专利名称：利用噬菌体抗体库针对人血浆蛋白组的亲和配体筛选的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用噬菌体抗体库针对人血浆蛋白组分的亲和配体的筛选和制 备方法。
背景技术：
血浆蛋白组是成分最复杂的人体蛋白组，包含了大多数的人源性蛋白质；它来源 广泛，适合大量收集；它无疑也是最具有代表性的蛋白组，由于每年有上亿份血样用于医学 诊断，其在临床上的重要性是无法替代的。自从HUPO的HPPP计划开展以来，上千种血浆蛋白在不同的策略下Q-DE-MS/MS 和2D-LC-MS/MS等)被鉴定出来。但是，大量的血浆蛋白在被鉴定后依然无法进行有效地纯化。一般说来，亲和层析是用于蛋白质纯化的最佳手段，仅仅通过一步纯化就能得到 纯度较高的目的蛋白。但是亲和层析技术的应用所遭遇的最大瓶颈就是亲和配体的开发， 难以找寻对目的蛋白亲和力高、特异性好的配体严重制约了亲和层析的广泛应用。以往制 备亲和配体的方法主要是单克隆抗体技术或者化学合成，不仅耗时久，而且成本高，然而噬 菌体展示技术的出现，为高效、快捷、经济地寻找亲和配体提供了途径。噬菌体展示技术是 将亲和配体展示在噬菌体的外壳蛋白上，然后通过一系列的筛选策略将目标受体特异性的 亲和配体从上百万甚至上亿个备选克隆中筛选出来，还可以通过优化筛选策略或者亲和力 成熟来获得具有合适亲和力的特异性配体。目前，基于噬菌体展示技术的配体筛选所针对 的目标都是单组份体系或特殊的多组分体系，如肿瘤细胞等，同时针对多组分体系的配体 筛选则鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是为了高通量地获得多组分体系中各单组分的可用于亲和纯化的 亲和配体。为了实现这一目的，我们建立这样一种方法，将筛选目标设定在蛋白组水平上， 通过一次或多次的筛选同时发现多个针对纯组分的特异亲和配体，并以最便捷的方式将配 体转化为可利用的亲和纯化基质。本发明所采用的工艺包括人血浆蛋白组的前处理和生物素标记；噬菌体抗体库的 筛选；单克隆噬菌体的制备；交联噬菌体抗体的制备；亲和配体目标抗原的鉴定。其中核心 技术为噬菌体抗体的交联技术。本发明的有益效果是实现了针对以人血浆蛋白组为代表的多组分体系的亲和配 体筛选，使得为亲和层析寻找配体的工作将会以一种高效、迅速并且高通量的方式进行。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是采用了一种“组对组”的筛选策略， 即从噬菌体抗体库中同时为整个蛋白质组中的任意组分寻找亲和配体。在使用完整的噬菌 体抗体库对整个人血浆蛋白组同时进行筛选之后，根据噬菌体抗体易于实现单克隆化的特点，先将针对人血浆蛋白组中若干组分具有特异结合性的噬菌体抗体单克隆化，然后用交 联剂将单克隆噬菌体交联，使之成为同时具有表型和基因型的亲和纯化基质，用其实现对 人血浆蛋白组中的对应目标抗原的纯化，再鉴定出被纯化出的目标抗原。
下面结合附图和实施例对本发明建立的方法做进一步说明。图1是针对人血浆蛋白组进行亲和配体筛选的方法流程示意图。图2是利用单克隆交联噬菌体抗体得到的目标抗原的电泳图。图 3 是现有目标抗原 Amyloid protein 禾口 Apolipoprotein A-I precursor 的质 谱鉴定结果。
具体实施例方式本发明所涉及的方法流程的示意图如图1所示，包括图IA 预处理的人血浆蛋白 组的生物素标记；图IB-E 噬菌体抗体库Tomlinson I+J在液相与被生物素标记的蛋白进 行多轮筛选；图IF 被筛选出的噬菌体次级抗体库实现单克隆化；图IG 利用ELISA方法鉴 定阳性噬菌体单克隆；图IH 利用戊二醛实现阳性噬菌体单克隆的交联；图II 使用交联 好的阳性单克隆噬菌体复合物作为亲和基质纯化血浆蛋白组中的目标抗原；图IJ 用质谱 鉴定纯化出的目标抗原。
具体实施方式
