构象改变的重组干扰素晶体、其三维结构及应用的制作方法

专利名称：构象改变的重组干扰素晶体、其三维结构及应用的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及构象改变的重组干扰素晶体、其结晶方法、其三维结构及所述晶体和三维结构的应用。
背景技术：
干扰素(IFN)是一种由多种细胞产生的可溶性蛋白质，其具有多种重要的生物功 能，包括抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。根据生产细胞类型、受体、生物活性等的不同，干 扰素可分为I型、II型和III型干扰素。I型干扰素主要由病毒及合成的双链RNA所诱导， 因此也称为抗病毒干扰素。现有三种类型的I型干扰素IFNci、INF^和IFNco。II型干 扰素也称为免疫干扰素或IFN γ，由T细胞产生，并且在体内是一种重要的免疫调节因子。 III型干扰素则由IFN-λ分子构成。如大量的相关专利和公开文献所显示的，近年来，世界上许多公司都在参与干扰 素的研究。举例来说，美国专利第4，695，623号和第4，897，471号公开了新型人干扰素多 肽，其氨基酸序列包含存在于天然α-干扰素多肽中的共同或占优势的氨基酸。该新型干 扰素多肽被命名为IFN-con(共有干扰素α)。所公开的氨基酸序列被命名为IFN-conl、 IFN-con2和IFN-con3。还公开了编码IFN_cons的基因以及在大肠杆菌中的基因表达。研 究表明与白细胞干扰素或其它I型干扰素相比，该重组IFN-con具有更高的体外抗病毒、抗 增殖及天然杀伤细胞活性。美国专利第5，372，808号公开了人IFN-con在疾病治疗中的用途。与之前临床 审批通过的α-干扰素如先灵葆雅公司生产的干扰能 (IFN-a2b，SGP)相比，重组人 共有干扰素显示具有更低的副作用。1997年底，美国食品与药品管理局(FDA)批准了美 国安进(Amgen)公司生产的人共有干扰素作为丙型肝炎临床治疗用药，商品名为干复津 (INFERGEN interferon alfacon-1)。美国专利第7，364，724号和中国专利公开号CN1740197均公开了同一种功效增 强、副作用更小且能够大剂量使用的重组干扰素。所述重组干扰素具有与干复津相同的氨 基酸序列，但其空间构象和生物效力发生了变化。因此，获得所述具有改变的结构和功能的 重组干扰素晶体，并确定其三维结构、建立模型并通过利用所述结构和模型来开展药物设 计以及改良已有干扰素的效力是非常有意义的。

发明内容
本发明的目的在于提供上述美国专利第7，364，724号和中国专利公开号 CN1740197公开的重组干扰素的晶体，以及具有所述重组干扰素的三维结构的蛋白质空间 结构模型。在上述重组干扰素的三维结构中，所述重组干扰素的每个单体都由6段α螺旋、1 段31(|螺旋及其间的连接肽段构成。所述6段α螺旋对应的氨基酸残基位置分别为13-20、 50-68,70-76,79-100,114-133和138-160 ；所述的1段31(1螺旋对应的氨基酸残基位置为40-43。单体结构的折叠方式属于螺旋状细胞因子型(helical cytokine)，特征在于在将 所述重组干扰素的α碳原子(Ca)骨架与IFN-α 2b蛋白的α碳原子骨架以最小二乘法方 式进行叠合后，该重组干扰素在第25-33位残基上的各α碳原子与所述IFN-a 2b蛋白在 对应位残基上的各α碳原子的位置均方根偏差(location root-mean-square deviation) 为3. 63埃。 优选的是，所述重组干扰素与所述IFN-a2b蛋白在第25位残基上的α碳原子的 位置均方根偏差为3. 291埃；在第26位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为4. 