专利名称：大肠癌靶向用药基因位点多态性检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测大肠癌靶向 用药基因位点多态性的试剂盒。
背景技术：
大肠癌为结肠癌和直肠癌的总称，指大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素 作用下发生的癌变，是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率较高。当癌细胞繁殖时，光滑的肠壁 变得粗糙、肿大及变硬，最后发生溃疡。溃疡区容易出血或发展成一个狭窄区，妨碍排便。如 果任由这种情形发展下去，癌细胞会沿着肠壁扩散，并通过它扩散至邻近腹部器官，还可能 进入血液循环，从而扩散到身体其它部分。大肠癌的致病原因尚不明确，主要有饮食环境因 素和遗传因素，并与癌前疾病及其它疾病有明显的关系。爱必妥(通用名西妥昔单抗，cetuximab)是一种IgGl单克隆抗体，能与表皮生 长因子受体(EGFR)特异性结合，阻断内源性配体介导的EGFR信号传导通路，从而抑制肿瘤 的生长。目前大量临床研究显示，爱必妥用于转移性结直肠癌以及头颈部鳞状细胞癌等多 种实体肿瘤的治疗取得了良好的疗效。自2003年12月在瑞士上市以来，爱必妥已在全球 50余个国家注册并上市用于治疗结直肠癌。2005年12月，中国SFDA批准爱必妥联合伊立 替康用于治疗经含伊立替康方案化疗失败且表达表皮生长因子受体的转移性结直肠癌。爱必妥是一种EGFR单克隆抗体，通过竞争性与EGFR结合，使得EGF等配体无法活 化EGFR，从而切断了细胞信号的传导。缺乏细胞信号的刺激，肿瘤细胞的生长受到抑制，肿 瘤血管生成受阻，癌症病人病情得到好转。然而KRAS基因突变位于EGFR信号通路的下游， 不受GFR活化状态的影响(包括不受爱必妥药物作用的影响)，可持续保持细胞信号通路开 放，促进肿瘤生长和转移。因此，KRAS基因突变的癌症病人对爱必妥治疗无效，KRAS基因突 变可做为预测爱必妥治疗大肠癌是否有效的重要指标。
发明内容
本发明提供一种检测大肠癌靶向用药基因位点多态性的试剂盒。该试剂盒包括检测KRAS基因上G12A/C/D/V和G13D位点多态性的特异性引物对 及特异性荧光探针对，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，反应缓冲液，去离子水。本试剂盒中所述的特异性引物和荧光探针对于本领域的普通技术人员来说是能 够轻易完成设计的，特异性引物和荧光探针对可用常规的DNA合成技术进行合成。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例检测试剂盒的使用步骤1:DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。步骤2 荧光定量PCR反应使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行荧光定量PCR反应，反应的体系为总 体积10 μ 1，包含浓度为20ng/ μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX荧光定量PCR反应缓冲液、 0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mMMgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合 酶、20 μ M的有义引物和反义引物各0. 225 μ 1、10 μ M的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针 各0. 25μ 1，去离子水5. 325 μ 1。在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环 的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤4:基因型分析根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示 的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因 型。
权利要求
1. 一种检测大肠癌靶向用药基因位点多态性的试剂盒，包括特异性引物对及特异性荧 光探针对，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水，其特征 在于所述的特异性引物对及特异性荧光探针对是针对KRAS基因上G12A/C/D/V和G13D位 点多态性设计的。
全文摘要
本发明公开了一种检测大肠癌靶向用药基因位点多态性的试剂盒。该试剂盒包括检测KRAS基因上G12A/C/D/V和G13D位点多态性的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过荧光定量PCR法来检测大肠癌治疗药物爱必妥和伊立替康的靶向用药位点的基因多态性。
文档编号G01N21/64GK102108388SQ20091020049
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月23日 优先权日2009年12月23日
发明者冯哲民, 贺宪民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司