如下1.人血浆蛋白中高丰度蛋白HSA和IgG的分离为排除人血浆蛋白组中的高丰度蛋白对配体筛选的干扰，必须对蛋白组进行预处 理。人血浆中高丰度蛋白血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白(IgG)分别通过Cikicronblue 3GA染料亲和柱和用protein A交联的kpharose 4B亲和柱进行分离。简言之，先用IOmM Tris-HCl (ρΗ7· 6)平衡Cibacron blue 3GA亲和柱，将人血浆在4°C下离心10分钟，转速 6000Xg，去除少量血细胞后与等体积的平衡缓冲液混合，上样于Cibacron blue 3GA亲和 柱；在4°C混合过夜，然后收集穿过液。IgG的分离方法与HSA类似，将Cikicron blue 3GA 亲和柱的穿过液上柱于用IOmM Tris-HCl (pH7. 6)平衡过的proteinA亲和柱，在4°C混合过 夜，同样收集穿过液，即可得到含有低浓度HSA和IgG的血浆蛋白(HPP/HSA&IgG)。经检验 可用的HPP/HSA&IgG样品蛋白对PBS (pH7. 4)进行透析，保存待用。2.用于筛选的预处理血浆蛋白(HPP/HSA&IgG)的生物素标记在将HPP/HSA&IgG用于噬菌体抗体的液相筛选之前，必须对其进行生物素标记。 在每ImL样品蛋白中加入20 μ L浓度为IOmM的EZ- Link Sulfo-NHS-LC-Biotin,于4°C下 放置2小时，标记即可完成，可以保证每个蛋白分子上至少有20个生物素标记(图1A)。将 标记好的蛋白溶液对PBS(pH7. 4)透析，可除去溶液中游离的生物素分子。3.噬菌体抗体库对生物素标记的HPP/HSA&IgG的液相筛选取Tomlinson I 库和 J 库各 0. 25mL(1013pfu/mL)与 0. 5mL 用生物素标记的 HPP/ HSA&IgG混合，在4°C振荡2小时，然后静置2小时(图1B)。接着加入200 μ L已混勻的 Immuno Pure Immobilized Streptavidin 亲和柱填料，在 4°C混合 2 小时(图 1C)。将混合 物用5000 Xg的转速离心1分钟，吸走上清并用灭菌PBS (含0. 1% Tween-20(v/v),pH7. 4)洗涤沉淀5次。用500μ LPBS(pH7. 4)稀释的胰蛋白酶(lmg/mL)浸泡沉淀10分钟，离心吸 出上清(图1D)。将大肠杆菌TGl过夜菌按1 50接种至20mL2XTY培养基中，37°C培养约2小 时，转速220rpm。待菌液的0D600光吸收值达到0. 4-0. 6时，取1. 75mL菌液与0. 25mL的胰 蛋白酶洗脱上清混合，37°C水浴30分钟。用涂板法测定菌液中噬菌体感染的滴度，并将浓 缩菌液全部涂于TYE培养基平板(0. 8% NaCl (w/v)，蛋白胨(w/v),0. 5%酵母粉(w/v)， 1.5%琼脂(w/v)，含葡萄糖(w/v)和10(^8/11^氨苄青霉素)，371培养过夜。次日用2mL的2XTY培养基将平板上的菌落全部冲洗下来，取50 μ L接种至 25mL2XTY培养基中(含葡萄糖(w/v)和100 μ g/mL的氨苄青霉素)，其余加入甘油至 终浓度为15% (v/v)，保存于-70°C。接种菌液在37°C培养(转速220rpm)至0D600光吸 收值达到0. 4-0. 6后，加入40 μ L的KMl3辅助噬菌体(1012pfu/mL)，在37°C水浴30分钟。 菌液用3000 X g转速在4°C下离心10分钟，将沉淀转移入IOOmL的2 X TY培养基中(含1 % 葡萄糖(w/v)，100 μ g/mL的氨苄青霉素，50 μ g/mL卡那霉素)，30°C培养过夜，转速220rpm。次日将培养过夜的菌液用IOSOOXg的转速在4°C下离心10分钟，在上清中加入 其1/4体积的PEG-NaCl (20% PEG 6000 (w/v)，2. 5M NaCl)，混勻后在冰上静置2小时。接 着用IOSOOXg的转速在4°C下离心10分钟，收集沉淀，并用3mL的PBS (pH7. 4)悬浮沉淀。 所得溶液可加甘油至终浓度为15% (ν/ν)，保存于-70°C，作为次级抗体库可用于下一轮筛 选(图1 。之后的筛选可重复上述步骤3-4轮，每增加一轮筛选，用PBS洗涤sti^ptavidin 亲和柱的次数会适当增加。4.单克隆噬菌体的ELISA鉴定取每一轮筛选的洗脱液感染的保种菌液，涂板于TYE培养基平板(含葡萄糖 (w/v)和lOOug/mL氨苄青霉素)，在37°C培养过夜(图1F)。观察并挑选明显的单克隆菌落， 接种于96孔细胞培养板，每孔中有100 μ L2 X TY培养基(含葡萄糖(w/v)和IOOyg/ mL的氨苄青霉素)，37°C培养过夜，转速180rpm。