779埃； 在第27位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为5. 090埃；在第28位残基上的α碳原 子的位置均方根偏差为3. 588埃；在第29位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2. 567 埃；在第30位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2. 437埃；在第31位残基上的α 碳原子的位置均方根偏差为3. 526埃；在第32位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为 4. 820埃；在第33位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2. 756埃。还优选的是，所述重组干扰素在第44-52位残基上的各α碳原子与所述IFN- α 2b 蛋白在对应位残基上的各α碳原子的位置均方根偏差为2. 90埃。其中，所述重组干扰素 与所述IFN-α 2b蛋白在第44位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为1. 614埃，在第45 位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为1.383埃，在第46位残基上的α碳原子的位置 均方根偏差为2. 735埃，在第47位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2. 709埃，在第 48位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为5. 018埃，在第49位残基上的α碳原子的位 置均方根偏差为4. 140埃，在第50位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为3. 809埃，在 第51位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2. 970埃，在第52位残基上的α碳原子 的位置均方根偏差为0. 881埃(上述所列的“位置均方根偏差”均为坐标位置的均方根偏 差)。在一个实施方案中，本发明提供了一种包含本发明的重组干扰素的三维结构的蛋 白质空间结构模型。根据基于结构的药物设计方法，该蛋白质空间结构模型可用来开发新 型药物并对已知干扰素进行改良，使得干扰素的功效增强、副作用更低并可大剂量使用。使用基于结构的计算机药物设计方法，本发明的蛋白质空间结构模型可用来开 发新型药物并对已知药物如已知干扰素进行改良。基于结构的计算机药物设计是指用计 算机模拟来预测一种肽、多肽、蛋白质的构象，或者肽或多肽与一种治疗用化合物之间构 象的相互作用。计算机药物设计方法在Maulik等人的1997年出版的《分子生物技术》 (MolecularBiotechnology)中有所披露。其中披露了定向设计方法、随机设计方法以及基 于网格(grid-based)方法。因此，根据本发明公开的三维结构蛋白质空间结构模型，本领 域的技术人员能够对已知干扰素进行改良或者开发出抗病毒活性更强、副作用更低的新型 药物。本发明的重组干扰素在结晶之前的纯化产物是根据美国专利第7，364，724号说 明书实施例1和2和/或中国专利公开号CN1740197说明书中第11_17页记载的方法制得 的。在一个实施方案中，本发明的重组干扰素的氨基酸序列以及编码所述氨基酸的核苷酸 序列分别如下所示MCDLPQTHSLGNRRALILLA1 ATGTGCGACC TGCCGCAGAC CCACTCCCTG GGTAACCGTC GTGCTCTGAT CCTGCTGGCT
TACACGCTGG ACGGCGTCTG GGTGAGGGAC CCATTGGCAG CACGAGACTA GGACGACCGAQMRRISPFSCLKDRHDFGFP
