一种检测乳蛋白含量的光激化学发光免疫定量试剂盒及方法

专利名称：：一种检测乳蛋白含量的光激化学发光免疫定量试剂盒及方法
技术领域：
：本发明涉及乳蛋白检测领域，特别涉及一种检测乳蛋白含量的光激化学发光免疫定量试剂盒及方法，适用于原料乳、乳制品、食品及饲料等乳蛋白含量的检测。
背景技术：
：牛奶是一种组成复杂、结构有序、具有胶体溶液特征的生物营养溶液，牛奶的营养素全面、易吸收，牛奶中含有的各种化学成分都是人体所必需的营养素，也是常人膳食中植物性蛋白质的重要补充。牛奶中大约含有3000种化合物，其中主要成分有水、脂肪、蛋白质、乳糖和矿物质，其微量成分有维生素、酶类、奁脂、色素、激素及生长因子、有机酸、气体和体细胞等。牛奶中各主要成分的含量因牛种和品种(遗传因素)、年龄和胎次、泌乳阶段和季节、饲养管理条件、产奶水平和挤奶技术，以及奶牛的个体特征和健康状况等有一定的差别。牛奶约含3.5%的乳蛋白质(人奶约1.25%)，包括酪蛋白、a_乳清蛋白、乳球蛋白、乳球蛋白和脂球膜蛋白、多种酶类等，其中以酪蛋白为主占蛋白总量86%左右，其次为a-乳清蛋白约占总蛋白量的9%，乳球蛋白占总蛋白量的3%左右，它们都含有全部必须的氨基酸，其相对含量与鸡蛋蛋白近似，消化率较高，为96.1%。乳蛋白质含量是牛奶最重要的质量指标之一，对于制造干酷和酸奶等乳制品的原料奶尤其重要，国家规定，只有乳蛋白质含量>的饮品才允许称为含乳饮料。牛奶中的酶有来母牛乳腺组织、血浆及白细胞的，称为原生酶，有来自微生物代谢产物的，称为细菌酶，有几种酶被用来控制和检验牛奶质量，最重要的有过氧化氢酶、酌酸酶和解脂酶等，牛奶中的酶对牛奶加工和乳品保存等方面都有影响。乳过氧化物酶是一种血红素蛋白存在于乳中，牛奶中正常含量为30μg/ml，其分子量为77.5ku。乳过氧化物酶/硫氰酸盐/过氧化氢(LP/SCN/H202)，简称为乳过氧化物酶体系(LP体系)，在牛奶中起强有力的抗菌作用，是牛乳天然抗菌能力的物质基础。牛奶及乳制品的蛋白质含量检测的现行国家标准是根据化学定氮法测算总氮含量来推算蛋白质含量，这也是国际通用的方法，但是这种方法不能分辨蛋白质的真伪，尤其是不能识别化学物质如三聚氰胺、尿素等添加后转变成的“蛋白质”，“大头娃娃米粉”、“三聚氰胺牛奶”事件的发生和蛋白含量检测方法的落后有直接的关系。能够精确定量检测原料乳及乳制品中特定蛋白含量的方法有高效液相色谱、毛细管电泳和质谱联用检测，这些仪器设备非常昂贵需要数百万元，日常维护和运行成本也很大，并且需要对样品进行繁琐的预处理，不适合生产中的常规检查。现在已有采用酶联免疫方法检测牛奶及奶制品中的三聚氰胺，但是非均相反应，需要反复清洗与分离，检测程序繁琐、耗时长、灵敏度和自动化程度不高，还有些比较方便快速的检测方法只能定性检测一个大致的含量范围不能定量。光激化学发光免疫定量法是在化学发光免疫分析的基础上引入激光激发和纳米微球技术，采用抗体特异性免疫捕获目标分子，以发光物质作为信号放大系统，通过测定发光强度检测免疫结合程度来定量，目标分子浓度和发光强度之间有很好的线性关系。光激化学发光免疫定量法成功的解决了上述检测方法的不足，因为反应是在均相进行，操作简单，样品不需要预处理，既加快了反应速度，又避免了反复分离与清洗的过程，可实现自动化操作，由于其高度的特异性、抗干扰、测量速度快、灵敏度高、稳定性好等优点，有很好的应用前景。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏度高的特异性检测乳蛋白含量的光激化学发光免疫定量试剂盒及方法。本发明通过将乳蛋白抗体包被的发光微粒、生物素标记的乳蛋白抗体(乳蛋白抗体与生物素的偶联物)以及亲和素包被的感光微粒，与被检测样品混合后，在均相条件下，乳蛋白抗体可迅速特异性捕获样品中的乳蛋白，形成感光微粒_抗体_乳蛋白_抗体_发光微粒复合体，在激光激发下，感光微粒能使周围环境中的氧转化为高能态离子氧，发光微粒在近距离接受离子氧的激发后发射高能级光子，用光子计数器检测这些高能级光子，光子数的多少即精确地反应乳蛋白分子的浓度，两者之间有良好的线性关系，通过标准曲线将光强度换算成乳蛋白浓度。根据现有技术，反应中的高能态离子氧在溶液中生存时间只有4微秒，可传播直径约为200nm，当样本中不含乳蛋白时，不能形成双抗体夹心的复合体，因距离太远活性氧离子无法传递到发光微粒表面就已经在溶液中迅速淬灭，发光微粒不能被激发无高能级光子产生。