专利名称：基于限制性内切酶FokI抑制分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感方法
技术领域：
发明属于一种检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术，其具体是 指，限制性内切酶Fokl 二聚体形成条件以及抑制位点的选择，中间修饰有机小分子的寡核 苷酸DNA链与蛋白的相互作用，限制性内切酶Fokl抑制分析，和基于T叫man探针的实时荧 光定量检测方法。
背景技术：
有机小分子与结合蛋白相互作用、药物与化学毒素等有机小分子以及小分子结合 蛋白的快速筛查与检测对于临床诊断、医学研究、食品与公共安全、药物筛选、环境监测等 领域具有极其重要的意义。目前常用的有机小分子与结合蛋白相互作用的检测技术主要有 表面等离子共振、酶互补片断免疫分析以及荧光各向异性分析等。这些检测技术灵敏度不 高、可靠性差，且需要精密的仪器，不能满足准确快速检测的需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出了一种基于限制性 内切酶FokI抑制分析检测小分子与结合蛋白相互作用的生物传感方法，此方法设计简单， 仅需设计一对互补且包含有限制性内切酶Fokl识别位点的寡核苷酸DNA链和Taqman探针 即可，在其中间抑制位点进行小分子标记后即可实现检测，此方法可实现多目标同时检测， 并且操作简便、快速、灵敏。 本发明的技术方案是，所述基于限制性内切酶FokI抑制分析检测小分子与结合 蛋白相互作用的生物传感方法为利用包含有中间修饰有机小分子的寡核苷酸DNA双链与 蛋白相互作用后对限制性内切酶Fokl抑制，通过T叫man探针的荧光实时变化，定量分析检 测小分子与蛋白的相互作用以及小分子或其结合蛋白。
以下对本发明作进一步说明 所述基于限制性内切酶FokI抑制分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生 物传感方法包括 (1)包含中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA双链与蛋白的相互作用及限制性内 切酶FokI抑制分析； (2)形成限制性内切酶Fokl 二聚体，选择抑制位点； (3)采用基于T叫man探针的实时荧光定量方法进行限制性内切酶Fokl抑制分析 的定量检测。 以下对本发明做出进一步说明。 所述包含中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA双链与蛋白相互作用的检测及限 制性内切酶Fokl抑制分析采用以下步骤实现 对于小分子与其结合蛋白的相互作用，检测步骤是取所述有机小分子修饰的含有限制性内切酶FokI的寡核苷酸DNA单链与其互补链的杂交液置于微量管中；再于微量管 中加入包含小分子结合蛋白的样品溶液；然后加入限制性内切酶FokI反应，得抑制反应的 产物； 对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测的步骤是取所述有机小分子修饰的 含有限制性内切酶FokI的寡核苷酸DNA单链与其互补链的杂交液置于微量管中；再加入包 含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入小分子结合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入限 制性内切酶FokI反应，得抑制反应的产物。 限制性内切酶Fokl 二聚体抑制位点选择Fokl识别位点上游5个碱基和下游3个 碱基中的任意一个。 所述限制性内切酶抑制的定量检测可采用标准的T叫man探针荧光实时定量检 本发明中，所述寡核苷酸DNA单链的中间有机小分子的修饰通过现有的交联反应 技术实现。例如，对于带有羧基的有机小分子，可以采用1-乙基_3- (3- 二甲基氨丙基)_碳 二亚胺与琥珀酰亚胺交联反应技术与中间碱基NH2标记的包含限制性内切酶Fokl识别位 点的寡核苷酸DNA单链进行交联；对于带氨基的有机小分子，可以采用4- (N-马来酰亚胺基 甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的交联反应技术与中间标记有巯基的寡核苷酸DNA单 链进行交联。交联反应产物可用透析纯化。 进一步地，本发明中，所述中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互 作用的检测及限制性内切酶FokI抑制分析采用以下步骤实现 a.对于小分子与其结合蛋白的相互作用的检测的步骤是取5iU上述小分子修 饰寡核苷酸DNA链与其互补链的杂交液置于微量管中，加入3iU 10X限制性内切酶FokI 反应缓冲溶液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl，lmM DTT，pH 7. 9@25°C )，然后加入 8yl包含小分子结合蛋白的样品溶液，在37t:恒温反应0.5小时，再加入3ia限制性内切 酶Fokl和6 ill Taqman探针，置于37。C反应2h后，升温至65。C反应20min进行热灭活以 终止酶反应。 b.