专利名称：：一种检测肠道病毒71型的荧光定量rt-pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型(EV71)试剂盒及其应用，适用于EV71病毒定量检测。
背景技术：
：手足口病(Hand，footandmouthdisease，HFMD)是由肠道病毒引起的传染病，近年来各地均有散在发生。该病常见于学龄前儿童，婴幼儿多见，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，一般预后良好，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。手足口病的传染源为病人和隐性感染者，主要是通过密切接触感染者的粪便、口腔分泌物、皮肤疱疹液中的病毒，经粪-口途径或呼吸道(主要是口腔粘膜和鼻腔粘膜)传播。现已知的引起手足口病的病原体是属于小RNA病毒科的多种肠道病毒，主要有柯萨奇病毒A组的4、5、7、9、10、16型；柯萨奇病毒B组的2、5型；肠道病毒71型以及埃可病毒。根据国内外资料，与其他肠道病毒引起的手足口病相比，由EV71感染引起的疾病发生重症感染的比例较大，病死率也较高。因此，对可引起重症手足口病的EV71的检测对于疾病的控制和治疗非常重要。肠道病毒实验室检测方法主要有三种病毒分离、抗体测定和核酸扩增方法。前两种方法繁琐费时，不适宜早期诊断。现有的核酸扩增方法有RT-PCR法和荧光定量RT-PCR法，RT-PCR法操作繁琐费时，检测灵敏度略低。近几年发展起来的荧光定量PCR技术较常规RT-PCR技术不仅实验操作简单快捷，并且提高了检测的敏感性、特异性，当然它对引物和探针的设计也提出了更高的要求。现有荧光定量RT-PCR法采用TaqMan探针，可准确快速的对待测样品进行定性的检测，目前国内也已有对EV71的TaqMan探针荧光定量RT-PCR的定性检测试剂盒。本发明创新性的设计使用了TaqMan-LNA探针，LNA是一种新型的核酸衍生物，它是在戊糖环的2'-0,4'-C之间通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形。这个环形桥锁定了吠喃糖C3-内趋型的N结构，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA强化的杂交特征和对熔点温度的影响，可以灵活设计长度较短的含有LNA的实时定量PCR探针，以提高荧光定量PCR的特异性。LNA修饰的寡核酸探针不仅可加强探针对目标序列杂交的特异性，同时能够显著提高杂交效率和热稳定性。同时本发明利用体外转录RNA标准品和待测样品共同检测，对样品所含的EV71病毒拷贝数进行定量检测。
发明内容本发明的目的是提供一种检测肠道病毒71型的荧光定量RT-PCR试剂盒，该试剂盒能快速准确的对待测样品的肠道病毒71型进行定量检测。该试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量PCR仪，而且能够灵敏特异的对EV71进行定量检测。本发明的另一个目的是提供一种荧光定量RT-PCR试剂盒在EV71定量检测中的应用。本申请发明人从美国的NCBI基因库上下载了世界各地的所有EV71毒株的vpl基因序列近千条，对其进行了同源性比对，寻找到EV71vpl基因的保守区域，并通过NCBI数据库进行了Blast同源性比对验证，在其保守区域设计上下游引物和TaqMan-LNA探针，对该区域进行特异性扩增用于检测EV71。本发明采用TaqMan-LNA探针建立了荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒，同时通过制备RNA标准品与样品同时检测得到待测样品的初始病毒拷贝数，对病毒进行定量检测。本发明所说的检测肠道病毒71型的荧光定量RT-PCR试剂盒，包括(1)EV71的RNA定量标准品。(2)检测引物上游引物(EV7I-Pf)5'-AGGATTTACATGAGAATGAAGCA-3‘和下游引物(EV71-Pr)5'-GCATAATTTGGGTTGGCTTT-3‘。(3)TaqMan-LNA探针(EV7ITaciMan-LNA)5‘-TCA+GGGCGT+GGATACCTCGC-3‘(荧光探针5'端标记一荧光报告基团，3'端标记一荧光淬灭基团，+表示LNA修饰+右侧碱基)。(4)RT-PCR缓冲液，(5)AMV逆转录酶，(6)Taq酶，(7)RNaseFreedH20。