专利名称：半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒--9044的制作方法
半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒一904技术领域：
本发明涉及医学/食品检验测定技术领域，更具体地，本发明涉及半乳糖诊断/测 定方法及其试剂盒。
背景技术：
牛奶在营养界素有“液体黄金”的美称，我国早在1992年由七部位联合提出“一 杯牛奶强壮一个民族”的口号。奶类除不含纤维素外，几乎含有人体所需要的各种营养素。 牛奶中的乳糖进入人体后，经小肠乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖是婴儿大脑 发育的必需物质，与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。牛奶虽好但并不是所有的人都能享受，有些人由于乳糖酶的缺乏，人体不能很好 的消化吸收牛奶中的营养素，还会造成钙、磷、钾、铁等元素的吸收障碍，影响婴幼儿的体格 和智力发育，在老年人中，乳糖酶缺乏是造成骨质疏松的重要原因。中国成年人饮用牛乳后 乳糖吸收不良的发病率高达86. 7%，不耐受指数为0. 9。为了避免不适当饮奶对健康造成的损害，因此最好在饮奶前检查自己是否耐受乳 糖，在饮用牛奶后，测试尿液中半乳糖的浓度，这是目前国外最常用的一种方法，更为简便、 经济、可靠。
发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种半乳糖的测定方法。本发明的另一个目的是提供一种半乳糖诊断/测定试剂盒。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明的方法是一种采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶 (偶)联法(Couple Reaction)的联用技术，利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在 340nm波长处的吸光度变化测定半乳糖的方法。本发明半乳糖测定方法的的技术原理是根据下述半乳糖激酶、去硫代生物素合成 酶、丙二酸-半醛脱氢酶的系列催化反应完成半乳糖+腺苷三磷酸 半乳糖激酶 腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸腺苷二磷酸+磷酸根+去硫代生物素 去硫代牛物素合成酶腺苷三磷酸+7，8_ 二氨基壬酸+ 二氧化碳二氧化碳+乙酰-辅酶A+还原型辅酶 丙二酸-半酵脱氢酶3-甲酰乙酸+辅酶A+辅酶本发明的方法利用半乳糖激酶(galactokinase ；EC 2. 7. 1. 6)酶(偶)联 去硫代生物素合成酶(dethiobiotin synthase ；EC 6. 3. 3. 3)、丙二酸-半醛脱氢酶 (malonate-semialdehyde dehydrogenase ；EC 1. 2. 1. 18)酶促反应终点法。半乳糖激酶酶解半乳糖反应产生腺苷二磷酸，再通过(偶)联合去硫代生物素合成酶、丙二酸-半醛脱氢 酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸 收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，这样可以通过测量340nm 处吸光度下降的程度，可以测算半乳糖的浓度大小。本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种半乳糖的测定方法。该半乳糖测定方法的步骤如下A、样品准备A. 1标准样品的制备将一定量的半乳糖溶于水或缓冲液中，再将半乳糖浓度调整到100微摩尔/升，得 到的溶液作为标准样品；A. 2待测样品预处理待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品 一样溶于水或缓冲液中；A. 3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其半乳糖浓度为0微摩尔/升；B、试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、半乳糖激酶、去硫代生物素合成酶、 丙二酸-半醛脱氢酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐(磷酸根)、去硫代生物素与乙酰-辅酶 A，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/ L、0. 001-7mol/L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、 l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 与 l-lOOmmol/L ；C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在 温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设 副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)空白样品的吸光度随时间的变化；F、数据处理由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到
半乳糖的含量
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的半乳糖浓度测定方法，其测定的技术原理是根据 下述半乳糖激酶、去硫代生物素合成酶、丙二酸-半醛脱氢酶的系列催化反应完成半乳糖+腺苷三磷酸半乳糖激酶腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸 腺苷二磷酸+磷酸根+去硫代生物素去硫代牛物素合成酶 腺苷三磷酸+7，8_ 二氨基壬酸+ 二氧化碳 二氧化碳+乙酰-辅酶A+还原型辅酶丙二酸-半酵脱氢酶 3-甲酰乙酸+辅酶A+辅酶
2.一种半乳糖的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下 2. 1样品准备2. 1. 1标准样品的制备将一定量的半乳糖溶于水或缓冲液中，再将其浓度调整到100微摩尔/升； 2. 1.2待测样品预处理待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样 溶于水或缓冲液中； 2. 1.3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其半乳糖浓度为0微摩尔/升； 2. 2试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、半乳糖激酶、去硫代生物素合成酶、丙 二酸-半醛脱氢酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐(磷酸根)、去硫代生物素与乙酰-辅酶A， 然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/ L、0. 001-7mol/L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、 l-100mmol/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 与 l-lOOmmol/L ；2. 