专利名称：人α-防御素抗病毒活性突变体的筛选方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种人a -防御素抗病毒活性突变体的筛选方法。
背景技术：
当前社会，病毒感染性疾病十分常见且严重危害人类健康。现有的抗病毒药物主要包括传统广谱性抗病毒药和针对某些病毒的特效药。然而，传统抗病毒药常因为毒副作用大或疗效不显著等原因，使其应用受到限制；而那些通过抑制病毒专有酶或复制关键环节的抗病毒特效药，尽管早期应用时疗效突出，但由于作用于病毒上的靶点较为局限，所以在使用过程中容易出现因作用靶点突变而导致病毒耐药及停药后复发现象。因此，寻找高效、低毒且不易使病毒产生耐药的新型抗病毒药物，对病毒感染性疾病的防治具有重要意义。 近年来，人们在研究哺乳动物、昆虫等防御和抵抗病原微生物侵袭及感染的过程中发现了一种内源性阳离子肽_防御素。有生物活性的成熟防御素分子一般在3-6kD，除富含精氨酸外，其分子内还存在着6个保守半胱氨酸，形成3个链内二硫键。根据二硫键的组成方式，人体内的防御素又分为a和|3两种主要类型，目前已发现的人a防御素共有6种，它们分别是由单核细胞表达分泌的HNP-1、 HNP-2、 HNP-3、 HNP-4和由肠道潘氏细胞及生殖道粘膜上皮分泌的HD5、 HD6。由于防御素是一种内源性分子，本身具有识别病原微生物与机体正常细胞的能力，所以在有效剂量范围内不会对人体正常细胞产生毒性，而且病原体也很难对其产生耐药性。 人们对防御素的最初认识是基于其显著、广谱的抗菌作用。但后来研究发现，除了抗菌活性外，大部分防御素还具有一定的抗病毒作用。然而，尽管许多防御素都显示出一定程度的抗病毒作用，但与抗菌作用相比，它们的抗病毒能力相对较弱。Tanabe等(Tanabe Het al， J Viro1，2004，78 :11622-11631)发现大部分a防御素抗病毒时的半数有效浓度(IC50)要比抗菌时的IC50高10倍甚至上百倍以上。这就意味着当应用防御素进行抗病毒治疗时其用量要显著增加，如此不仅会加重病人的经济负担，更重要的是会超出人体正常细胞对它的耐受力，引发毒副反应。因此，若能显著提高防御素的抗病毒能力，将会进一步提升其在病毒感染防治中的应用价值。 由于不同种类防御素的分子结构十分相似，尤其是半胱氨酸数目、位置以及精氨酸组成都显示出很强的保守性。因此，人们普遍认为所有哺乳动物的防御素都源自于相同的祖先，之所以出现不同种类、不同性状与功能的防御素是由于体内分子进化和选择的结果(Partil A et al，Physiol Genomics, 2004， 20 :1-11)。有研究发现，当对一些防御素进行结构改变或氨基酸置换后，它们的生物学特性(包括抗菌及抗病毒活性)就会发生相应的变化(Xie Cet al， JBio Chem， 2005， 280 :32921-32929) 。 Lynn等(Lynn DJ et al， MolBiol Evol，2004，21 :819-82)在对人以及恒河猴、小鼠、大鼠等哺乳动物a防御素的进化情况进行分析时发现，在成熟人a防御素分子中有14个位置的氨基酸可以发生适应性进化改变，也就是说，在不同环境和选择压力情况下这14个位置的氨基酸组成会产生相应改变，从而造就出不同生物学性状的a防御素。防御素之所以具有突出的抗菌活性，推测可能是在自然进化过程中其周围环境长期存在细菌压力作用的结果。相对而言，HSV、HPV、HIV等病毒出现较晚，尚未对防御素进化产生长期、显著的环境压力，所以其抗病毒作用相对较弱。因此我们设想，如果对人a防御素分子中可适应性进化的氨基酸进行突变和抗病毒活性筛选，极有可能使其抗病毒能力得到进一步提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种人a -防御素抗病毒活性突变体的筛选方法。所述方法通过突变与筛选，使人a-防御素分子在保留其基本生物学特性的基础上，抗病毒能力显著提高，为寻找和研制高效、低毒抗病毒药物开辟一条新途径。
本发明的技术方案 人a -防御素抗病毒活性突变体的筛选方法，有以下步骤
