专利名称：糖链抗原15-3化学发光定量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于体外临床检验和化学发光免疫法技术领域，尤其涉及一种用于乳腺癌 和卵巢癌相关指标糖链抗原15-3检测的反应板及试剂盒。
背景技术：
近半个世纪以来，肿瘤的发病率和死亡率逐年升高，成为医学界热点中的热点。20 世纪70年代，美国提出的向“肿瘤进军”反映了社会对肿瘤死亡率居高不下的焦虑，同时， 在过去的几十年中，肿瘤标志在技术上和定义上有了突破，这一切都促使了肿瘤标志研究 的快速发展。糖链抗原15-3 (Carbohydrate Antigen 15-3, CA15-3)于 1984 年被发现，相对分 子质量为300 500kD。其又称为DF3、CD227和PUM。CA15-3有两种抗体一种由鼠抗人乳 腺癌肝转移株膜富集提取物的单克隆抗体DF3制备，另一种抗体115DB是鼠抗人乳脂球蛋 白抗体。和DF3抗体反应的是相对分子量为3(T45kD的异质糖蛋白分子，基因位于1号染 色体长臂。它的cDNA克隆表明DF3多肽的核心有一段60bp高度保守的串联重复序列，重 复序列数量的差异导致了该抗原的多态性。DF3抗体识别位于多肽核心的20氨基酸重复序 列的抗原决定簇，即基因核心的表达产物，抗原决定簇的识别同样受到糖基化的影响。在健康人群，血清CA15-3参考值上限为25kU/L。以此为标准，1050名正常人中 的5.5%、23%的原发性乳腺癌患者以及69(%的转移性乳腺癌患者的0415-3超过了这一水 平。在其他一些恶性肿瘤中也能见到CA15-3升高，如80%的胰腺癌、71 %的肺癌、68%的乳 腺癌、64%的卵巢癌、63%的直肠癌和的肝癌；CA15-3升高还可见于一些良性疾病如 肝病(42% )和良性乳腺病(16% )，但升高比例较低。由于原发性乳腺癌CA15-3升高不显著(23% )，因而CA15-3常用于转移的乳腺癌 患者的治疗检测和预后判断。1997年美国FDA批准Mucinl (CA153)作为II/III期乳腺癌 复发的检测指标。CA15-3比原来水平升高25%预示病情进展或恶化，并与90%进展期、78%恢复期 相关，60%病情稳定患者的CA153水平没有改变。由于CA15-3对转移性乳腺癌诊断的敏感 性和特异性均优于CEA，因而成为诊断转移性乳腺癌的首选指标。上世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光 的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前， 这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析 (Chemiluminescencelmmunoassay, CLIA)是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结 合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫(RIA) 和酶免疫(EIA)相似，不同之处是以发光物质作为底物，并藉助其自身的发光强度直接进 行测定。在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反 应系统，其基本原理同酶联免疫技术(ELISA)。化学发光系统的原理在于免疫反应中的酶作用于发光底物。发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发 态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信 号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。由此可 以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快 速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂，试剂保持期长，应用于生物学、医 学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。
发明内容
本发明将化学发光技术与免疫分析技术相结合，提供了一种简便，快速，稳定的检 测CA15-3的试剂盒。本发明的技术方案如下一种糖链抗原15-3化学发光定量检测试剂盒，包括反应板，酶结合物，发光底物， 校准品，质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被有抗糖链抗原15-3抗体。所述的校准品以糖链抗原15-3纯品配制，浓度为0、10、20、40、80、160、M0U/ml。所述的质控品以糖链抗原15-3纯品配制，由质控品I和质控品II两部分组成，质 控品I的浓度为10-40U/ml，质控品II的浓度为50_160U/ml。所述的质控品I的浓度优选为20. 5U/ml，质控品II的浓度优选为80. 6U/ml。所述的酶结合物为HRP标记的抗糖链抗原15-3抗体；所述的反应板材质是不透明 的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，所述的浓缩洗涤液 是pH7. 0-pH8. 0的中性缓冲液。本发明可以专一的定量检测出病人血清CA15-3的含量，判断转移性乳腺癌预后 和对转移性乳腺癌的治疗检测，同时也能诊断转移性乳腺癌。与传统的ELISA技术相比，本 发明不仅保留了 ELISA技术的高度特异性，检测结果的稳定性、可靠性和操作的简便性，同 时采用的化学发光法能提高检测的灵敏度。
图1本发明的CA15-3定量检测试剂盒的血清检测结果与罗氏试剂盒检测结果的 相关性。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 :CA15_3定量检测试剂盒的制备其步骤主要是(1)抗CA15-3的抗体包被板制备(CA15-3检测反应板的制备)； ⑵酶标抗体的制备；(3)CA15-3校准品的制备；(4)CA15-3质控品的制备；(5)化学发光底 物液的制备；(6)洗涤液制备；(7)半成品及成品组成