取过夜菌10 μ L转移至新的细胞培养板 中，每孔中含有200 μ L2 X TY培养基(含葡萄糖(w/v)和100 μ g/mL的氨苄青霉素)。 旧板每孔加甘油至终浓度终浓度为15% (v/v)，保存于_70°C。新板在37°C培养1.5-2小 时，转速180rpm,每孔再加入1 μ L的ΚΜ13辅助噬菌体(1012pfu/mL)，在37°C静置30分钟， 然后培养1. 5小时，转速180rpm。用1800Xg的转速在4°C下离心培养板10分钟，吸出上 清，用250 μ L的2 X TY培养基中(含1 %葡萄糖(w/v), 100 μ g/mL的氨苄青霉素，50 μ g/mL 卡那霉素)，30°C培养过夜，转速180rpm。用ISOOXg的转速在4°C下离心培养板10分钟， 取上清备用。用20 μ g/mL的HPP/HSA&I gG和3 % BSA (w/v)分别包被酶标板，并用BSA封闭。 每孔加入10 μ L上述培养上清和90yL的3% BSA (w/v)，室温培养1小时，然后用PBS (含 0. Tween-20，pH7. 4)洗涤五次。每孔再加入 100 μ L 的 antiM13_HRP (1 10000 稀释)， 室温培养1小时，然后用PBS (含0. Tween-20 (ν/ν)，ρΗ7. 4)洗涤五次。最后用TMB底 物显色30分钟，并用IM磷酸终止反应。在酶标仪上读取0D450-0D650的差值(图1G)。凡 读数超过阴性对照3倍以上的单克隆被认为是阳性单克隆。5.交联噬菌体的制备
从冻存的经过ELISA鉴定的阳性单克隆的保种菌中挑取少许接种于25mL的 2XTY培养基中(含葡萄糖(w/v)和100yg/mL的氨苄青霉素)，37°C培养过夜，转速 220rpm。取2mL过夜菌液按1 50的比例接种于2 X TY培养基中(含葡萄糖(w/v)和 100 μ g/mL的氨苄青霉素)，37°C培养约2小时，转速220rpm，待菌液的0D600光吸收值达到 0. 4-0. 6时，加入80 μ L的辅助噬菌体(1012pfu/mL)，37°C静置30分钟，再培养1. 5小时，转 速220rpm。将菌液用3300Xg的转速在4°C下离心10分钟，沉淀转移至500mL 2XTY培养 基中(含1 %葡萄糖(w/v) ,100 μ g/mL的氨苄青霉素，50 μ g/mL卡那霉素)，30°C培养过夜， 转速220rpm。次日将培养过夜的菌液用IOSOOXg的转速在4°C下离心10分钟，在上清中 加入其1/4体积的PEG-NaCl (20% PEG 6000 (w/v)，2. 5M NaCl)，混勻后在冰上静置2小时。 接着用IOSOOXg的转速在4°C下离心10分钟，收集沉淀，并用20mL的PBS (pH7. 4)溶解沉 淀。每ImL的上述单克隆噬菌体溶液(3X 1013pfu/mL)中加入150 μ L的MOPS缓冲液 (0. 1Μ，ρΗ7· 4) ,150 μ L 的 NaCl 溶液(0. 5Μ)，接着加入 150 μ L 的戊二醛溶液(23. 4 μ Μ)，迅 速混勻，然后再加入150 μ L的50% PEG 6000溶液(w/v)并混勻。混合液在室温下振荡过 夜。次日在体系中加入8mL乙醇胺溶液(1Μ，ρΗ9. 0)和890 μ LNaCl溶液(5Μ)，室温下振荡 2小时。接着用IlOOOXg的转速在4°C下离心5分钟，吸走上清，用PBS(pH7. 4)洗涤沉淀 5次，用ImL的TBS (含0. 02%叠氮钠(w/v)，ρΗ7· 4)悬浮沉淀(图1Η)。6.用交联噬菌体纯化血浆蛋白用20mL单克隆噬菌体溶液(IO1YfuAiL)制备成交联噬菌体，用TBS (pH7. 4)洗涤2 次后，与IOmL的HPP/HSA&IgG进行混合，在4°C下振荡过夜(图II)。用IlOOOXg的转速在 4°C下离心5分钟，吸走上清，用TBS(含0. 2% Tween 20(v/v),pH7. 4)洗涤沉淀至少5次， 加入200yL三乙胺(IOOmM)或HCl (IOOmM)，室温下静置5-10分钟。用IlOOOXg的转速在 4°C下离心10分钟，吸出上清，在上清中加入100 μ LTris-HCKlM, ρΗ7· 4)中和，SDS-PAGE 电泳进行观察。目前已得到的两个目标抗原的电泳图如图2所示。