1)人a _防御素突变体cDNA文库的构建 A.选择人a -防御素分子中具有适应性进化潜能的氨基酸位点作为突变位点； B.通过DNA合成和PCR扩增获得编码人a -防御素突变体的cDNA片段； C.构建含有人a -防御素突变体cDNA片段的质粒文库； 2)人a -防御素突变体在CH0细胞中的定点整合与均一性表达 A.特定CHO细胞的培养 复苏并传代培养染色体上带有FRT位点的Flp-In-CH0细胞；
B.编码人a -防御素突变体的cDNA在CHO细胞中的定点整合；
C.表达人a -防御素突变体的阳性细胞的筛选及单克隆化；
3)抗病毒活性筛选； 4)抗病毒活性显著增强的人a -防御素突变体的生物学特性鉴定。
所述的通过DNA合成和PCR扩增获得编码人a -防御素突变体的cDNA片段，是指采用化学法合成在突变位点引入随机密码子序列的正、反义人a -防御素分子的单链DNA片段，两条DNA片段之间存在至少18bp的互补交叉重叠区，然后以两条链退火、延伸后形成的双链DNA分子做为模板，再通过PCR扩增获得编码人a -防御素突变体的cDNA片段。
步骤1)所述构建含有人a -防御素突变体cDNA片段的质粒文库，是指通过酶切、连接反应将编码人a _防御素突变体的cDNA片段插入pcDNA5/FRT质粒载体中，转化大肠杆菌感受态细胞，获得105以上的阳性克隆，提取全部阳性克隆的质粒DNA，即得人a -防御素有效突变体cDNA文库。 步骤2)所述的编码人a-防御素突变体的cDNA在CHO细胞中的定点整合，是指
将编码人a -防御素突变体的cDNA片段定点插入到CHO细胞的FRT位点。 步骤2)所述的阳性重组细胞的筛选与单克隆化，是指通过潮霉素B抗性筛选表达
有人a _防御素突变体的CHO细胞，并采用ELISA和Western blot对阳性细胞进行鉴定，
再将潮霉素B抗性筛选出的阳性细胞接种至96孔板，进行单细胞培养2-3周。 步骤3)所述的抗病毒活性筛选，是指将含有人a -防御素突变体的CHO细胞上清
与病毒液共同孵育vero细胞，通过分析vero细胞的保护率而筛选出抗病毒活性增强的人
4a-防御素突变体。 步骤4)所述的抗病毒活性显著增强的人a -防御素突变体的生物学特性鉴定，包 括DNA与氨基酸序列分析、细胞毒性分析和溶血性分析。
本发明的优点 由于防御素分子相对较小，其中又必须有相对保守的半胱氨酸及精氨酸存在，因 此应用基于"易错PCR"或"有性PCR"等方法的DNA改组技术很难产生有效突变体库。不过， 也正是由于防御素具有上述特点，使其非常适用于寡核苷酸序列合成结合定点随机突变的 方式产生有效突变体库即对目的基因进行体外寡核苷酸分段或全长合成，合成过程中在 可适应性进化的氨基酸位置引入随机密码子序列，再通过退火、延伸、扩增以及分子克隆构 建成相应的肽库，达到一定容量的肽库中就会有各种形式供进化选择的突变体存在。除了 需要构建有效的突变体库外，要真正得到高效抗病毒活性的突变体还必须有合适的表达筛 选系统。由于防御素本身具有抗菌活性，不适合在大肠杆菌及噬菌体中进行表达及活性筛 选，因此，最好是选用真核表达与筛选系统来实施。而位点特异性重组酶介导的真核细胞定 点整合技术可以实现目的基因在真核细胞中的一致性表达，为类似防御素这样的基因功能 筛选提供了切实可行的途径。 人a -防御素是一种内源性阳离子肽，从生物学特性和作用机理来看，其本身就 具有识别和选择性杀伤病原体的作用，而对正常人体细胞无明显影响。因此，通过对其分子 中可适应性进化的氨基酸位点进行选择性突变和抗病毒活性筛选，最终所得到的高效抗病 毒活性突变体理论上不会具有明显毒副作用，病毒也不会对其产生耐药，其在病毒感染防 治方面将会具有广阔的应用前景。 本发明基于人a防御素自身所具有的选择性进化特征，对其分子中特定位点的 氨基酸进行随机突变和抗病毒活性筛选，旨在使人a防御素分子在保持其基本生物学性 状的同时抗病毒活性得到显著提高，为寻找新型抗病毒药物奠定基础。 本发明提供的人a -防御素抗病毒活性突变体筛选方法，同样适用于其他种类防 御素和内源性抗菌肽的抗病毒活性突变体筛选。
图1为叫HNP-1突变体多肽在2%胎牛血清情况下抑制HSV-2感染vero细胞效 果的分析，其中，柱状1代表正常细胞对照，2代表病毒对照，3代表HNP-1多肽对照，4代表 i^HNP-1突变体多肽，* :p < 0. Olvs.病毒对照；# :p < 0. Olvs. HNP-1多肽对照；
