 根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于所述的载体蛋白为牛血清白蛋 白、卵清蛋白或钥孔铜兰蛋白。
5. 根据权利要求2所述的检测试纸，其特征在于所述的层析垫上包被有双烯雌 酚-载体蛋白偶联物和第二抗体。
6. 根据权利要求5所述的检测试纸，其特征在于所述的双烯雌酚-载体蛋白偶联物 包被线为检测线。
7. 根据权利要求5所述的检测试纸，其特征在于所述的第二抗体包被线为质控线。
8. —种检测样品中双烯雌酚含量的方法，包括步骤(1) 样品前处理，采用粉碎、匀浆等方法利用有机溶剂提取样品中的双稀雌酚。(2) 用权利要求l-7任一所述的检测试纸进行检测，将检测试纸插入样品溶液中，五 分钟后观察结果。(3) 分析检测结果，只出现一条红色带样品为阳性，出现两条带为阴性。
全文摘要
本发明提供了一种双烯雌酚金标免疫层析半定量检测试纸，该试纸的背衬上粘帖有样品吸收垫、胶体金标记物垫、层析垫及吸水垫。检测反应垫上包被有双烯雌酚抗原作为检测线，同时包被有第二抗体作为质控线。本发明检测试纸的特异性强，能够实现半定量检测，4-40℃都可使用，5分钟以后即可得出结果，适合于卫生、质检、海关、家畜养殖场以及食品企业对动物源性食品样品中的双烯雌酚药物进行快速检测。
文档编号G01N33/74GK101692091SQ20091017791
公开日2010年4月7日 申请日期2009年10月19日 优先权日2009年10月19日
发明者于洪侠, 张薇薇, 杨曙明, 邱静, 陈刚 申请人:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所