图2Α的泳道4和图2Β的泳道 3和4出现了明显的洗脱条带，如箭头所指。7.单克隆噬菌体抗体的抗原的鉴定鉴定经已得到的目标抗原(图2箭头所指)方法主要采用胶内酶解和质谱鉴定的 方法。将选中的经过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE蛋白条带用刀片切下，用双蒸水洗涤后， 切成约Imm3的小块。加入脱色液(50%乙腈(ν/ν)，IOOmM碳酸氢铵)振荡浸泡数次，直到 染色全部褪去。用乙腈对胶块进行脱水，并真空干燥30分钟。加入IOOyL还原剂(IOmM 二硫苏糖醇，IOOmM碳酸氢铵)还原胶内蛋白质的巯基，在56°C下培养1小时。冷却至室 温后吸干溶液，加入100 μ L修饰剂(55mM碘乙酰胺，IOOmM碳酸氢铵)对胶内蛋白质的巯 基进行修饰，立即置于黑暗处室温下放置45分钟。接着用IOOmM碳酸氢铵振荡洗涤胶块 数次并真空干燥。加入7-10yL酶液(IOOmM碳酸氢铵，13ng/mL胰蛋白酶)，在4°C下放置 30分钟，待胶块完全膨胀，吸去多余酶液，补加IOOmM碳酸氢铵至终浓度25mM，pH7. 5-8. 5， 在37°C下保温12-16小时。加入50 μ L抽提液(50%乙腈(ν/ν)，5%乙酸)，超声10分钟。 吸出上清，继续加入抽提液并超声，然后吸出上清与前次合并。用Ziptip对溶液进行脱盐 处理，然后浓缩至2 μ L0对样品进行MALDI-T0F-T0F检测(ΑΒΙ-4700/4800，北京蛋白质组研究中心)，检测结果在Mascot数据库中进行检索分析(http://www. matrixscience. com/ cgi/search_form. pi ？ FORMVER = 2&SEARCH = MIS)(图 1J)。 图2A箭头所指蛋白的鉴定结果为Amyloid protein，分子量^767Da，图2B箭 头所指蛋白的鉴定结果为ApolipoproteinA-Iprecursor，分子量30758Da。质谱图谱如 3所示。图3A为Amyloidprotein的一级质谱图；图3B为Amyloid protein的前体离子 为1002. 58的二级质谱图；图3C为Apolipoprotein A-I precursor的一级质谱图；图 3D为Apolipoprotein A-I precursor的前体离子为1301. 61的二级质谱图；图3E为 ApolipoproteinA-Iprecursor 的前体离子为 1932. 84 的二级质谱图。
权利要求
1.一种利用噬菌体抗体库针对人血浆蛋白组的亲和配体筛选的方法，其特征在于以人 血浆蛋白组为目标，使用噬菌体抗体库同时针对整个蛋白组进行筛选，一次性获得多个血 浆蛋白组分的亲和配体。
2.—种权利要求1所述的利用噬菌体抗体库针对人血浆蛋白组的亲和配体筛选的方 法，其特征在于使用生物素标记人血浆蛋白组，利用生物素-链酶亲和素的相互作用实现 噬菌体抗体库在液相对整个人血浆蛋白质的亲和吸附与分离，从而达到筛选的目的。
3.—种权利要求1所述的利用噬菌体抗体库针对人血浆蛋白组的亲和配体筛选的方 法，其特征在于先实现抗原特异性的噬菌体抗体的单克隆化，后实现噬菌体抗体的目标抗 原的鉴定。
4.一种权利要求1所述的利用噬菌体抗体库针对人血浆蛋白组的亲和配体筛选的方 法，其特征在于在抗原特异性的噬菌体抗体实现单克隆化后，利用交联剂将单克隆噬菌体 抗体交联起来，使之成为表型与基因型统一的亲和纯化基质，并用于实现目标抗原的纯化与鉴定。
全文摘要
一种利用噬菌体抗体库针对人血浆蛋白组的亲和配体筛选的方法。本发明采用“组对组”的筛选策略，将噬菌体抗体库应用于整个被生物素标记的人血浆蛋白组，在液相实现二者的亲和吸附与分离，再对具有人血浆蛋白组分特异结合性的噬菌体抗体进行单克隆化与阳性鉴定，然后利用交联剂将阳性单克隆噬菌体交联成可用于亲和纯化的基质，用于人血浆蛋白组中对应目标抗原的纯化，最后用质谱技术实现目标抗原的鉴定，从而达到高效、迅速并且高通量地为任意人血浆蛋白组的组分筛选亲和配体的目的。
文档编号G01N33/577GK102095871SQ200910232208
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月9日 优先权日2009年12月9日
发明者刘建宁, 张菁, 钱晨 申请人:南京大学