图2为miHD5突变体多肽在2%血清条件下抑制HSV_2感染vero细胞效果的分析， 其中，柱状1代表正常细胞对照，2代表病毒对照，3代表HD5多肽对照，4代表miHD5突变体 多肽，* :p < 0. Olvs.病毒对照；# :p < 0. Olvs. HD5多肽对照。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本方明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于 此。 主要试剂和材料 1. Pyrobest DNA Polymerase试剂盒(TaKara公司产品，中国大连)
5么、司产品，日本)
,，美国) ,，美国) 2.限制性核酸内切酶Hind III和Xho I (New England BioLabs公司产品，美国)
3. Flp-In 定点整合系统、Flp-In-CHO细胞、质粒pcDNA5/FRT和 pOG44(Invitrogen公司产品，美国) 4. CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒(D0JIND0公，
5. 大肠杆菌DH5 a (本室保存)
6. Vero细胞株(本室保存)
7. HSV-2病毒株(本室保存)
8. 氨苄青霉素、潮霉素B(Roche公司产品，德国)
9. DMEM培养基、胎牛血清(Hyclone公司产品，美国)
10. 人a -防御素1单克隆抗体(Santa Cruz公司产
11. 人a _防御素5单克隆抗体(Santa Cruz公司产 实施例1人a _防御素1抗病毒活性突变体的筛选 (一)人a _防御素1突变体库的构建
1. 突变位点的选择
人a -防御素1氨基酸序列如下，其中斜体部分为文献报道可发生适应性进化的 14个氨基酸位点。j CYCR /户j C / j C ER ^ / GTC / Y P G W j FCC
1 5 10 15 20 25 30 考虑到精氨酸(R)在防御素分子中的特殊作用和实验的可实施性，故选择这些可 适应性进化氨基酸位点中的9个作为突变位点(第6、7、10、11、12、16、20、22、25位氨基 酸)，具体突变位点如下ACYCR AC /爿《ERR ￡ GTC / Y ^ GR丄WAFCC
1 5 10 15 20 25 30 在上述序列中，斜体加下画线的氨基酸位点为人a -防御素1的突变位点。
2. 含定点随机突变的人a -防御素1的基因序列合成与扩增 应用寡核苷酸合成技术对含定点随机突变的人a _防御素1的基因序列进行体外
合成，合成方法如下 1)同时从人a-防御素l基因的两端合成两段各长67bp的寡核苷酸序列，两者之 间存在一个18bp的互补交叉重叠区，两段寡核苷酸序列的5'端分别引入Hind III和Xho I酶切位点及4bp的保护性碱基序列，其中在Hind III酶切位点的后面引入翻译起始密码 子序列，在Xho I酶切位点的前面引入终止密码子序列；合成过程中在可适应性进化的第 6、7、 10、 11、 12、 16、20、22、25位氨基酸位点引入随机密码子序列，随机密码子以N丽或NNS 的形式合成，其中N代表等摩尔的4种碱基，W代表A、 T，而S代表C、 G，这种形式的密码子 可以编码20种氨基酸。 所合成的两段67bp的寡核苷酸序列如下
Hi-up : 5' - ^GG7: AAGCTT 1aTG|' GCCTGCTACTGCCGAN丽NNSGCCTGCNNSN丽NNSGAACGACGAN丽 GGAACA-3， 其中下画线部分为Hind III酶切位点序列，加框部分为翻译起始密码子碱基序列，斜体部分为保护性碱基。
Hl-down :
5，
GTTC-3， 其中下画线部分为Xho I酶切位点序列，黑体部分为终止密码子碱基序列，斜体部 分为保护性碱基。 2)将所合成的两段寡核苷酸进行退火与延伸反应，由于两者之间设置有18bp的 互补交叉重叠区，所以经退火、延伸后即可生成含定点随机突变的人a _防御素1全长双链 DNA。再以所生成的双链DNA为模板，以其最外侧端22bp序列为引物进行PCR扩增。PCR引 物序列如下