61 CAGATGCGTC GTATCTCCCC GTTCTCCTGC CTGAAAGACC GTCACGACTT CGGTTTCCCGGTCTACGCAG CATAGAGGGG CAAGAGGACG GACTTTCTGG CAGTGCTGAA GCCAAAGGGCQEEFDGNQFQKAQAISVLHE121 CAGGAAGAAT TCGACGGTAA CCAGTTCCAG AAAGCTCAGG CTATCTCCGT TCTGCACGAAGTCCTTCTTA AGCTGCCATT GGTCAAGGTC TTTCGAGTCC GATAGAGGCA AGACGTGCTTMIQQTFNLFSTKDSSAAffDE181 ATGATCCAGC AGACCTTCAA CCTGTTCTCC ACCAAAGACT CCTCCGCTGC TTGGGACGAATACTAGGTCG TCTGGAAGTT GGACAAGAGG TGGTTTCTGA GGAGGCGACG AACCCTGCTTSLLEKFYTELYQQLNDLEAC241 TCCCTGCTGG AAAAATTCTA CACCGAACTG TACCAGCAGC TGAACGACCT GGAAGCTTGCAGGGACGACC TTTTTAAGAT GTGGCTTGAC ATGGTCGTCG ACTTGCTGGA CCTTCGAACGVIQEVGVEETPLMNVDSILA301 GTTATCCAGG AAGTTGGTGT TGAAGAAACC CCGCTGATGA ACGTTGACTC CATCCTGGCTCAATAGGTCC TTCAACCACA ACTTCTTTGG GGCGACTACT TGCAACTGAG GTAGGACCGAVKKYFQRITLYLTEKKYSPC361 GTTAAAAAAT ACTTCCAGCG TATCACCCTG TACCTGACCG AAAAAAAATA CTCCCCGTGCCAATTTTTTA TGAAGGTCGC ATAGTGGGAC ATGGACTGGC TTTTTTTTAT GAGGGGCACGAffEVVRAEIMRSFSLSTNLQ421 GCTTGGGAAG TTGTTCGTGC TGAAATCATG CGTTCCTTCT CCCTGTCCAC CAACCTGCAGCGAACCCTTC AACAAGCACG ACTTTAGTAC GCAAGGAAGA GGGACAGGTG GTGGACGTCERLRRKE (SEQ ID NO 1)481 GAACGTCTGC GTCGTAAAGA ATAA (SEQ ID NO 2)CTTGCAGACG CAGCATTTCT TATT (SEQ ID NO 3)此外，本发明的重组干扰素在肌肉注射给体重指数(BMI)为20-27范围内的人体 后，以采血时间对受试人体血清中的2-5A寡聚核苷酸酶浓度作图，所得曲线下的峰面积显 著大于在同一条件下注射干复津所获得的曲线下的峰面积。所述曲线一般表现为双峰，虽 然该双峰的形态、高度、双峰之间的峰距可能因人的不同而有所差异。有时，所述双峰之间 的峰距和两峰的高度差异并不特别显著，甚至其形态接近于梯形峰，但是，在肌肉注射给体 重指数为20-27范围内的人体后，以采血时间对受试人体血清中的2-5A寡聚核苷酸酶浓度 作图，所得曲线下的峰面积显著大于在同一条件下注射干复津所获得的曲线下的峰面积。 此外，本发明的重组干扰素在注射给人体后其在人体内的半衰期比干复津在人体内的半衰 期更长。已进行的实验的结果还证实，本发明的重组干扰素具有比目前投入临床使用的其 它任何干扰素(包括干复津)更强的效力。例如，对于乙型肝炎病毒而言，本发明的重组干 扰素不仅能抑制乙型肝炎病毒的DNA复制而且还能抑制乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗 原(HBeAg)的分泌，抑制乙肝病毒核心抗原(HBcAg)DNA复制的效力与干复津相比提高约一 倍。