专利名称：：蟹变应原特异性IgE的ELISA检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种定性检测人血清中蟹变应原特异性IgE的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒及其制备方法，筛查和诊断因进食或接触蟹类食物而引起的过敏症。
背景技术：
：食物过敏反应是现代社会中常见的一大类疾病，其发生是因进食或接触各种食物中的变应原而引起的，大都是由IgE介导的I型超敏反应。食物过敏反应的发病机理主要涉及两方面因素，一是食物变应原的剌激，另一个是个体的反应性。当食物变应原进入机体后，激活特异性B细胞克隆产生针对该变应原的特异性IgE，IgE以其Fc段与肥大细胞、嗜碱性粒细胞表面的IgEFc受体(FceR)结合，使机体处于致敏状态。当机体再次受到相同的变应原剌激时，再次进入的变应原与已结合在肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的特异性IgE结合，引起FceR桥联，激活肥大细胞和嗜碱性粒细胞，通过一系列膜分子行为导致细胞脱颗粒、释放和合成组胺、激肽酶原、前列腺素、白三烯、血小板活化因子等多种生物活性介质，作用于血管、皮肤、粘膜、腺体等靶器官，引起支气管平滑肌收縮、血管扩张、毛细血管通透性增加、组织水肿及呼吸道和消化道炎症反应；导致支气管哮喘，过敏性鼻炎，过敏性胃肠炎，过敏性荨麻疹，严重时可引起过敏性休克。正常人血清中IgE的量极低，约为5X10—Smg/ml，用特异性变应原进行检测时一般呈阴性反应。发生过敏反应的个体血清中IgE含量显著升高，可比正常高出10002000倍，用特异性变应原进行检测时都呈阳性反应。因此，应用变应原作为抗原检测血清中的特异性IgE，是理想的I型超敏反应的临床诊断指标之一。
发明内容本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、方便快速地定性检测人血清中蟹变应原特异性IgE的ELISA检测试剂盒，用以筛查和诊断蟹类食物过敏症。本发明的蟹变应原特异性IgEELISA检测试剂盒，其组成包括已包被纯化的蟹变应原蛋白的酶标反应板、酶标记抗体、底物显色液、样品稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、浓縮洗涤液和终止反应液；其中包被酶标反应板的蟹变应原蛋白是从中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)组织蛋白中经过分离纯化得到的纯化变应原蛋白，包括分子量为29KDa、34KDa、35KDa、41KDa、48KDa、53KDa、60KDa、66KDa和76KDa的9种蛋白质，以其中任意1种或1种以上组合包被酶标反应板作为检测抗原。酶标记抗体辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgE抗体；底物显色液1.25mmol/L3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)、12mmol/L过氧化脲、15mmol/L拧檬酸-5mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4;样品稀释液75mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0-7.4，含0.1%Tween-20、庆大霉素3100u/ml、0.01%硫柳荥和0.01%山梨酸、1%牛血清白蛋白；阳性对照血清蟹变应原特异性IgE阳性血清混合物；阴性对照血清正常人血清混合物；浓縮洗涤液0.25mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4，含1%Tween-20、0.01%硫柳汞和0.01%山梨酸；终止反应液:lmol/LH2S04。本发明的蟹变应原特异性IgEELISA检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤(1)包被酶标反应板用纯化的中华绒螯蟹变应原蛋白为抗原包被酶标反应板；(2)封闭酶标反应板用封闭液封闭已包被蟹变应原蛋白的酶标反应板；(3)配制酶标记抗体；(4)配制底物显色液；(5)配制样品稀释液；(6)配制浓縮洗涤液和终止反应液。本发明的蟹变应原特异性IgEELISA检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤(1)取待检样品、阳性对照血清、阴性对照血清分别加入相应的酶标反应板反应孔中，37t:孵育30分钟，使待检样品以及阳性对照血清中特异性IgE与包被在酶标反应板反应孔中的蟹变应原特异性结合；(2)用洗涤液洗涤，除去未结合的杂蛋白和其它物质；(3)于酶标反应板反应孔中加入HRP标记的羊抗人IgE抗体，37。C孵育30分钟，使HRP标记的羊抗人IgE抗体与已结合在反应孔固相的特异性IgE结合；(4)用洗涤液洗涤，除去未结合的酶标记抗体；(5)于酶标反应板反应孔中加入底物显色液，37t:或室温孵育15分钟，使标记酶分解底物出现颜色反应；(6)于酶标反应板反应孔中加入终止反应液，终止酶反应后，用酶标仪在450nm波长下测定吸光值。