PI :5' _ ///7^T:AAGCTTATG
GCCTGCTAC-3'
P2 :5 ， - r腳CTCGAG TCA GCAGCAGAA-3 ， 3.编码定点随机突变的人a -防御素lcDNA文库的构建
1)将上步所得PCR产物及Flp-In 定点整合表达质粒载体pcDNA5/ FRT(Invitrogen公司产品)用Hind III和Xho I进行双酶切； 2)胶回收目的DNA片段，并进行连接反应，连接产物采用电转化法转化大肠杆 菌DH5 a感受态细胞，经氨节抗生素筛选获得重组子pcDNA5/FRT/mHNP-l (mHNP-1指代人 a _防御素1突变体)； 3)当阳性重组子数量达到105以上时，提取所有重组子质粒DNA，即得人a -防御 素l有效突变体cDNA文库。
( 二 )人a _防御素1突变体在CHO细胞中的定点整合与表达
1、特定CHO细胞的培养 复苏并传代培养Flp-In-CHO细胞(此细胞基因组中含有一个FRT位点)，取2-3 代的细胞进行后续实验。 2、编码人a -防御素1突变体的cDNA在CHO细胞中的定点整合将质粒pcDNA5/FRT/mHNP-l与表达Flp重组酶的质粒pOG44按1 : 9的比例混匀，
然后通过脂质体介导转染Flp-In-CHO细胞。转染后的CHO细胞在含有潮霉素B的培养基
中进行培养。由于pcDNA5/FRT质粒载体中也存在一个FRT位点，因此在Flp/FRT点特异性
同源重组酶系统介导反应下，经过重组和替换，pcDNA5/FRT质粒的表达框架部分(其中包
括mHNP-1以及潮霉素B抗性筛选基因等)就会定点插入到CHO细胞基因组的FRT位点中。 3、表达人a -防御素1突变体的阳性细胞的筛选与单克隆化 转染24h后，换用含有潮霉素B的选择性培养液，并于96孔板进行细胞单克隆化，
由于只有阳性重组细胞内才有潮霉素B抗性筛选基因的表达，所以通过潮霉素B抗性筛选
后继续生长的细胞即为阳性重组细胞。将阳性重组细胞在含潮霉素B的无血清培养基中继
续2-3周，使之形成单克隆。 4、人a _防御素1突变体的表达鉴定 对于单克隆化的CHO细胞，取其无血清培养上清，应用人a -防御素1单克隆抗体 进行Western blot分析，对人a -防御素1突变体的表达进行鉴定。之后，通过ELISA方 法测定培养上清中人a-防御素1突变体的表达量。
(三)人a -防御素1突变体抗病毒活性筛选
1、病毒液制备 以II型单纯疱疹病毒(HSV-2)作为压力筛选的攻击者，以Vero细胞(非洲绿猴 肾上皮细胞，本室保存)作为被攻击的对象。 首先将Vero细胞复苏传代，HSV-2病毒株(国际标准株)系列稀释后按常规方法 感染单层培养的Vero细胞，37t:培养72h，观察细胞病变效应(CPE)，并以引起75%细胞出 现CPE的病毒液为其最佳使用剂量。
2、抗病毒活性筛选 接种Vero细胞于96孔板中，每组设置5个复孔，在含10%胎牛血清的1640培养 基中371:培养过夜，使细胞完全贴壁，更换2%胎牛血清培养液。取最佳使用剂量的病毒 液，与表达人a -防御素1突变体的CH0单细胞克隆上清混合后加入培养有Vero细胞的96 孔板中，37t:培养48h。然后，通过CCK-8法测定不同人a _防御素1突变体对Vero细胞的 保护率。具体操作如下每孔加入CCK-8反应液10 ii 1， 37t:继续培养4h，轻轻吸弃上清液， 振荡混匀，酶标仪测定490nm波长处吸光度值(A值)。细胞保护率=(样品组A值-病毒 对照组A值)/ (正常细胞对照组A值-病毒对照组A值)X 100% 。细胞保护率值即可反映 不同人a-防御素1突变体的抗病毒活性强弱。
3、抗病毒活性增强型人a -防御素1突变体的鉴定 通过与正常人a-防御素l相比，最终筛选出l个抗病毒活性显著增强的人a-防 御素1突变体(miHNP-l，图1)，并将表达该突变体的CH0细胞放大培养，然后收集细胞并提 取细胞总RNA，反转录生成cDNA，前述PI和P2为引物，PCR扩增获得i^HNP-1突变体的cDNA 片段。对PCR产物进行测序，获得miHNP-l突变体的DNA序列，其序列如下