本发明的重组干扰素的体外药效学显示它不仅能抑制乙型肝炎病毒的DNA复制，而且能抑制表面抗原和e抗原的分泌，其细胞学毒性仅为临床现用干扰素的1/8，但抗病毒活性 却是临床现用干扰素的5-20倍，同时在人体内具有更高更广谱更长时间的生物学应答反应。此外，无论是就病毒性疾病的预防还是就肿瘤的治疗而言，所述干扰素都具有与 其它干扰素相比(包括干复津)，更高的抗病毒活性和更低的副作用。例如，本发明的重 组干扰素不但具有强于临床现用干扰素20倍的抗病毒活性，以及明显强于重组人α型干 扰素的抗肿瘤增生作用；还极大地降低了毒副作用并可安全的大剂量使用(每剂用量可> 1000万IU)，使需要大剂量用药干扰素的部分病毒性疾病或肿瘤的成功治疗成为可能。在一个方面，本发明提供了一种鉴定能与本发明的重组干扰素相结合的潜在配体 的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤将在此公开的晶体暴露于一种或多种 包含潜在配体的样品，并确定是否形成配体_干扰素分子复合物。在另一方面，本发明提供了一种获取用于设计能与干扰素 形成分子复合物的潜在 配体的结构信息的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤将在此公开的晶体暴 露于潜在配体库，并确定是否形成配体_干扰素分子复合物。在另一方面，本发明提供了一种非配体化的分子；所述分子具有在此公开的干扰 素的至少一部分。例如，所述非配体化结合的分子可包含SEQ IDNO :4或SEQ ID Ν0:5所示 序列(分别为在此公开的干扰素的AB环和BC环的序列)。在另一方面，本发明提供了一种可伸缩(scalable)的由点组成的三维构象，所述 点的至少一部分来源于在此披露的结构坐标，或来源于包含本发明的重组干扰素的AB环 或BC环的肽。在一个实施方案中，所述可伸缩的由点组成的三维构象展示为全息图、立体 图、模型或者计算机显示图片。在另一方面，本发明提供了一种获取关于未知结构分子或分子复合物的结构信息 的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤结晶所述分子或分子复合物；由所述 结晶的分子或分子复合物产生X射线衍射图；以及将所述的X射线衍射图应用于在此公开 的干扰素的至少一部分的结构坐标，从而产生所述未知结构分子或分子复合物的至少一部 分的三维电子密度图。在另一方面，本发明提供了一种干扰素同系物的模建方法。在一个实施方案中，所 述方法包括以下步骤将推定的干扰素同系物的氨基酸序列与本发明的重组干扰素的氨基 酸序列进行比对并将推定的干扰素同系物的氨基酸序列掺入由在此披露的结构坐标形成 的干扰素模型中，从而生成干扰素同系物的初级模型；对所述初级模型进行能量最小化以 生成能量最小化模型；重建所述能量最小化模型中违背立体化学约束的区域，从而生成干 扰素同系物的最终模型。在另一方面，本发明提供了一种计算机辅助的用于鉴定、设计或制备潜在干扰素 活性调节剂的方法。在一个实施方案中，所述方法包括筛选化学或者生物实体库。本领域技术人员可应用结晶学手段来筛选并鉴定可能成为干扰素配体的化学或 生物实体(见美国专利第6，297，021号)。举例来说，一种优选的方法可包括以下步骤获 得非配体化的干扰素晶体；将所述非配体化的干扰素晶体暴露于一种或多种包含潜在干扰 素配体的测试样品；和确定是否形成配体-干扰素分子复合物。可通过多种方法将所述干 扰素暴露于潜在配体，所述方法包括但不限于，将干扰素晶体浸泡于含有一种或多种潜在配体的溶液中，或者，在一种或多种潜在配体的存在下共结晶干扰素。来自所述配体_干扰素复合物的结构信息可优选地用于设计新配体，该新配体较 已知配体结合得更紧密、结合得更特异，具有期望的生物活性特性，具有更高的安全性，甚 至具有以上优点的结合。