3待测样品与在步骤2. 2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温 度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制，可以不设 副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；2. 4在与步骤2. 3)同样的条件下测定步骤2. 1. 1)标准样品的吸光度随时间的变化； 2. 5在与步骤2. 3)同样的条件下测定在步骤2. 1. 3)使用的水或缓冲液作为空白溶液 的吸光度随时间的变化；2.6数据处理由步骤2. 3-2. 5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到 半乳糖的含量ΔΑ (样品)-ΔΑ (空白)半乳糖含量= -^标准浓度(pmol/L)ΔΑ (标准)-ΔΑ(空白)式中ΔΑ(样品)表示步骤2. 3)得到的待测样品的吸光度变化； ΔΑ(空白)表示步骤2. 5)得到的空白溶液的吸光度变化； 八八(标准)表示步骤2. 4)标准样品的吸光度变化。
3.根据权利要求1、2所述的测定方法，其特征在于使用全自动生化分析仪测定时，待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条 件下进行测定测定方法为终点法，温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副 波长405nm，被测半乳糖样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为负反应，延迟时 间1/0分钟，检测时间4/5分钟。
4.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于，所述的稳定剂是一种或多种 选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠、叠氮钠等防腐剂的稳定剂；所述的 缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸 缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、巴比妥 钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液；所述的还 原型辅酶是一种或多种选自NADPH、NADH或thio_NADH的还原型辅酶。
5.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于5. 1所述的试剂溶液配制成如下单剂试剂它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐、去硫代生物素、 乙酰-辅酶A、半乳糖激酶、去硫代生物素合成酶与丙二酸-半醛脱氢酶组成的；5. 2所述的试剂溶液配制成如下双剂试剂试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐、去硫代生 物素与乙酰-辅酶A组成的；试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、半乳糖激酶、去硫代生物素合成酶与丙二酸-半 醛脱氢酶组成的；其中还原型辅酶、半乳糖激酶、去硫代生物素合成酶、丙二酸-半醛脱氢酶、腺苷三磷 酸、单价磷酸盐、去硫代生物素、乙酰-辅酶A在试剂1或试剂2中的位置是不限定的。5.3所述的试剂配制成如下三剂试剂试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、腺苷三磷酸、单价磷酸盐、去硫代生 物素与乙酰-辅酶A组成的；试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、去硫代生物素合成酶与丙二酸-半醛脱氢酶组 成的；试剂3，它是由所述的缓冲液、稳定剂与半乳糖激酶组成的；其中还原型辅酶、半乳糖激酶、去硫代生物素合成酶、丙二酸-半醛脱氢酶、腺苷三磷 酸、单价磷酸盐、去硫代生物素、乙酰-辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置是不限定 的。
6.一种半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于6. 1它由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直 接使用的液体试剂缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L还原型辅酶0.1-0. 35mmol/L半乳糖激酶1000-80000U/L去硫代生物素合成酶1000-80000U/L丙二酸-半醛脱氢酶 1000-80000U/L腺苷三磷酸 单价磷酸盐 去硫代生物素 乙酰-辅酶Al-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/Lc20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.1-0. 35mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/Lc.6. 2根据权利要求6. 1所述的半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于它有 组成如下的试剂1 缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 腺苷三磷酸 单价磷酸盐 去硫代生物素 乙酰-辅酶A 组成如下的试剂2 缓冲液 稳定剂 半乳糖激酶 去硫代生物素合成酶 丙二酸-半醛脱氢酶 6. 3根据权利要求6. 1所述的半乳糖诊断/测定试剂盒，其特征在于它有 组成如下的试剂1 缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 腺苷三磷酸 单价磷酸盐 去硫代生物素 乙酰-辅酶A 组成如下的试剂2 缓冲液 稳定剂去硫代生物素合成酶 丙二酸-半醛脱氢酶 组成如下的试剂3 缓冲液 稳定剂 半乳糖激酶20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.1-0. 35mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L ；20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L。
全文摘要
本发明涉及利用酶比色法及酶联法技术的半乳糖含量的测定方法、试剂的组成及成分，还涉及一种半乳糖诊断/测定试剂盒。本发明的测定方法灵敏度高、误差小，因此本发明的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于临床医学/食品检验。
文档编号G01N21/31GK102087288SQ20091023196
公开日2011年6月8日 申请日期2009年12月4日 优先权日2009年12月4日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司