对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测的步骤是取5 ill上述小分子修饰 寡核苷酸DNA链与其互补链的杂交液置于微量管中，3iU 10X限制性内切酶FokI反应缓 冲溶液(50mM Tris-HCl， lOOmM NaCl，10mM MgCl，lmM DTT， pH 7. 9@25°C )，然后加入5ii 1 包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入一定浓度的小分子的结合蛋白或(鼠源)单 克隆抗体溶液3 1，单克隆抗体终浓度为加入的小分子修饰寡核苷酸DNA链浓度的5倍； 在37"恒温反应0. 5小时，再加入3 ii 1限制性内切酶Fokl和6 ill Taqman探针，置于37 °C 反应2h后，升温至65t:反应20min进行热灭活以终止酶反应。 注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。改 变比例或试剂加入顺序可使被酶切的Taqman探针效率在1% 100%内变化。
本发明中，所述限制性内切酶FokI抑制的定量检测可采用标准的Taqman探针，以 下是用Taqman探针对限制性内切酶抑制定量检测步骤 用lx限制性内切酶FokI反应缓冲溶液(50mM Tris-HCl， lOOmM NaCl， 10mM MgCl， ImM DTT，pH 7. 9@25°C )将反应最终产物稀释到120 iU，转移到微量石英杯中，放入荧光光 谱仪，以495nm为激发波长，518nm为发射波长，测其荧光信号强度。
本发明提出了一种基于限制性内切酶FokI抑制分析的方法，此方法设计简单，仅 需设计一对包含有限制性内切酶Fokl识别位点的互补链和T叫man探针即可，在其中间抑 制位点进行小分子标记，即可实现检测；它也可直接用于小分子结合蛋白的检测，还可通过 样品溶液中小分子与小分子标记的寡核苷酸DNA链竞争与抗体结合间接检测有机小分子， 其操作快速简便、灵敏特异，可望为临床诊断、药物研发、药毒物分析、环境监测等提供一个 通用技术平台。
具体实施例方式实施例1 :基于限制性内切酶Fokl抑制分析检测生物素 1)中间氨基标记的寡核苷酸DNA链和生物素(biotin)的交联 称取6. lmg的生物素溶于2. 5mL磷酸缓冲溶液(0. 1M NaH2P04， pH 7. 4)，再加
入lmg的1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15min，再加入
2. 8mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30min。取260 活化后的生物素溶液加入到 260 ii 1浓度为10 ii M的中间氨基标记的寡核苷酸DNA单链(GAACAACAACCAACATCCAAACTTCT ATATATGGATGAAT(NH2)CAAC)的溶液中，在轻微搅拌下室温反应2h。反应后在混合液中加入
3. 6mg盐酸羟胺终止反应。 把交联反应产物移到lmL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放
入500ml磷酸盐缓冲溶液(0. 1M NaH2P04， pH 7. 4)中在4"透析12h，每隔3h更换一次透
析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA单链分管保存于-20°C的冰箱中备
用。上述的-2(TC保存的寡核苷酸DNA单链用灭菌水稀释10倍并保存于4t:冰箱中作为次
级储备液备用。 2)生物素的检测 取5 ill上述生物素标记的寡核苷酸DNA单链次级储备液和5 y 1互补链的储备液 于微量管中，加入3iU的10X限制性内切酶FokI反应缓冲溶液(50mM Tris-HCl， lOOmM NaCl，10mM MgCl，lmM DTT， pH 7. 9@25°C )混合均匀，升温至95°C反应5min，缓慢降温至 37t:反应lh，再加入5 ii 1待检测的生物素样品溶液，混合均匀后加入3 ii 1浓度为640nM的 链霉亲和素(str印tavidin)，室温反应15min，反应后加入3 yl限制性内切酶Fokl (NEB公 司产品)和6 iil T叫man探针在37"酶切2h后，升温至65"反应20min进行热灭活以终 止酶反应。加入lx限制性内切酶FokI反应缓冲溶液(50mM Tris-HCl， 100mM NaCl，10mM MgCl，lmMDTT， pH 7. 9@25°C )将反应混合液稀释至120ul，转移到微量石英杯中，放入荧光 光谱仪，以495nm为激发波长，518nm为发射波长，测其荧光信号强度。
实施例2 :基于限制性内切酶抑制分析检测叶酸结合蛋白
1)中间氨基标记的寡核苷酸DNA单链和叶酸的交联称取10mg的叶酸溶于2. 5mL磷酸缓冲溶液(0. 1M NaH2P04， pH 7. 4)，再加入lmg的