ACCGCGGACGACTTTGGGCCTTCTGCTGC :|TGA|. _3， 然后，根据DNA序列再推导出其相对应的氨基酸序列如下 ACYCRIPACIAGERRYGTCFYRGRLWAFCC 经对比发现，n^HNP-l是在正常HNP-1的基础上，其第20位的异亮氨酸(I)突变为
苯丙氨酸(F)、第22位的天冬酰胺(Q)突变为精氨酸(R)。(四)人a _防御素1突变体多肽的细胞毒性鉴定 1、人a _防御素1突变体多肽的合成 根据上步实验所推导出的抗病毒活性显著增强型人a -防御素1突变体叫HNP-l 的氨基酸序列，利用全自动多肽合成仪(433A，Applied Biosystem)委托上海生工生物工程 公司合成该突变体多肽。
2、细胞接种与培养 选择vero细胞(非洲绿猴肾细胞)为受试对象，接种vero细胞于96孔板中，接 种密度为2000个细胞/孔，接种体积为100 iU， vero细胞在含10%胎牛血清的1640培养 液中培养24h至细胞完全贴壁，弃培养液，换用含有不同浓度miHNP-l多肽的培养液继续培 养，每一浓度均重复5 L同时设置正常人a -防御素1多肽对照组和空白对照组。
3、 CCK-8法测定人a -防御素1突变体多肽的细胞毒性vero细胞培养72h后，每孔加入CCK-8反应液10 y 1， 37。C继续培养4h，轻轻吸弃上清液，振荡混匀，酶标仪测定490nm波长处吸光度值(A值)，并计算出细胞存活率。细胞 存活率(％ ) 二样品组A值/空白对照组A值X100%。通过比较不同浓度正常人a-防 御素1多肽及其突变体n^HNP-l作用后的细胞存活率，可以反应出miHNP-l多肽的细胞毒性 是否增加。结果发现，与同等浓度的正常人a -防御素1多肽相比，miHNP-l的细胞毒性没 有明显变化。 实施例2人a -防御素5抗病毒活性突变体的筛选
( — )人a -防御素5突变体库的构建
1.突变位点的选择 人a -防御素5氨基酸序列如下，其中斜体部分为文献报道可发生适应性进化的 14个氨基酸位点。A J1 CYCR T1^ C J M ESL ^ GVC f I 5 G AX Y ^ LCCR
1 5 10 15 20 25 30 考虑到精氨酸(R)在防御素分子中的特殊作用和突变体库的容量，故选择这些可 适应性进化氨基酸位点中的9个作为突变位点(第7、8、11、12、16、17、21、23、26位氨基 酸)，具体突变位点如下ATCYCR RC RES M GVC互I ^ GR ^ YRLCCR
1 5 10 15 20 25 30 在上述序列中，斜体加下画线的氨基酸位点为人a -防御素5的突变位点。
2.含定点随机突变的人a -防御素5的基因序列合成与扩增
应用寡核苷酸合成技术对含定点随机突变的人a -防御素的基因序列进行体外 合成，合成方法如下 1)同时从人a-防御素5基因的两端合成两段各长70bp的寡核苷酸序列，两者之 间存在一个18bp的互补交叉重叠区，两段寡核苷酸序列的5'端分别引入Hind III和Xho I酶切位点及4bp的保护性碱基序列，其中在Hind III酶切位点的后面引入翻译起始密码 子序列，在Xho I酶切位点的前面引入终止密码子序列；合成过程中在可适应性进化的第 7、8、 11、 12、 16、 17、21 、23、26位氨基酸位点引入随机密码子序列，随机密码子以NNW或NNS 的形式合成，其中N代表等摩尔的4种碱基，W代表A、 T，而S代表C、 G，这种形式的密码子 可以编码20种氨基酸。 所合成的两段70bp的寡核苷酸序列如下
H5-up :
NNSGGGGTG-3，其中下画线部分为Hind III酶切位点序列，加框部分为翻译起始密码子碱基序
列，斜体部分为保护性碱基。
H5-down :
NGGACTC-3， 其中下画线部分为Xho I酶切位点序列，黑体部分为终止密码子碱基序列，斜体部 分为保护性碱基。
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2)将所合成的两段寡核苷酸进行退火与延伸反应，由于两者之间设置有18bp的 互补交叉重叠区，所以经退火、延伸后即可生成含定点随机突变的人a _防御素5全长双链 DNA。再以所生成的双链DNA为模板，以其最外侧端22bp序列为引物进行PCR扩增。PCR引 物序列如下 P3 :5' - j仏7-,AAGCTT