检测时原料乳及乳制品等样品不需要预处理可直接测定，仍然有很低的检测背景值。因此，本发明通过下列技术方案来解决上述问题一种检测乳蛋白含量的光激化学发光免疫定量试剂盒，其中包括乳蛋白抗体包被的发光微粒、生物素标记的乳蛋白抗体、亲和素包被的感光微粒以及缓冲液溶剂。根据本发明，所说的乳蛋白是指哺乳动物乳如牛乳、羊乳或马乳等乳中含有的蛋白质，例如酪蛋白、a-乳清蛋白、乳球蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、酌酸酶及解脂酶等；相应地，所说的乳蛋白抗体可以是以上述乳蛋白为抗原，以兔、鼠、羊等为免疫动物制备的单克隆抗体或多克隆抗体，包括各种亚型，本发明的试剂盒中使用的乳蛋白抗体可以选择其中的一个或多个，通常可以从市场购得。本发明优选兔抗牛的α-酪蛋白(a-casein)多克隆抗体、兔抗牛的α-乳清蛋白(α-lactalbumin)多克隆抗体作为乳蛋白抗体为例来具体说明。较佳地，试剂盒中还包括乳蛋白标准品，可以是以上抗体对应的抗原，本发明的试剂盒中的标准品优选0.1μg/ml酪蛋白溶液、0.1μg/ml的a_乳清蛋白溶液。根据本发明，所述的缓冲液溶剂，即乳蛋白检测时的反应溶液的溶剂可以是常规的适合抗原抗体反应的溶剂体系，如HEPES缓冲体系、Tris缓冲体系等。但本发明优选HEPES缓冲体系，可使检测方法更稳定。更优选地，所述的缓冲液溶剂为pH8.0,0.025M的HEPES缓冲体系。所述的PH8.00.025M的HEPES缓冲溶液每IOOOml含有HEPES6g,BSAlg,GlycerIOOg,Dextran-500lg，TritonX-IOO5g,EDTA-Na-2H200.372g,Proclin-3000.5g。所述的缓冲液溶剂中还可添加起封闭和蛋白保护作用的物质，以及防止微粒聚集的稳定试剂如Tween20，出于对试剂防腐及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂，防腐剂优选100U/ml庆大霉素和0.05v/v%&Proclin300[2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)]作为防腐剂。根据本发明，上述发光微粒是指填充有发光化合物和镧系元素化合物的高分子微粒，其中，发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环乙烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)3/Τ0Ρ0或Eu(TTA)3/Phen等，这些微粒可由市场上购得。发光微粒的发光量会直接影响最终检测的发光效果，市场提供的发光微粒发光量一般会在50，00010，000,000光子数/IOOug发光微粒范围内，本发明优选150，000350，000光子数/IOOug发光微粒。由于最终的检测反应是均相反应，发光微粒的粒径太小(<50nm)，会使制备过程中的清洗工作比较困难，不利于抗体连接，因此发光微粒的粒径范围应在50400nm之间，较好为100300nm之间，优选250nm。发光微粒的表面官团可以是任何能连接蛋白质的基团，如羧基、醛基、胺基、环氧乙基或卤代烷基等各种已知的可以连接蛋白质的官能团，最优化的微粒表面官能团为羧基或醛基，不同的微粒表面官能团，连接抗体的反应方式和条件也不相同。醛基表面的微粒有很好的亲水性，颗粒均勻稳定，微粒表面容易修饰，并且与蛋白的反应比较容易，采用NaBH3CN还原胺化反应，反应生成的碳氮键稳定，抗体连接的效率高，重复性好，本发明选取醛基作为连接蛋白的官能团。较佳的，所述的乳蛋白抗体包被的发光微粒可由下述方法制得1)混合将发光微粒与乳蛋白抗体混合于MES缓冲液中，其中发光微粒的浓度为1040mg/ml；2)反应加入MES缓冲液配制的NaBH3CN溶液混合并反应；3)封闭加入MES缓冲液配制的Glycin(甘氨酸)及NaBH3CN溶液，混勻反应后，再加入BSA溶液封闭；4)清洗产物，获得乳蛋白抗体包被的发光微粒。较佳地，步骤1)中每Img发光微粒加入0.052mg的乳蛋白抗体。