上述所说的EV71的RNA定量标准品是通过以下制备得到；用病毒RNA提取试剂盒提取一EV71病毒RNA，以EV71病毒RNA为模板，用上游引物5‘-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACACAAACAGGA-3‘和下游引物5'-TTTTTTTTTTTTTTTGGCTTAATGGAGTTGCCAGCATA-3‘进行RT-PCR扩增，PCR产物纯化后用T7体外转录试剂盒转录RNA，用DNase酶消化剩余的DNA，然后将转录RNA产物纯化，得到EV71的RNA标准品。用核酸蛋白分析仪测定体外转录产物的含量后，根据公式计算RNA标准品的拷贝数，，记录RNA标准品的定量拷贝数，将其保存在含有EDTA，poly(A)RNA和叠氮钠的溶液中。本发明还公开了该试剂盒在快速检测肠道病毒71型中的应用。本发明还提供了使用本发明的试剂盒对肠道病毒71型进行检测的方法将(1)RNA定量标准品做一系列的十倍稀释，以待测样品RNA和一系列十倍稀释的RNA标准品为模板，以(7)RNaseFreedH20为阴性对照，将试剂盒(2)-(7)所述的EV71上游引物、下游引物、TaqMan-LNA探针和其他试剂同时加入反应体系中，于荧光定量PCR仪进行RT-PCR反应，根据倍比稀释的RNA标准品的Ct值和其拷贝数得到EV71的检测标准曲线，从而可以得出拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式。根据待测样品荧光检测的Ct值即可以得到样品的定量结果。既可把待测样品的Ct值代入表达式就可以算出它的初始病毒拷贝数，也可以从仪器直接读取初始拷贝数。利用本发明的TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒及检测方法时，可以准确快速的得到样品的EV71病毒RNA初始拷贝数，应用于基层CDC对手足口病的监测，指导疾病控制人员的相关卫生防疫工作，帮助临床医生更好的掌握对EV71感染手足口病的治疗、预后和转归。本发明的有益效果主要体现在本试剂盒对肠道病毒71型的检测有高度的特异性，与其他肠道病毒无交叉反应；检测的灵敏度达IO2拷贝，可直接从疑似手足口病患者的脑脊、疱疹液、咽拭子和肛拭子等标本中检测肠道病毒71型核酸；利用本发明试剂盒检测操作简单快速，从病毒核酸提取至完成检测仅需2到3小时。图1是EV71RNA标准品荧光定量RT-PCR的动力学曲线。图中荧光曲线1_6对应的样品分别是1.567XIO9拷贝/uL、l.567XIO8拷贝/uL、l.567XIO7拷贝/uL、l.567XIO6拷贝/uL、l.567XIO5拷贝/uL的RNA标准品和阴性对照。图2是EV71RNA标准品荧光定量RT-PCR的标准曲线。图3是临床阳性样品和阴性对照EV71荧光定量RT-PCR的动力学曲线。图中荧光曲线1-2对应的分别是一个阳性样品和一个阴性对照。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例ITaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒组成包括(1)RNA定量标准品。用病毒RNA提取试剂盒如RocheHighPureViralRNAExtractionKit,QiagenViralRNA/DNAExtractionKit等，按试剂说明书操作，提取一EV71病毒RNA，以EV71病毒RNA为模板，用上游引物5‘-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACACAAACAGGA-3‘和下游引5'-TTTTTTTTTTTTTTTGGCTTAATGGAGTTGCCAGCATA-3‘进行RT-PCR扩增，PCR产物纯化后用T7体外转录试剂盒转录RNA，用DNase酶消化剩余的DNA，然后将转录RNA产物纯化，得到EV71的RNA标准品。用核酸蛋白分析仪测定体外转录产物的含量为2.Ing/uL，转录产物大小为237bp，根据公式计算RNA标准品的拷贝数为1.567XIO10拷贝/uL，记录RNA标准品的定量拷贝数，将其保存在含有EDTA、poly(A)RNA和叠氮钠的溶液中。(2)检测引物上游弓丨物(EV71-Pf)5‘-AGGATTTACATGAGAATGAAGCA-3‘和下游引物(EV71-Pr)5'-GCATAATTTGGGTTGGCTTT-3‘，引物使用浓度为10uM。(3)TaciMan-LNA探针(EV71TaciMan-LNA)-TCA+GGGCGT+GGATACCTCGC-3‘(荧光探针5'端标记一荧光报告基团FAM，3'端标记一荧光淬灭集团BHQ，+表示LNA修饰+右侧碱基)，探针使用浓度为10uM。(4)RT-PCR缓冲液，(5)AMV逆转录酶，(6)Taq酶，(7)RNaseFreedH20。所用试剂均购自TAKARA公司。