ATG'GCCACCTGC-3，P4 :5 ， _ TOT CTCGAG TCA TCTACAACA-3 ， 3.编码定点随机突变的人a -防御素5cDNA文库的构建 1)将上步所得PCR产物及Flp-In 定点整合表达质粒载体pcDNA5/ FRT(Invitrogen公司产品)用Hind III和Xho I进行双酶切； 2)胶回收目的DNA片段，并进行连接反应，连接产物采用电转化法转化大肠杆菌 DH5 a感受态细胞，经氨节抗生素筛选获得重组子pcDNA5/FRT/mHD-5 (mHD_5指代人a -防
御素5突变体)； 3)当阳性重组子数量达到105以上时，提取所有重组子质粒DNA，即得人a -防御 素有效突变体cDNA文库。
( 二 )人a _防御素5突变体在CHO细胞中的定点整合与表达
1、特定CHO细胞的培养 复苏并传代培养Flp-In-CHO细胞(此细胞基因组中含有一个FRT位点)，取2_3 代的细胞进行后续实验。 2、编码人a -防御素5突变体的cDNA在CHO细胞中的定点整合将质粒pcDNA5/FRT/mHD-5与表达Flp重组酶的质粒pOG44按1 : 9的比例混匀，
然后通过脂质体介导转染Flp-In-CHO细胞。转染后的CHO细胞在含有潮霉素B的培养基
中进行培养。由于pcDNA5/FRT质粒载体中也存在一个FRT位点，因此在Flp/FRT点特异性
同源重组酶系统介导反应下，经过重组和替换，pcDNA5/FRT质粒的表达框架部分(其中包
括mHD-5及潮霉素B抗性筛选基因等)就会定点插入到CHO细胞基因组的FRT位点中。 3、表达人a -防御素5突变体的阳性细胞的筛选与单克隆化 转染24h后，换用含有潮霉素B的选择性培养液，并于96孔板进行细胞单克隆化，
由于只有阳性重组细胞内才有潮霉素B抗性筛选基因的表达，所以通过潮霉素B抗性筛选
后继续生长的细胞即为阳性重组细胞。将阳性重组细胞在含潮霉素B的无血清培养基中继
续2-3周，使之形成单克隆。 4、人a -防御素5突变体的表达鉴定 对于单克隆化的CHO细胞，取其无血清培养上清，应用人a -防御素5单克隆抗体 进行Western blot分析，对人a -防御素5突变体的表达进行鉴定。之后，通过ELISA方 法测定培养上清中人a-防御素5突变体的表达量。
(三)人a -防御素5突变体抗病毒活性筛选
1、病毒液制备 以I I型单纯疱疹病毒(HSV-2)作为压力筛选的攻击者，以Vero细胞(非洲绿猴 肾上皮细胞，本室保存)作为被攻击的对象。 首先将Vero细胞复苏传代，HSV-2病毒株(国际标准株)系列稀释后按常规方法感染单层培养的Vero细胞，37t:培养72h，观察细胞病变效应(CPE)，并以引起75%细胞出 现CPE的病毒液为其最佳使用剂量。
2、抗病毒活性筛选 接种Vero细胞于96孔板中，每组设置5个复孔，在含10%胎牛血清的1640培养 基中371:培养过夜，使细胞完全贴壁，更换2%胎牛血清培养液。取最佳使用剂量的病毒 液，与表达人a -防御素5突变体的CH0单细胞克隆上清混合后加入培养有Vero细胞的96 孔板中，37t:培养48h。然后，通过CCK-8法测定不同人a _防御素5突变体对Vero细胞的 保护率。具体操作如下每孔加入CCK-8反应液10 ii 1， 37t:继续培养4h，轻轻吸弃上清液， 振荡混匀，酶标仪测定490nm波长处吸光度值(A值)。细胞保护率=(样品组A值-病毒 对照组A值)/ (正常细胞对照组A值-病毒对照组A值)X 100 % 。细胞保护率值即可反映 不同人a-防御素5突变体的抗病毒活性强弱。
3、抗病毒活性增强型人a -防御素5突变体的鉴定 通过与正常人a -防御素相比，筛选出1个抗病毒活性显著增强的人a -防御素 5突变体(miHD5，图2)，并将表达该突变体的CHO细胞放大培养，然后收集细胞并提取细胞 总RNA，反转录生成cDNA，选择前述P3和P4为引物，PCR扩增获得人a -防御素5突变体的 cDNA片段。对PCR产物进行测序，获得人a -防御素5突变体的DNA序列，其中n^HD5的序 列如下