具体实施方法下面的实施例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。实施例一蟹变应原特异性IgEELISA检测试剂盒的制备。本试剂盒的制备过程包括如下步骤1.包被酶标反应板用包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.5-9.6)将纯化的中华绒螯蟹的76KDa变应原蛋白稀释至4g/ml，于96孔(或48孔)酶标反应板每孔加入50(变应原蛋白包被量为200ng/孔)，将加好包被抗原液的酶标反应板置湿盒内，于37t:孵育3小时，然后放置4t:过夜。次日甩去包被液，用洗涤液洗酶标反应板三次，拍干。2.封闭酶标反应板于酶标反应板每孔加入封闭液(含2%脱脂牛奶粉的0.Olmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4)220iil，置湿盒内，于37t:孵育3小时，然后放置4t:过夜。次日甩去包被液，用洗涤液洗酶标反应板三次；将酶标反应板真空干燥，装入带有干燥剂的铝箔袋内密封，贮存于4°C。3.配制酶标记抗体用样品稀释液将HRP标记的羊抗人IgE抗体(购自美国KPL公司)稀释为1:2500浓度；分装于小试剂瓶，贮存于4°C。4.配制底物显色液底物显色液成分为1.25mmol/L3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)、12mmol/L过氧化脲、15mmol/L柠檬酸-5mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4。先按配液总量的8090%配制15mmol/L拧檬酸-5mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，调节pH至5.4;准确称取所需量的过氧化脲加入缓冲液内，使完全溶解并充分混匀；准确称取所需量的TMB用适量乙醇溶解，缓慢加入缓冲液内，充分混匀；最后用蒸馏水定容至配液总量；分装于小试剂瓶，贮存于4°C。5.配制样品稀释液样品稀释液成分为75mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0-7.4，含0.1%Tween-20、庆大霉素100u/ml、0.01%硫柳荥和0.01%山梨酸、1%牛血清白蛋白。先按配液总量的8090%配制75mmol/L磷酸盐缓冲液，调节pH至7.2;按所需量加入庆大霉素(原液8万u/ml或4万u/ml)、1%的硫柳汞和10%的山梨酸，使其终浓度分别为100u/ml、0.01%和0.01%，充分混匀；准确称取所需量的牛血清白蛋白加入缓冲液内，使完全溶解并充分混匀；按所需量加入Tween-20使其终浓度为0.1%，充分混匀；最后用蒸馏水定容至配液总量；分装于小试剂瓶，贮存于4°C。6.配制浓縮洗涤液浓縮洗涤液为20倍浓縮，成分为0.25mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4，含1%Tween-20、0.01%硫柳荥和0.01%山梨酸。先按配液总量的8090%配制0.25mol/L磷酸盐缓冲液，调节pH至7.4，按所需量加入1%的硫柳汞和10%的山梨酸，使其终浓度分别为0.01%和0.01%，充分混匀；按所需量加入Tween-20使其终浓度为1%，充分混匀；最后用蒸馏水定容至配液总量；分装于小试剂瓶，贮存于4t:。7.配制终止反应液终止反应液成分为lmol/LH2S04，按常规方法配制；分装于小试剂瓶，贮存于4°C。8.阳性对照与阴性对照将蟹变应原特异性IgE阳性血清混合均匀，用样品稀释液适当稀释，使其经本试剂盒检测的0D45。值在12之间，分装于小试剂瓶，贮存于4°C。阴性对照血清用样品稀释液适当稀释(或不稀释)，分装于小试剂瓶，贮存于4°C。实施例二用蟹变应原特异性IgEELISA检测试剂盒检测临床疑似蟹类食物过敏症患者血清对32例临床疑似蟹类食物过敏症的患者，用本发明的ELISA试剂盒检测其血清中的蟹变应原特异性IgE，操作步骤如下1.取铝箔包装的48孔已包被酶标反应板1块，平衡至室温后，开启包装袋取出酶标反应板。2.设置阳性对照、阴性对照和空白孔本例设置A12孔为阳性对照孔，加入阳性对照50iU/孔；B12孔和C12孔为阴性对照孔，分别加入阴性对照50iU/孔；Cll孔为空白，加入样品稀释液50iU/孔。3.加样取待检血清编号，从酶标反应板A1至All孔、B1至Bll孔、C1至CIO孔依次加入待检血清，50iU/孔；用封口胶纸封好酶标反应板反应孔，置37t:温箱孵育30分钟。4.洗板取浓縮洗涤液用蒸馏水稀释20倍；酶标反应板孵育结束后撕下封口胶纸，甩去反应孔中的液体，在吸水纸上拍干；于反应孔中加满洗涤液，静置约30秒，甩去反应孔中的液体，在吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。5.加酶标记抗体于酶标反应板每孔加入HRP标记的羊抗人IgE50iil，用封口胶纸封好反应孔，置37t:温箱孵育30分钟；如步骤4洗板5次。