专利名称：一种检测人血清中透明质酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种用放射免疫分析方法检测人血清、体液或组织勻浆中的透明质酸 (Hyaluronic Acid，简称 HA)的方法。
背景技术：
如文献CN 1047391A中所公开的，该文献公开了一种检测血清、体液或组织勻浆 中透明质酸(HA)含量的灵敏、准确、快速的方法。它将未知量标本中加入定量透明质酸结 合蛋白(HABP)，再加入碘标记透明质酸使之与标本反应所剩的HABP结合，再用第一抗体、 第二抗体将HABP沉淀下来，测其放射性后定标其浓渡。血清HA的检测有助于肝病的诊断 和鉴别诊断、病情判断和预后估价。该方法及其试剂盒也为HA与疾病关系的科研和临床应 用提供了必要的方法和物质基础。HABP所结合的125I-HA与标本中HA含量呈负相关。但是上述方法的存在如下不足一、使用试剂过多，加样步骤繁琐，反应时间长；二、 使用1251作为标记物，灵敏度低，试剂的货架期短，对环境产生放射性污染。
发明内容
本发明使用固相包被以及铕标记透明质酸结合蛋白(HABP-EU3+)的方法，不需要 第一抗体、第二抗体等试剂，加样简单，反应快速，试剂货架期长，对环境无污染。本发明预先在固相载体(例如96孔微孔板)上包被有HA，反应体系中与样本中的 HA共同与限量的HABP-Eu3+在适宜的条件下进行竞争性结合反应，形成一种HA-HABP_Eu3+ 结合物。校准品或样本中的HA含量越高，在包被板上形成的HA-HABP-EU3+结合物就越少。 加样时只需向微孔中连续加入样本及HABP-EU3+，反应1小时即可完成。测定时，先洗去包 被板中的液体，再加入增强液，使结合在包被板上的Eu3+解离下来，并与增强液中的一些 成分螯合形成新的螯合物。Eu3+的荧光强度随样本中HA浓度的增加而减少。铕与HABP结 合稳定，存放时间可大于12个月，无放射性污染。
附图1为本发明检测方法的流程图
具体实施例方式实施例一1)包被板的制作与牛血清白蛋白(BSA)偶联的HA(HA-BSA)用0. OlM磷酸盐缓 冲液(PB，pH7. 4)按一定比例稀释制成包被液，等体积加入微孔板的各孔中，4°C放置过夜。 弃去包被液，加入等体积的封闭液(0. OlM PB，5-10%蔗糖，0. 5-l%BSA,pH7. 4)，4°C放置过 夜。弃去封闭液，自然干燥后，用铝箔袋真空密封后可长期保存。2)检测操作过程a.向微孔板各孔中加入等体积HA校准品或待测样本。
b.向微孔板各孔中加入等体积HABP-EU3+。c.将微孔板放入振荡器上，室温振荡反应60分钟。d.吸出或倒出反应液，加入洗涤液洗6次，末次洗板后将板拍干。e.各孔中加入等体积增强液。f.将微孔板放入振荡器上，室温振荡反应5-10分钟。g.将微孔板放入时间分辨仪上检测各孔荧光值。 3)数据处理a.联机处理由电脑自动处理得出结果。建议使用Iog-Iogit或四参数数据处理 模式。b.手工作图或计算器处理i.百分结合率计算设0校准管计数为B0，各校准品管或样本管计数为B，则百分 结合率计算公式如下Β/Β0 = B/B0X100%ii. Iogit计算各校准品管或样本管的Iogit值计算公式如下Iogit = (B/B0)/(1-B/B0)iii.手工作图以校准品浓度取Ig值为横坐标，对应的Iogit值为纵坐标在普通 坐标纸上，或以校准品浓度为横坐标对应的B/B0为纵坐标在Iog-Iogit坐标纸上画出校准 曲线(理想化时是一条直线)。根据待测样品的B/B0可以从坐标纸上查出样品的浓度值。iv.计算器处理使用有线性拟合功能的计算器可以比较方便地计算出样品浓度 值，具体操作方法请查阅计算器的使用说明书。上述实施例中的与HA偶联的BSA可以被其它蛋白或多肽替代；微孔板可以被其它 适宜包被的材料，如塑料试管、塑料珠等替代；用于HABP标记的铕(Eu)可以被其它镧系元 素的三价金属离子钐(Sm)、镝(Dv)、锝(Te)等替代，也可以被酶或其它荧光物质、化学发光 标记物替代，并用相应的仪器进行检测。
权利要求
1.一种检测人血清中透明质酸含量的方法 步骤如下1)制作包被板与牛血清白蛋白(BSA)偶联的HA(HA-BSA)用0.OlM磷酸盐缓冲液，pH 值7. 4，按一定比例稀释制成包被液，等体积加入微孔板的各孔中，4°C放置过夜，弃去包被 液，加入等体积的封闭液:0. OlM磷酸盐缓冲液、5-10%蔗糖、0. 5-1% BSA pH值7. 4，4°C放 置过夜，弃去封闭液，自然干燥后，用铝箔袋真空密封；2)检测操作步骤a.向微孔板各孔中加入等体积HA校准品或待测样本；b.向微孔板各孔中加入等体积HABP-Eu3+；c.将微孔板放入振荡器上，室温振荡反应60分钟；d.吸出或倒出反应液，加入洗涤液洗6次，末次洗板后将板拍干；e.各孔中加入等体积增强液；f.将微孔板放入振荡器上，室温振荡反应5-10分钟；g.将微孔板放入时间分辨仪上检测各孔荧光值；
2.如权利要求1所述的一种检测人血清中透明质酸含量的方法 与HA偶联的BSA用其它蛋白或者多肽替代。
3.如权利要求1所述的一种检测人血清中透明质酸含量的方法 上述微孔板用塑料试管或塑料珠适宜包被的材料替代。
4.如权利要求1所述的一种检测人血清中透明质酸含量的方法用于HABP标记的铕(Eu)用其它镧系元素的三价金属离子钐(Sm)、镝(Dv)或锝(Te) 替代，或者被酶或其它荧光物质或化学发光标记物替代，并用相应的仪器进行检测。
全文摘要
本发明涉及一种用放射免疫分析方法检测人血清、体液或组织匀浆中的透明质酸的方法。本发明使用固相包被以及铕标记透明质酸结合蛋白(HABP-Eu3+)的方法，不需要第一抗体、第二抗体等试剂，加样简单，反应快速，试剂货架期长，对环境无污染，铕与HABP结合稳定，存放时间可大于12个月，无放射性污染。
文档编号G01N33/545GK102095847SQ20091025047
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者吕东川 申请人:北京北方生物技术研究所