其中，上述步骤1)_3)中的缓冲液可以是相同的反应缓冲液，可为MES缓冲液、磷酸缓冲液，优选MES缓冲液，浓度优选0.05M,pH为6.0。步骤4)清洗的方式可以为离心法清洗或透析法清洗。透析法清洗步骤采用反应缓冲液透析，每次45小时，更换缓冲液4次。透析清洗操作时间较长，且微粒损失较多，造成收率降低。离心法清洗步骤包括离心去上清，加入反应缓冲液洗涤，超声处理打开沉淀，如此反复35次。离心法清洗时离心力会使发光微粒暂时聚集在一起，但经过超声处理可以很容易再次分散打开，此法操作时间短，且收率较高。因此本发明优选采用离心法清洗方式。根据本发明，所述生物素标记的乳蛋白抗体中，生物素标记抗体的方法采用常规的方法(《生物实验室系列一分子免疫学实验指南》)进行，生物素与抗体的摩尔比较佳为5501，优选301。根据本发明，所述亲和素包被的感光微粒可根据现有技术制备(马宏伟，赵卫国，潘柏申，血清心肌肌钙蛋白I光激化学发光免疫测定法的建立[J].检验医学，2007，22(4)398-401)，亲和素包被的感光微粒采用NaBH3CN的还原胺化反应法制备，亲和素(Avidin)与感光微粒的质量比例无特殊限制，较佳为1310，优选15。市售感光微粒均适用于本发明，微粒粒径较佳为180260nm，优选220nm。本发明采用上述的试剂盒检测乳蛋白的光激化学发光免疫定量方法，其可包括下列步骤1)在反应孔中加入稀释后的待测样品、加有缓冲液溶剂的乳蛋白抗体包被的发光微粒混悬液及生物素标记的乳蛋白抗体混悬液，获得初始反应溶液，充分混合；2)加入加有缓冲液溶剂的亲和素包被的感光微粒混悬液获得最终反应溶液进行反应；3)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。较佳地，步骤1)中的乳蛋白抗体包被的发光微粒混悬液的浓度为50μg/ml，生物素标记的乳蛋白抗体混悬液的浓度为4μg/ml；步骤2)中的亲和素包被的感光微粒混悬液的浓度为80μg/ml。步骤2)所述的反应条件可同常规。步骤3)可采用现有技术，所述的激发光光源波长范围为600800nm，优选640680nm；发射光检测波长范围为500680nm，优选610620nm。本发明的试剂盒和检测方法以纳米级高分子微粒为基础，采用特异性抗体免疫捕获和化学发光相结合的定量检测技术来测定样本中酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白等乳蛋白含量，用于判断产品的质量优劣，具有快速、均相(免冲洗)、高灵敏、高通量和操作简单的特点，使用本发明的乳蛋白定量检测方法替代非特异性的化学定氮法检测乳蛋白含量，可以用于特异性、快速、准确、灵敏地检测乳及乳制品、蛋白类食品、饲料等产品中的乳蛋白含量，从而从根本上杜绝在产品中掺入含氮化合物或非乳蛋白的蛋白质冒充乳蛋白含量的事件。图1是实施例4.1组配的试剂盒的特异性检测结果图。检测样品分别是牛奶、酸奶、a_酪蛋白溶液、水、豆浆、牛血清白蛋白水溶液、水解酪蛋白溶液和鱼蛋白水溶液，纵坐标是光量子读数反映样品中酪蛋白含量的高低。图2是酪蛋白标准曲线图图3是实施例4.2组配的试剂盒测定的a_乳清蛋白标准曲线图具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。在下述实施例中，原料、试剂、仪器来源如下，其中所说的乳蛋白或乳蛋白抗体是以α-酪蛋白及其兔抗牛的多克隆抗体，α-乳清蛋白及其鼠抗牛的多克隆抗体，和乳过氧化物酶及其兔抗牛的多克隆抗体为例来说明。原料及试剂厂家酪蛋白抗体AbcamSSSSCaseinproteinSigmaα-乳清蛋白抗体α-lactalbumin-antibodyBethylα-乳清蛋白α-IactalbuminproteinSigma生物素Biotin-X-X-NHSSigmaTLC595%4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES华美生物工程公司三羟甲基氨基甲烷乙酸盐TrisSigma牛血清白蛋白BSAEquitech/proteasefree甘氨酸Sigma氰硼氢化钠NaBH3CNAcros感光微粒(粒径220nm)博阳生物科技公司发光微粒(粒径150-300nm)博阳生物科技公司仪器型号厂家粒径仪Model370Nicomp酶标仪MultiSKANMK3Iabsystem紫外可见分光光度计752P上海光谱有限公司荧光分光光度计F95上海棱光技术有限公司光激化学发光分析系统博阳生物科技公司各个反应体系缓冲液配制1)ρΗ8.0的HEPES缓冲液成分为0.05MHEPES、0.3MNaCl禾口0.0015MEDTA-Na-2H20，还含有0.lw/v%&BSA及100U/ml庆大霉素和质量百分比为0.05%的Proclin300。