举例来说，计算出的电子密度图直接揭示了结合事件，鉴定了结合 的化学或者生物实体，并且提供了配体-干扰素复合物的详细三维结构。一旦命中(hit)， 就可通过传统的筛选方法找出该命中的一系列具有更紧密结合或期望的生物活性的类似 物或衍生物。任选地，可将配体_干扰素迭代暴露于额外的潜在配体，使得两次或更多次命 中能优选地结合在一起以鉴定或设计更具效力的配体。X-射线结晶学分析在此公开的干扰素的每一个组成氨基酸都通过一组结构坐标得到定义。术语“结 构坐标”指由数学方程式导出的笛卡儿坐标，该数学方程式与X-射线单色光通过以晶体形 式存在的本发明的干扰素的原子(散射中心)衍射获得的图样相关。衍射数据用于计算晶 体重复单元的电子密度图。然后，电子密度图用于建立干扰素蛋白或蛋白/配体复合物的 单个原子的位置。通过数学方式操作所述干扰素或者干扰素/配体结构坐标，还可产生轻微的结构 坐标改变。举例来说，在此公开的结构坐标可通过如下手段进行操作结构坐标的结晶学置 换、结构坐标的分段、结构坐标集合的整体加减、结构坐标的翻转，或上述手段的任意组合。 而由于氨基酸突变、添加、取代和/或缺失或在任何组成部分中的其他改变而导致的晶体 结构的改变，也可引起结构坐标的变化。在个体坐标中这样的轻微变化对总体形状影响不 大。如果与原始坐标相比这样的改变处于可接受的标准误差之内，则所得到的三维形状被 认为是结构等价的。应当指出本发明干扰素的个体结构坐标中的轻微变化预计不会明显改变上述实 体如可与干扰素或其部分(如上述AB或BC环)结合的配体的特性。在上下文中，短语
“与......结合”指配体或其部分与干扰素分子或其部分之间相邻近的情况。这样的结合
可以是非共价的，其中这样的相邻近在能量上受益于氢键、范德华力或静电相互作用；所述 结合也可以是共价的。因此，作为实例，与干扰素的结合口袋或结合区结合的配体也应预期 能结合结构等价的结合口袋或结合区，或与之相互作用。对于本发明而言，对于任何分子或分子复合物或其任意部分，当叠合到在此描述 的相关骨架原子上，具有小于约0. 65埃的保守残基骨架原子(如N、Ca、C、0)均方根偏差 时，被认为是“结构等价的”。换言之，这两个分子的这些部位的晶体结构在可接受的误差范 围内是基本上相同的。特别优选的结构等价的分子或者分子复合物为具有如下限定的分子 或者分子复合物在此公开的结构坐标的完整集合士小于约0. 65埃的来自于那些氨基酸 的保守骨架原子的均方根偏差。更优选地，所述均方根偏差最多约0. 5埃，还更优选最多约 0. 35埃。本发明的其他实施方案包括具有如下限定的分子复合物在此公开的AB或BC环 的结构坐标士小于约0. 65埃的均方根偏差，所述均方根偏差优选最多约0. 5埃，还更优选 最多约0. 35埃。 术语“均方根偏差”指偏差的平方的算术平均值的方根，其用于表示与趋势或对象 的偏差或变化。在一个实施方案中，所述“均方根偏差”规定了一种蛋白质骨架相对于如在 此描述的结构坐标所限定的干扰素骨架或其部分的变化。
X-射线 结构坐标定义了空间中点的独特构象。本领域技术人员应当理解蛋白、或 蛋白/配体复合物、或它们的一部分的结构坐标定义了一系列相应的点；而这些点又继而 定义了三维构象。如果坐标之间的距离和角度保持基本上相同，则相似或相同的构象可为 一组完全不同的坐标所定义。此外，只要保持角度基本上相同，可伸缩的点构象就可通过在 坐标之间增加或减少距离来定义。各种计算分析可用于确定分子或其部分与在此公开的干扰素或其部分是否是根 据三维结构定义的“结构等价的”。举例来说，可通过各种计算分析进行不同结构、相同结构 的不同构象、或相同结构的不同部分之间的比较。在一个实施方案中，所述分析可包括以下 四个步骤(1)加载需要比较的结构；(2)在这些结构中定义原子等价性；(3)执行拟合操 作；和(4)分析结果。结构同源的分子在此公开的结构坐标可用于帮助获得关于其他结晶分子或分子复合物的结构信 息。