6.加底物显色于酶标反应板每孔加入底物显色液50iU，置37t:温箱或室温下反应15分钟。7.终止反应测OD值于酶标反应板每孔加入终止反应液50iil(或2滴)，混匀，在10分钟内用酶标仪在450nm波长下以空白孔调零，测定吸光值(OD值)。8.结果判断(1)以阴性对照孔OD值的平均值X2.1为阈值(cutoff值，CO值)，样品孔0D值^cutoff值的判断为蟹变应原特异性IgE阳性，样品孔OD值〈cutoff值的判断为蟹变应原特异性IgE阴性。(2)在缺乏酶标仪的基层医院，可直接观察判断结果，以样品孔与阳性对照孔进行比较，样品孔反应液的颜色深于或等于阳性对照孔的判断为阳性，样品孔反应液的颜色淡于阳性对照孔的判断为阴性。本例对临床疑似蟹类食物过敏症患者血清的检测结果(表l)显示，32份血清中有23份血清的0D值大于cutoff值(0.255)，为蟹变应原特异性IgE阳性，可确诊为蟹类食物过敏症。表132份疑似蟹过敏症患者血清中蟹变应原特异性IgE的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求蟹变应原特异性IgE的ELISA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒组成包括(1)已包被蟹变应原蛋白的酶标反应板；(2)酶标记抗体；(3)底物显色液；(4)阳性对照血清；(5)阴性对照血清；(6)样品稀释液；(7)浓缩洗涤液；(8)终止反应液其中已包被蟹变应原蛋白的酶标反应板蟹变应原蛋白是从中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)组织蛋白中经过分离纯化得到的纯化变应原蛋白；酶标记抗体辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgE抗体；底物显色液1.25mmol/L3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、12mmol/L过氧化脲、0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4；样品稀释液0.07mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0-7.4，含0.1％Tween-20、庆大霉素100u/ml、0.01％硫柳汞和0.01％山梨酸、1％牛血清白蛋白；浓缩洗涤液0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4，含1％Tween-20、0.01％硫柳汞和0.01％山梨酸；终止反应液1mol/LH2SO4。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述包被酶标反应板的纯化蟹变应原蛋白是分子量为29KDa、34KDa、35KDa、41KDa、48KDa、53KDa、60KDa、66KDa和76KDa的蛋白质中的任意1种或1种以上组合作为检测抗原。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述酶标反应板为96孔(8条X12孔或12条X8孔)或48孔(4条X12孔)。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒的制备方法包括如下步骤(1)包被酶标反应板用纯化的中华绒螯蟹变应原蛋白为抗原包被酶标反应板；(2)封闭酶标反应板用封闭液封闭已包被蟹变应原蛋白的酶标反应板；(3)配制酶标记抗体；(4)配制底物显色液；(5)配制样品稀释液；(6)配制浓縮洗涤液和终止反应液。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒的制备过程中用于封闭酶标反应板的封闭掖为含1%5%脱脂牛奶粉的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2_7.4。全文摘要本发明发明了一种定性检测人血清中蟹变应原特异性IgE的ELISA试剂盒，其组成包括已包被纯化的蟹变应原蛋白的酶标反应板、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgE抗体、样品稀释液、TMB底物显色液、浓缩洗涤液、终止反应液、阳性对照液和阴性对照液。本发明的试剂盒的制备工艺中，用于包被酶标反应板的抗原是从中华绒螯蟹组织蛋白中分离纯化的一组具有变应原活性的蛋白质，其分子量分别为29KDa、34KDa、35KDa、41KDa、48KDa、53KDa、60KDa、66KDa和76KDa，以其中的任意1种或1种以上组合作为包被抗原。按本发明制备的蟹变应原特异性IgE检测试剂盒，可应用于临床上蟹类食物过敏症的体外辅助诊断和相关科学研究。文档编号G01N33/543GK101706502SQ200910213339公开日2010年5月12日申请日期2009年11月3日优先权日2009年11月3日发明者吴兴达,吴静,邬敏辰,陈伟,黄海波申请人:江南大学