2)pH8.0的Tris缓冲液的成分为0.IMTris,0.3MNaCl和0.0015MEDTA-Na-2H20，0.lw/v%的BSA及100U/ml庆大霉素和质量百分比为0.05%的Proclin300。3.样品稀释缓冲液溶剂配制是PH8.025mMHEPES缓冲液每1000ml含有HEPES6g,BSAlg,Glycer100g,Dextran-500lg,TritonX_1005g，EDTA_Na_2H200.372g,Proclin-3000.5g。实施例1乳蛋白抗体包被的发光微粒的制备制备方法1)发光微粒混悬液处理吸取发光微粒于高速冷冻离心机中12000rpm离心30分钟，弃去上清，加入一定量0.05M、pH6.0的MES缓冲液(以下简称MES反应缓冲液)，超声使微粒重新悬浮，用MES反应缓冲液调节发光微粒浓度至100mg/ml。2)抗体处理用MES反应缓冲液透析乳蛋白抗体，透析完成后测定浓度，并用MES反应缓冲液调节浓度至8mg/ml。3)以125的体积比将MES反应缓冲液、步骤2)的乳蛋白抗体溶液、步骤1)的发光微粒混悬液及三部分进行混合，迅速混勻，得到反应液。4)用MES反应缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与步骤3)所得反应液125的体积比加入，迅速混勻，37°C旋转反应48小时。5)用MES反应缓冲液配制75mg/ml的Glycin溶液和25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与步骤4)所得反应液2110的体积比加入步骤4)所得反应液中，混勻，37°C旋转反应2小时。6)用MES反应缓冲液配制200mg/ml的BSA溶液，其与步骤5)所得反应液体积比为58，迅速混勻，37°C旋转反应16小时。7)用0.05M、pH8.0的MES缓冲液12000rpm离心3min,清洗三次，最后用pH8.0的MES缓冲液进行悬浮，测定粒径在150300nm范围，用pH8.0的MES缓冲液调节溶液体积使固体含量为10mg/ml。实施例2乳蛋白抗体与生物素偶联物的制备制备方法1)抗体处理按常规将乳蛋白抗体用0.1MNaHC03溶液透析，测定抗体浓度并调节至lmg/ml02)按常规用DMS0配制16.17mg/ml的Biotin(生物素)溶液。3)标记取步骤1)处理好的lmg/ml乳蛋白抗体与步骤2)配好的Biotin溶液，按照生物素和抗体溶液201的体积比进行混合，迅速混勻，28°C静置反应1216小时。4)按常规将反应好的乳蛋白抗体与生物素的偶联物用pH8.OTris缓冲液透析。5)将步骤4)透析好的生物素和抗体的偶联物吸出转移至干净离心管中，取样测定抗体浓度，PH8.OTris缓冲液调节浓度至0.5mg/ml。6)按照步骤3)将生物素与抗体按照不同体积比制备偶联物，用pH8.OTris缓冲液稀释成g/ml，按照实施例5方法检测lOOng/ml标准品溶液每孔发光光子量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从发光强度判断，20401比较好，优选301，但是不同的抗体之间有一定的差距。实施例3亲和素包被的感光微粒的制备可以采用现有技术，具体制备方法如下1)感光微粒混悬液处理选用粒径为220士40nm的感光微粒，吸取一定量的感光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声震荡至微粒重新悬浮，加入MES反应缓冲液调节感光微粒浓度至100mg/ml。2)亲和素溶液配制称量一定量Avidin，加MES反应缓冲液溶解至8mg/ml。