本发明的方法可以用于确定与在此公开的干扰素具有一个或多个相似结构特征的分子 或者分子复合物的三维结构的至少一部分。所述的分子在此称为“结构同源的”。相似的结 构特征可包括例如氨基酸同一性区域、保守的活性位点或结合位点基序、以及相似排列的 二级结构元件(例如，α螺旋和β折叠)。在另一个实施方案中，通过比对两条氨基酸序 列的残基以优化其序列长度上相同氨基酸的个数来确定结构同源性；在进行比对过程中， 允许再这两条序列中的一条或两条中存在空位，以优化相同氨基酸的个数，但是，这些氨基 酸必须在其各自序列中保持固有顺序。优选地，结构同源的分子是一种具有与SEQ ID NO 1至少65%同一性的氨基酸序列的蛋白质。更优选地，与本发明的干扰素结构同源的蛋白 质包含与SEQ ID NO 1的类似部分具有至少80%氨基酸序列同一性的至少50个氨基酸残 基的连续区段。用于生成结构同源分子或分子复合物的结构信息的方法在本领域中是公知 的。在此公开的结构坐标系还可用于解析相关干扰素、干扰素突变体或与各种配体共 复合的干扰素同系物的晶体结构。该应用使确定配体和干扰素(如候选的干扰素改性剂和 干扰素)之间相互作用的最佳位点得以可能。本方法还适用于鉴定分子的多个结合位点中 用于修饰的潜在位点。这一信息的获得为确定最有效的结合相互作用(如在干扰素及其配 体之间增强的疏水相互作用)提供了额外的途径。同源模建通过同源模建，可构建或优化未被结晶的干扰素同系物的计算机模型。首先，通过 序列比对、二级结构预测、结构库筛选或这些技术的任意组合，创建出于扰素同系物的初级 模型。计算软件可用于实施所述的序列比对和二级结构预测。诸如在插入或缺少周围形成 的结构碎片之类的结构不连贯可通过筛选具有期望长度和合适构象的肽结构库从而模建 获得。若所述干扰素同系物已经结晶，则可通过本领域已知技术使用最终的同源模型来解 析该同系物的晶体结构。其次，让所述初级模型能量最小化以生成能量最小化模型。该能 量最小化模型可包含违背立体化学约束的区域，在这种情况下，可使用本领域已知技术对 这些区域重新模建以获得最终的同源模型。合理药物设计计算机技术可用于筛选、鉴定、选择和/或设计能与干扰素或结构同源的分子结合的化学实体或配体。在此公开的干扰素的结构坐标的信息使得具有与在此公开的干扰素的构象互补形状的合成化合物和/或其他分子的设计和/或鉴定得以可能。具体而言，计 算机技术可用于鉴定或设计与干扰素或其部分(如AB或BC环)结合的化学实体或配体， 例如改性剂、激动剂和拮抗剂等。潜在的改性剂可结合干扰素的活性位点或其部分，或干扰 之，并可以是竞争性、非竞争性或无竞争性的抑制剂；或通过结合两个单体之间的界面，从 而干扰二聚化。一旦针对生物活性进行鉴定或筛选，这些抑制剂/激动剂/拮抗剂就可在 治疗上或预防上用于阻断或增强干扰素活性。还可通过计算机技术获得干扰素结合与干扰 之的配体类似物的结构_活性数据。当在本文中使用时，术语“化学实体”指化合物、两种或更多种化合物的复合物、及 所述化合物或复合物的片段。被确定能与本发明的干扰素相结合的化学实体就是潜在的药 物候选物。因此，如在此所鉴定的本发明的干扰素或结构同源分子或其部分的结果的三维 结构图示可有利地用于药物研发。通过本领域可获得的多种计算机方法和技术中某一种， 所述化学实体的结构坐标系可用于生成三维图像，该三维图像又可通过计算机与所述干扰 素或结构同源分子的三维图像进行拟合。本发明的药物设计方法的一个实施方案包括评估已知化学实体或配体与所述干 扰素或其结构同源分子的潜在结合。因此，所述药物设计方法还包括通过计算机来评估所 选择的化学实体或配体与本文所列的任何一种分子或分子复合物的潜在结合。在另一个实 施方案中，所述药物设计方法包括与本发明干扰素、其同系物或它们的部分结合的化学实 体或配体的计算机辅助设计。化学实体或配体可以步进方式进行设计，一次一条片段，或可 作为整体进行设计或“从头(de novo)”设计。