GCATCTCAGGCCGCCTCTACAGACTCTGTTGTAGA i[TGA|' -3， 然后，根据DNA序列再推导出其相对应的氨基酸序列如下 ATCYCRTGRCATRESLSGVCRISGRLYRLCCR 经对比发现，miHD5是在天然HD-5的基础上，其第21位的谷氨酸(E)突变位精氨
酸(R)。(四)人a _防御素5突变体多肽的细胞毒性鉴定
1、人a -防御素5突变体多肽的合成 根据上步实验所推导出的抗病毒活性显著增强型n^HD5突变体的氨基酸序列，利 用全自动多肽合成仪(433A， Applied Biosystem)委托上海生工生物工程公司合成该突变 体多肽。 2、细胞接种与培养 选择vero细胞为受试对象，接种vero细胞于96孔板中，接种密度为2000个细胞 /孔，接种体积为100 iU， vero细胞在含10%胎牛血清的1640培养液中培养24h至细胞完 全贴壁，弃培养液，换用含有不同浓度miHD5突变体多肽的培养液继续培养，每一浓度均重 复5 L同时设置正常人a -防御素5多肽对照组和空白对照组。
3、 CCK-8法测定miHD5突变体多肽的细胞毒性 vero细胞培养72h后，每孔加入CCK-8反应液10 y 1， 37。C继续培养4h，轻轻吸弃 上清液，振荡混匀，酶标仪测定490nm波长处吸光度值(A值)，并计算出细胞存活率。细胞 存活率(％ ) 二样品组A值/空白对照组A值X100%。通过比较不同浓度正常人a-防 御素5多肽及其突变体n^HD5作用后的细胞存活率，可以反应出miHD5多肽的细胞毒性是否 增加。结果发现，与同等浓度的正常人a -防御素5多肽相比，miHD5的细胞毒性没有明显变化。 结论本发明针对人a -防御素具有可选择性进化的特性，通过定点随机突变及 Flp-In 介导真核细胞定点表达系统筛选抗病毒活性显著增强的人a -防御突变体，所得 到突变体不仅具有高效抗病毒活性，同时还保持有人a -防御素分子的基本特性，即无明 显的毒副作用，病毒也不会对其产生耐药。因此，本发明为寻找高效、低毒抗病毒药物提供 了一条新途径。 虽然人a-防御素共有6种，由于这6种人a _防御素的分子结构特点一致，都具 有可选择性进化特性，因此，本实施例所述的人a -防御素1、5的突变体筛选方法，同样适 用于其它几种人a-防御素抗病毒活性突变体的筛选。
序列表 〈110〉中国人民解放军第三军医大学 〈120〉人a _防御素抗病毒活性突变体的筛选方法 〈130〉 〈160>10 〈170>PatentIn version 3.3
〈210>1
〈211>30
〈212>PRT 〈213〉人a _防御素1氨基酸序列
〈400>1 ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC
1 5 10 15 20 25 30 〈210>2
〈211>32
〈212>PRT 〈213〉人a _防御素5氨基酸序列
〈400>2 ATCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR
1 5 10 15 20 25 30 〈210>3
〈211>67
〈212>DNA 〈213〉含定点随机突变的人a -防御素1的正义寡核苷酸序列(Hl-up) 序列特征5'端带有4bp的保护性碱基和Hind 111酶切位点序列，突变位
点以nnw或nns的形式 表示，其中n代表等摩尔的4种碱基，w代表a、 t，而s代表c、 g。
〈400>3 3ggt朋gctt atggcctgct 3ctgccga皿w皿sgcctgc皿s皿w皿sg朋cgacg3皿 60
wggaaca 67
〈211>70
〈212>DNA 〈213〉含定点随机突变的人a -防御素5的反义寡核苷酸序列(H5-down) 序列特征5'端带有4bp的保护性碱基和Xho I酶切位点序列，突变位点以
wnn或snn的形式表示，
60 70其中n代表等摩尔的4种碱基，w代表a、 t，而s代表c、 g。