3)混合将处理好的感光微粒混悬液、8mg/ml的亲和素以及MES反应缓冲液，以2:5:1的体积比进行混合，迅速混勻，得到反应液。4)反应MES反应缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与步骤3)的反应液125的体积比加入，迅速混勻，37°C旋转反应48小时。5)封闭MES缓冲液配制75mg/ml的Glycin溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照与步骤4)的反应液2110的体积比加入步骤4)的溶液中，混勻，37°C旋转反应2小时。6)再加入200mg/ml的BSA溶液(MES反应缓冲液)，其与反应液体积比为58，迅速混勻，37°C旋转反应16小时。7)清洗向反应好的溶液中加入pH8.0MES缓冲液，高速冷冻离心机离心，弃上清，加入新鲜PH8.0的MES缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次，最后用少量的缓冲液溶剂进行悬浮，测定固含量，用缓冲液溶剂调节浓度至10mg/ml。实施例4试剂盒的组配4.1组建检测乳蛋白的光激化学发光免疫定量试剂盒，使其包含下列组分，其中乳蛋白抗体包被的发光微粒、乳蛋白抗体和生物素偶联物和亲和素包被的感光微粒以缓冲液溶剂为溶剂介质配成实际检测所需浓度的混悬液，所述浓度可以根据需要进行调整。1)试剂a50ug/ml酪蛋白抗体包被的发光微粒混悬液2)试剂b:4yg/ml酪蛋白抗体和生物素偶联物混悬液3)试剂c80ug/ml亲和素包被的感光微粒混悬液4)标准品溶液0.1ug/ml酪蛋白溶液4.2组建检测乳蛋白的光激化学发光免疫定量试剂盒，使其包含下列组分1)试剂a50ug/mla-乳清蛋白抗体包被的发光微粒混悬液2)试剂b:4yg/mla-乳清蛋白抗体和生物素偶联物混悬液3)试剂c80ug/ml亲和素包被的感光微粒混悬液4)标准品溶液0.1ug/ml的a-乳清蛋白溶液。实施例5牛奶样品中酪蛋白浓度检测5.1用试剂盒检测牛奶中酪蛋白含量分别取10ii、9.5ii、10.5iU牛奶(超市购买盒装)加样品缓冲液至1ml，混合均勻，从中吸取lOiil加样品缓冲液至1ml，混合均勻，再次从中吸取10i!加样品缓冲液至lml，混合均勻，为样品检测溶液。移液器吸取检测溶液5yl于96孔检测板，依次加入10yl试剂a(50i!g/ml酪蛋白抗体包被的发光微粒)和lOyl试剂b(4yg/ml酪蛋白抗体和生物素偶联物)，将检测板放入检测仪，设定程序条件为振动，37°C孵育20min，加入25iU试剂c(80ug/ml亲和素包被的感光微粒)，37°C孵育15min，680nm激发光逐孔照射，检测波长610620nm，检测发光光子量。根据标准曲线计算样品中乳蛋白的浓度，也可以用回归方程法计算出样本中乳蛋白的含量。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>5.2试剂盒特异性试验分别取0.lml牛奶、酸奶、酪蛋白标准品溶液、水、豆浆、牛血清白蛋白水溶液、水解酪蛋白、鱼蛋白水溶液，按照5.1中的方法，检测发光光子量，比较试剂盒的特异性，结果见下图。5.3试剂盒线性检测取适量0.1ug/ml的酪蛋白标准品溶液用样品缓冲液稀释配成0.001ug/ml、0.006ug/ml,0.01ug/ml,0.03ug/ml,0.06ug/ml,0.1ug/ml共6个浓度的酪蛋白定标溶液，按照上述5.1中的方法测定乳蛋白的浓度，重复3次求平均值，做线性分析，R2=0.9924。实施例6牛奶中a-乳清蛋白浓度检测6.1用试剂盒进行检测取0.lml牛奶(超市购买盒装)加样品缓冲液至1ml，混合均勻，从中吸取0.01ml加样品缓冲液至1ml，混合均勻，再次从中吸取0.01ml加样品缓冲液至1ml，混合均勻，为样品检测溶液。移液器吸取检测溶液5ill于96孔检测板，依次加入10u1试剂a(50ug/mla-乳清蛋白抗体包被的发光微粒)和10yl试剂b(4ug/mla-乳清蛋白抗体和生物素偶联物)，将检测板放入检测仪，设定程序条件为振动，37°C孵育20min，自动加入25yl试剂c(80ug/ml亲和素包被的感光微粒)，37°C孵育15min，680nm激发光逐孔照射，检测波长610620nm，检测发光光子量。