所用引物和探针均由上海生物工程公司合成。实施例2=TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒检测应用实例(1)病毒核酸的提取提取待测样品的病毒RNA，所述样品RNA的提取可按常规方法进行，如RocheHighPureViralRNAExtractionKit、QiagenViralRNA/DNAExtractionKit、TaKaRaViralRNAExtractionKit或其他常用提取病毒RNA试剂盒，操作按试剂说明书进行，病毒细胞培养物和疱疹液按上述方法直接提取，直肠拭子和咽拭子样本将拭子挤尽后提取。(2)RNA标准品标准曲线绘制把含有1.567XIO10拷贝/uL的转录RNA标准品用水10倍系列稀释成若干个稀释度。(3)荧光定量RT-PCR检测方法的建立荧光定量RT-PCR的反应体系参照TaKaRaOneStepRNAPCRKit说明书配制，采用25μL反应体系，以待测样品RNA和分子个数为1.567XIO9-L567XIO5拷贝/uL的一系列RNA标准品为模板，以RNaseFreedH20为阴性对照，将EV71上游引物、下游引物和TaqMan-LNA探针同时加入反应体系中，于荧光定量PCR仪进行反应。所述RT-PCR反应液每25ul组成如下试剂使用量2XOneStepRT-PCRBufferIII12.5μ1TaKaRaExTaqTMHS(5U/ul)0.5μ1PrimeScriptTMRTEnzymeMixII0.5μ1PCRForwardPrimer(IOuM)0.5μ1PCRReversePrimer(IOuM)0.5μ1Probe溶液(IOuM)1μ1RNA2ulRNaseFreedH20补至25μ1荧光定量RT-PCR优化后的反应条件如下第一阶段为RNA样品反转录反应420C5min反转录，95°CIOs终止反转录；第二阶段为PCR反应95°C5s,55°C30s，在55°C进行单点荧光检测，共40个循环。(4)结果判定分子个数分别为1.567XIO9一1.567XIO5拷贝/uL的一系列标准品进行荧光定量RT-PCR的动力学曲线见图1，从左向右的反应模板依次为3.134X109-3.134X105拷贝/反应。以起始模板的对数为X轴，Ct值为Y轴做回归曲线，即得到EV71检测的标准曲线，，见图2。斜率为-0.2613，截距为11.42，相关系数为0.999，，从而可以得出拷贝数与值之间的线性关系表达式Y=-0.2613X+11.42。样品的Ct值可以从仪器读取，动力学曲线见图3。把待测样品的Ct值29.50代入表达式Y=-0.2613X+11.42，就可以算出它的初始病毒拷贝数5.148XIO3拷贝/反应，也可以从仪器直接读取初始拷贝数。利用该TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测方法，即可以得到待测样品的EV71病毒RNA的拷贝数2.507XIO3拷贝/uL。实施例3TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒检测方法的特异性、灵敏度、重复性(1)TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒检测方法的特异性利用该TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒检测方法对肠道病毒EV71有较好的特异性，对12株已测序确认vpl序列的EV71病毒RNA均出现相应的特异性荧光扩增曲线，呈阳性反应。对CA16、EV72、HCV、C0XB5、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒等病毒RNA未出现相应的特异性荧光扩增曲线，呈阴性反应。结果表明，所设计的引物和探针只对目的病毒EV71特异，与其它检测对象无交叉反应。(2)TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒检测方法的灵敏度将已确定拷贝数的EV71RNA标准品进行十倍系列稀释后进行荧光RT-PCR。检测结果显示，该方法检测EV71的灵敏度为IO2拷贝/反应。(3)TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒检测方法的重复性将EV71RNA标准品进行十倍系列稀释，在同一次实验中，，选取三个稀释度RNA标准品，对每一个浓度的标准品做6次重复荧光RT-PCR检测，结果各稀释度样品的6个平行反应获得的Ct值变异系数均在1.13%以下。对上述各梯度稀释的样品进行组间重复实验(每天检测一次，检测6d)，结果各稀释度样品的6次检测所获得的Ct值变异系数均在2.02%以下(见表1)。