1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)_碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15min，再加入2. 8mg N-羟 基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30mm。取260 yl活化后的叶酸溶液加入到260 y 1浓度 为10 ii M的中间氨基标记的寡核苷酸DNA单链(GAACAACAACCAACATCCAAACTTCTATATATGGAT GAAT (NH2) CAAC)的溶液中，在轻微搅拌下室温反应2h。反应后在混合液中加入3. 6mg盐酸 羟胺终止反应。
把交联反应产物移到lmL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放 入500ml磷酸盐缓冲溶液(0. 1M NaH2P04， pH 7. 4)中在4"透析12h，每隔3h更换一次透 析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA单链分管保存于-20°C的冰箱中备 用。上述的-2(TC保存的寡核苷酸DNA单链用灭菌水稀释10倍并保存于4t:冰箱中作为次 级储备液备用。以上所有的反应均在遮光的条件下进行。
2)叶酸结合蛋白的检测 取5 iU上述叶酸标记的寡核苷酸DNA单链次级储备液和5 y 1其互补链的储 备液于微量管中，加入3iU的10X限制性内切酶FokI反应缓冲溶液混合均匀，(50mM Tris-HCl， 100mM NaCl，10mM MgCl，lmM DTT，pH 7. 9@25°C )，升温至95。C反应5min，缓慢降 温至37t:反应lh，再加入5 iU待检测的叶酸结合蛋白样品溶液，室温反应15min，反应后加 入3 iil限制性内切酶Fokl (NEB公司产品)和6 iil T叫man探针在37。C酶切2h后，升温至 65t:反应20min进行热灭活以终止酶反应。在此微量管中加入lx限制性内切酶FokI反应 缓冲溶液(50mM Tris-HCl， 100mM NaCl， 10mM MgCl， lmM DTT，pH 7. 9@25°C )稀释至120ul， 混合均匀。转移到微量石英杯中，放入荧光光谱仪，以495nm为激发波长，518nm为发射波 长，测其荧光信号强度。
权利要求
一种基于限制性内切酶FokI抑制分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感方法，包括(1)包含中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA双链与蛋白的相互作用及限制性内切酶FokI抑制分析；(2)形成限制性内切酶FokI二聚体，选择抑制位点；(3)采用基于Taqman探针的实时荧光定量方法进行限制性内切酶FokI抑制分析的定量检测。
2. 根据权利要求1所述基于限制性内切酶FokI酶切抑制分析检测小分子与其结合蛋 白相互作用的荧光生物传感方法，其特征是，所述中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA双 链与蛋白的相互作用的检测及限制性内切酶FokI抑制分析为对于小分子与其结合蛋白的相互作用，检测步骤是取所述有机小分子修饰的含有限 制性内切酶FokI的寡核苷酸DNA单链与其互补链的杂交液置于微量管中；再于微量管中 加入包含小分子结合蛋白的样品溶液；然后加入限制性内切酶FokI反应，得抑制反应的产 物；对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测步骤取所述有机小分子修饰的含有限制 性内切酶FokI的寡核苷酸DNA单链与其互补链的杂交液置于微量管中；再加入包含待测小 分子的样品溶液，混合均匀后加入小分子结合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入核酸外切酶 I，得抑制反应的产物。
3. 根据权利要求1所述基于限制性内切酶Fokl酶切抑制分析检测小分子与其结合蛋 白相互作用的荧光生物传感方法，其特征是，限制性内切酶FokI 二聚体抑制位点选择FokI 识别位点上游5个碱基和下游3个碱基中的任意一个。
全文摘要
本发明为一种基于限制性内切酶抑制分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感方法，包括中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用、限制性内切酶FokI二聚体形成条件及抑制位点选择、基于Taqman探针的实时荧光定量检测技术。它利用寡核苷酸DNA链中间修饰的小分子和其结合蛋白或抗体的特异性结合，基于小分子与蛋白或抗体相互作用对限制性内切酶FokI酶切的抑制作用，通过对被酶切的Taqman探针荧光实时定量分析来检测小分子与蛋白相互作用及小分子或其结合蛋白。该方法灵敏度高、操作简便、特异性强，可用于生物医学中信号转导与分子调控机理研究、食品与农产品安全检测、环境毒物检测、药物筛选等。
文档编号G01N21/64GK101717824SQ20091022702
公开日2010年6月2日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者俞汝勤, 楚霞, 沈国励, 甄珍, 蒋健晖 申请人:湖南大学