根据标准曲线计算样品中a_乳清蛋白的浓度，也可以用回归方程法计算出样本中乳清蛋白的含量。利用专业电脑软件可以直接读取浓度结果，便于大量样本的快速分析。6.2试剂盒精密度试验取二个已知浓度的a_乳清蛋白溶液于同一个96孔检测板，每孔5yl共加9孔，按照6.1中的方法，测定a_乳清蛋白浓度，计算变异系数CV%。结果表明变异系数范围在6.27.2%之间，变异系数小于10%。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>6.3试剂盒线性检测取适量0.1ug/ml的a-乳清蛋白标准品溶液用样品测定缓冲液稀释配成lOOng/ml,30ng/ml,10ng/ml,3ng/ml,lng/ml,0.3ng/ml共6个浓度的a_乳清蛋白定标溶液，用缓冲液为空白对照，按照上述6.1中的方法测定乳蛋白的浓度，重复3次求平均值，做线性分析，R2=0.9988。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求一种检测乳蛋白的光激化学发光免疫定量试剂盒，其特征在于其包括乳蛋白抗体包被的发光微粒、生物素标记的乳蛋白抗体、亲和素包被的感光微粒以及缓冲液溶剂。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的缓冲液溶剂为PH8.025mMHEPES缓冲液。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的PH8.025mMHEPES缓冲液每IOOOml含有HEPES6g,BSAlg,Glycer100g,Dextran-500lg，TritonX-1005g，EDTA-Na_2H200.372g,Proclin-3000.5g。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的乳蛋白抗体包被的发光微粒由下述方法制得1)混合将发光微粒与乳蛋白抗体混合于MES缓冲液中，其中发光微粒的浓度为1040mg/ml；2)反应加入MES缓冲液配制的NaBH3CN溶液混合并反应；3)封闭加入MES缓冲液配制的Glycin及NaBH3CN溶液，混勻反应后，再加入BSA溶液封闭；4)清洗产物，获得乳蛋白抗体包被的发光微粒。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于步骤1)中每Img发光微粒加入0.052mg的乳蛋白抗体。6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的MES缓冲液的浓度为0.05M、pH为6.0。7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的乳蛋白选自酪蛋白、乳清蛋白和乳铁蛋白。8.一种采用如权利要求17任一项所述的试剂盒检测乳蛋白的光激化学发光免疫定量方法，其特征在于包括下列步骤1)在反应孔中加入稀释后的待测样品、加有缓冲液溶剂的乳蛋白抗体包被的发光微粒混悬液及生物素标记的乳蛋白抗体混悬液，获得初始反应溶液，充分混合；2)加入加有缓冲液溶剂的亲和素包被的感光微粒混悬液获得最终反应溶液进行反应；3)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于步骤1)中的乳蛋白抗体包被的发光微粒混悬液的浓度为50μg/ml，生物素标记的乳蛋白抗体混悬液的浓度为4μg/ml；步骤2)中的亲和素包被的感光微粒混悬液的浓度为80μg/ml。10.如权利要求8所述的方法，其特征在于步骤3)所述的激发光光源波长范围为600800nm；发射光检测波长范围为500680nm。全文摘要本发明公开了一种检测乳蛋白的光激化学发光免疫定量试剂盒和方法。该试剂盒包括乳蛋白抗体包被的发光微粒、生物素标记的乳蛋白抗体、亲和素包被的感光微粒以及缓冲液溶剂。本发明的试剂盒和方法可以快速、灵敏、准确、专一性测定原料乳和乳制品及其他产品中酪蛋白、乳清蛋白等乳蛋白含量。文档编号G01N21/63GK101813699SQ20091020582公开日2010年8月25日申请日期2009年10月9日优先权日2009年10月9日发明者毛晓伏申请人:毛晓伏