〈400>9tgcgctcgagtcatctacaa cagagtctgt as皿gcggcc w皿gats皿a cacaccccwnns皿ggactc〈210>10〈211>22〈212>DNA〈213〉人a_防御素5突变体的上游PCR引物序列(P3)〈400>103ggt朋gcttatggccacct gc〈210>11〈211>22〈212>DNA〈213〉人a-防御素5突变体的下游PCR引物序列(P4)〈400>11tgcgctcgagtcatctecaa ca〈210>12〈211>32〈212>PRT〈213〉人a-防御素5突变体的氨基酸序列〈400>31A T C Y CRTGRCATRESLSGVCRISGRLYRLCCR1 510152025 30
22
2权利要求
一种人α-防御素抗病毒活性突变体的筛选方法，其特征在于有以下步骤1)人α-防御素突变体cDNA文库的构建A.选择人α-防御素分子中具有适应性进化潜能的氨基酸位点作为突变位点；B.通过DNA合成和PCR扩增获得编码人α-防御素突变体的cDNA片段；C.构建含有人α-防御素突变体cDNA片段的质粒文库；2)人α-防御素突变体在CHO细胞中的定点整合与均一性表达A.特定CHO细胞的培养复苏并传代培养染色体上带有FRT位点的Flp-In-CHO细胞；B.编码人α-防御素突变体的cDNA在CHO细胞中的定点整合；C.表达人α-防御素突变体的阳性细胞的筛选及单克隆化；3)抗病毒活性筛选；4)抗病毒活性显著增强的人α-防御素突变体的生物学特性鉴定。
2. 根据权利要求l所述的人a-防御素抗病毒活性突变体的筛选方法，其特征在于 步骤1)所述的通过DNA合成和PCR扩增获得编码人a -防御素突变体的cDNA片段，是指 采用化学法合成在突变位点引入随机密码子序列的正、反义人a -防御素分子的单链DNA 片段，两条DNA片段之间存在至少18bp的互补交叉重叠区，然后以两条链退火、延伸后形成 的双链DNA分子做为模板，再通过PCR扩增获得编码人a -防御素突变体的cDNA片段。
3. 根据权利要求l所述的人a-防御素抗病毒活性突变体的筛选方法，其特征在于 步骤l)所述构建含有人a-防御素突变体cDNA片段的质粒文库，是指通过酶切、连接反应 将编码人a _防御素突变体的cDNA片段插入pcDNA5/FRT质粒载体中，转化大肠杆菌感受 态细胞，获得105以上的阳性克隆，提取全部阳性克隆的质粒DNA，即得人a -防御素有效突 变体cDNA文库。
4. 根据权利要求l所述的人a-防御素抗病毒活性突变体的筛选方法，其特征在于 步骤2)所述的编码人a-防御素突变体的cDNA在CHO细胞中的定点整合，是指将编码人 a _防御素突变体的cDNA片段定点插入到CHO细胞的FRT位点。
5. 根据权利要求l所述的人a-防御素抗病毒活性突变体的筛选方法，其特征在于 步骤2)所述的表达人a-防御素突变体的阳性细胞的筛选与单克隆化，是指通过潮霉素B 抗性筛选表达有人a-防御素突变体的CHO细胞，并采用ELISA和Western blot对阳性细 胞进行鉴定，再将潮霉素B抗性筛选出的阳性细胞接种至96孔板，进行单细胞培养2-3周。
6. 根据权利要求1所述的人a -防御素抗病毒活性突变体的筛选方法，其特征在于 步骤3)所述的抗病毒活性筛选，是指将含有人a-防御素突变体的CHO细胞上清与病毒液 共同孵育vero细胞，通过分析vero细胞的保护率而筛选出抗病毒活性增强的人a -防御 素突变体。
7. 根据权利要求1所述的人a -防御素抗病毒活性突变体的筛选方法，其特征在于 步骤4)所述的抗病毒活性显著增强的人a-防御素突变体的生物学特性鉴定，包括DNA与 氨基酸序列分析、细胞毒性分析和溶血性分析。
全文摘要
本发明公开了一种人α-防御素抗病毒活性突变体的筛选方法，有以下步骤人α-防御素的定点随机突变、突变体库构建、突变体在CHO细胞中的定点整合与均一性表达，以及高效抗病毒活性突变体的筛选。本发明方法通过突变与筛选使人α-防御素分子，在保留其基本生物学特性的基础上抗病毒能力显著提高，为寻找和研制高效、低毒抗病毒药物开辟一条新途径。
文档编号G01N33/53GK101724633SQ200910191848
公开日2010年6月9日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者王军平, 王艾平, 程天民, 粟永萍, 许杨, 陈芳, 陈默 申请人:中国人民解放军第三军医大学