以上数据表明本研究所建立的荧光定量RT-PCR检测方法重复性好，可对EV71进行稳定、可靠的检测。表1荧光定量RT-PCR检测EV71的重复性实验<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><110>镇江市疾病预防控制中心茅凌翔<120>一种检测肠道病毒71型的荧光定量RT-PCR试剂盒<130><160>5<170>PatentInversion3.3<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>1taatacgactcactatagggagaacacaaacagga35<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>2tttttttttttttttggcttaatggagttgccagcata38<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3aggatttacatgagaatgaagca23<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4gcataatttgggttggcttt20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5tcagggcgtggatacctcgc20权利要求一种检测肠道病毒71型的荧光定量RT-PCR试剂盒，该试剂盒包括(1)EV71的RNA定量标准品；(2)检测引物上游引物EV71-Pf5′-AGGATTTACATGAGAATGAAGCA-3′和下游引物EV71-Pr5′-GCATAATTTGGGTTGGCTTT-3′；(3)TaqMan-LNA探针5′-TCA+GGGCGT+GGATACCTCGC-3′，其中，荧光探针5′端标记一荧光报告基团，3′端标记一荧光淬灭基团，+表示LNA修饰+右侧碱基；(4)RT-PCR缓冲液，(5)AMV逆转录酶，(6)Taq酶，(7)RNaseFreedH2O。2.根据权利要求1所述的检测肠道病毒71型的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，其中的EV71的RNA定量标准品是通过以下方法得到用病毒RNA提取试剂盒提取一EV71病毒RNA，以EV71病毒RNA为模板，用上游引物5‘-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACACAAACAGGA-3‘和下游引物5‘-TTTTTTTTTTTTTTTGGCTTAATGGAGTTGCCAGCATA-3‘进行RT-PCR扩增，PCR产物纯化后用T7体外转录试剂盒转录RNA，用DNase酶消化剩余的DNA，然后将转录RNA产物纯化并定量，得到EV71的RNA标准品。3.权利要求1所述的试剂盒在快速检测肠道病毒71型中的应用。4.一种使用权利要求1所述试剂盒对肠道病毒71型进行检测的方法，其特征在于，是将EV71的RNA定量标准品做一系列的十倍稀释，以待测样品RNA和一系列十倍稀释的RNA标准品为模板，以RNaseFreedH20为阴性对照，将试剂盒中所述(2)-(7)的EV71上游引物、下游引物、TaqMan-LNA探针和其他试剂同时加入反应体系中，于荧光定量PCR仪进行RT-PCR反应，根据一系列的RNA标准品的Ct值和其拷贝数得到EV71的检测标准曲线，从而可以得出拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式，根据待测样品荧光检测的Ct值即可以得到样品的定量结果。全文摘要本发明涉及一种检测肠道病毒71型的荧光定量RT-PCR试剂盒及使用方法。所说的试剂盒包括(1)EV71的RNA定量标准品；(2)检测引物；(3)TaqMan-LNA探针，(4)RT-PCR缓冲液，(5)AMV逆转录酶，(6)Taq酶，(7)RNaseFreedH2O。本试剂盒对肠道病毒71型的检测有高度的特异性，与其他肠道病毒无交叉反应；检测的灵敏度达102拷贝，可直接从疑似手足口病患者的脑脊液、疱疹液、咽拭子和肛拭子等标本中定量检测肠道病毒71型核酸；利用本发明试剂盒检测操作简单快速，从病毒核酸提取至完成检测仅需2到3小时。文档编号G01N21/64GK101812538SQ200910212648公开日2010年8月25日申请日期2009年11月13日优先权日2009年11月13日发明者徐岚,徐顺高,杨静,茅凌翔,葛琴娟,韩方岸,鲍务新申请人:镇江市疾病预防控制中心;茅凌翔