(1)抗CA15-3的抗体包被板制备a.包被取 lmol/L Na2HPO4 77. 4ml 和 lmol/L NaH2PO4 22. 6ml 混勻，加入去离子 水定容至IOOOml即成10倍包被液，临用前稀释十倍，加入适量抗CA15-3单抗(购自瑞典 康乃格)混勻，然后加入到微孔板板孔中，ΙΟΟμΙ/孔，4°C 16小时；b.封闭弃去包被液，在吸水纸纸上拍干，加入含有3% BSA和0.05%防腐剂 (Procl in 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7. 4), 200 μ 1/ 孔，37°C 2 小时；c.封袋弃去封闭液，在吸水纸上拍干，室温下于真空干燥箱中抽5小时，立即进 行真空封袋，检查有无漏气，如有重新封袋，贴上标签后于2-8°C保存。(2)酶标抗体的制备抗CA15-3单抗用过碘酸盐氧化法与辣根过氧化物酶交联，通过方阵滴定，确定酶 标抗体的使用浓度。(3) CA15-3校准品的制备用含有3% BSA和0. 05%防腐剂(Proclin 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)稀释 〇八15-3(购自瑞典康乃格)，分装0、10、20、40、80、160、24(^/1111。(4) CA15-3质控品的制备用含有3 WBSAa^海藻糖和0.05%防腐剂(Proclin 300)的磷酸盐缓冲液 (ρΗ7· 4)稀释CA15-3配制质控品I、II。浓度分别为20. 5U/ml和80. 6U/ml。(5)化学发光底物液的制备购买商品化发光底物液(购自Thermo Fisher)进行分装。(6) 20 X浓缩洗涤液制备取NaCl 170g吐温-20 IOml加水定容至IL即成，临用前稀释20倍(7)半成品及成品组成上述步骤所得产品分装后即为半成品。抽检合格后组装成试剂盒成品，成品还需 抽检，合格后才能出厂。综上，本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对本发明所用的原材料进行了 筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体及包被抗体的活性，载体的颜色、吸附性和变异大小， 化学发光的发光强度、持续时间。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被缓冲液和保护 液进行了实验，选出最适合的包被缓冲液和保护液，通过抗体不同包被浓度实验，找到最佳 的浓度条件，同时也对真空干燥的时间和温度也进行了研究，最后确定了干燥时间最短，稳 定性最好的时间。对于HRP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到 简便，产率高，成本低，质量可靠的标记方法。实施例2 :CA15-3定量检测试剂盒的使用方法1.试剂和样本准备(1)试剂准备a.将试剂盒置室温(18l6°C )平衡20分钟。b.从试剂盒中取出浓缩洗涤液，用新鲜的纯化水1 20稀释后加入洗板机的洗液 瓶中。(2)样本准备使用前将待测的合格血清或血浆置室温(18l6°C )平衡20分钟。
2.操作步骤a.取出所需的CA15-3抗体包被微孔板置于微孔架上b.加入校准品广6、质控品I、II和待测样本，每孔100 μ 1，充分混勻，置37°C恒温 箱孵育60分钟。c.手工洗涤弃去孔内液体，洗涤液注满各孔、静置5秒，甩干，重复5次后拍干。 或者洗板机洗涤每孔350 μ 1，重复4次，洗涤后拍干。d.加入酶结合物，每孔100 μ 1，充分混勻，置37 °C恒温箱孵育60分钟。e.重复步骤C。f.加发光底物A、B每孔各50μ 1，充分混勻，立刻加入化学发光仪中检测信号值。3.实验结果的计算可以采用作图法或计算法进行结果计算作图法以标准品抗原含量的Ig值为横坐标⑴，以其对应的信号值为纵坐标⑴ 绘制出标准曲线，然后根据检测样本测得的信号值在标准曲线上查出相应的抗原含量Ig 值，在计算出抗原含量。计算法以标准品抗原含量的Ig值为自变量(X)，以其对应的信号值为因变量 (Y)，求出回归方程，将待测标本的信号值带入回归方程，求得相应的抗原含量。实施例3 :CA15-3定量检测试剂盒的方法学鉴定按照本领域中常规的制造及鉴定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定结果 如下1.准确性将已知含量样品用本发明实施例1中制备的试剂盒进行检测，计算回收率(回收 率=回收量/加入量X100% )，样本量不低于10，结果如下
权利要求
1.一种糖链抗原15-3化学发光定量检测试剂盒，包括反应板，酶结合物，发光底物，校 准品，质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被有抗糖链抗原15-3的抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的校准品以糖链抗原15-3纯品配制， 浓度为 0、10、20、40、80、160、240U/ml。
3.如权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述的质控品以糖链抗原15-3 纯品配制，由质控品I和质控品II两部分组成，质控品I的浓度为10-40U/ml，质控品II的 浓度为 50-160U/ml。
4.如权利要求3所述的定量检测试剂盒，其特征在于所述的质控品I的浓度为20.5U/ ml，质控品II的浓度为80. 6U/ml。
5.如权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述的酶结合物为HRP标记的抗 糖链抗原15-3的抗体；所述的反应板材质是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的发光底物 为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，所述的浓缩洗涤液是PH7. 0-pH8. 0的中性缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种用于糖链抗原15-3检测的化学发光定量检测试剂盒，该试剂盒包括CA15-3检测反应板，反应板包括有CA15-3抗体。CA15-3化学发光定量检测试剂盒还包括酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液。本发明可以专一地定量检测出病人血清CA15-3的含量，判断转移性乳腺癌预后和对转移性乳腺癌的治疗检测，同时也能诊断转移性乳腺癌。与传统的ELISA技术相比，本发明不仅保留了ELISA技术的高度特异性，检测结果的稳定性、可靠性和操作的简便性，同时采用的化学发光法能提高检测的灵敏度。
文档编号G01N21/76GK102095720SQ200910200380
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者李胡丹, 汪宁梅, 穆宇豪, 穆海东 申请人:上海裕隆生物科技有限公司