在一个实施方案中，本发明提供了一种包含SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的重 组干扰素的晶体，其中该晶体的空间群为P3P1，在一个不对称单位中包含2个分子，以及单 晶胞参数为a = b = 77. 92 埃，c = 125. 935 埃，α = β = 90°，γ = 120°。在一个实施方案中，将所述重组干扰素的α碳原子骨架与IFN-α 2b的α碳原 子骨架以最小二乘法方式进行叠合后，该重组干扰素在对应于IFNa 2b蛋白质分子中第 25-33位残基上的各α碳原子与IFN-α 2b蛋白质分子在对应位残基上的α碳原子均方根 偏差为3. 63埃。更具体来说，与IFN α 2b对应位残基相比，所述重组干扰素在第25_33位残 基上的 α 碳原子偏差依次分别是 3. 291,4. 779,5. 090,3. 588,2. 567,2. 437,3. 526,4. 820 和2. 756埃。在另一个实施方案中，将所述重组干扰素的α碳原子骨架与IFN-α 2b的α碳 原子骨架以最小二乘法方式进行叠合后，该重组干扰素在对应于IFNa 2b蛋白质分子中第 44-52位残基上的各α碳原子与IFNa 2b蛋白质分子在对应位残基上的α碳原子均方根 偏差为2. 90埃。更具体来说，与IFN α 2b对应位残基相比，所述重组干扰素在第44_52位残 基上的 α 碳原子偏差依次分别是 1. 614,1. 383,2. 735,2. 709,5. 018,4. 140,3. 809,2. 970 和0. 881埃。在一个实施方案中，本发明的重组干扰素晶体进一步包含共价或非共价结合的金 属离子。在另一个实施方案中，本发明还提供了一种包含在此公开的重组干扰素晶体的组 合物。本发明还提供了包含在此公开的序列的肽，或其衍生物、活性部分、类似物、变体或模拟物，及其用途。在一个实施方案中，本发明提供了在此公开的干扰素多肽的模拟物。 所述模拟物可以是功能性模拟物或结构性模拟物。在另一个实施方案中，所述模拟物包含 SPFSCLKDR 序歹Ij (SEQ IDNO :4，即 AB 环的序列)，或 DGNQFQKAQ 序列(SEQ ID NO :5，即 BC 环 的序列)。本发明包含其中个体氨基酸可被在本领域中被认为密切相关的其他氨基酸所取 代的变体肽。举例来说，所述个体氨基酸可由以下方式进行取代可用任何疏水性脂肪族氨 基酸取代其他疏水性脂肪族氨基酸；可用任何疏水性芳香族氨基酸取代其他疏水性芳香族 氨基酸；可用任何带有极性侧链的中性氨基酸取代其他带有极性侧链的中性氨基酸；可用 任何酸性氨基酸取代其他酸性氨基酸；可用任何碱性氨基酸取代其他碱性氨基酸。当在本 文使用时，“模拟物”、“功能性/结构性模拟物”均指具有与在此公开的多肽相同的功能/结 构活性的肽变体或有机化合物。这样的模拟物或者类似物的实例包括被模建以比拟在此 公开的干扰素的三维结构，特别是如上所述的氨基酸残基的排列的化合物或肽。可通过本领域通常所知的模建技术生成适合的模拟物或者类似物。包括设计涉及 研究功能相互作用的“模拟物”以及设计包含以使之能产生上述相互作用的方式排列的官 能团的化合物。对已知药学活性化合物设计模拟物是一种基于“前导”化合物用于开发药物的已 知方法。这一方法可用于获得不易合成或需高价合成的活性化合物，也可用于改良不宜于 常规给药的活性化合物；所述不宜于常规给药的活性化合物包括会在消化道中被蛋白酶 快速分解，从而不宜于口服的活性化合物多肽。模拟物设计、合成和测试可用于避免针对目 标性质随机筛选大量分子。

在根据具有给定目标特性的化合物/肽设计模拟物的过程中，通常包括以下几 步首先，确定对于决定目标性质起关键和/或重要作用的化合物/肽的特定部分。就肽而 言，可通过系统性地改变肽中的氨基酸残基从而实现这样的确定，例如将每个残基依次取 代。构成化合物活性区的这些部分或残基被称为其“药效团”。—旦发现所述药效团，就可根据其物理性质对其结构进行模建；所述物理性质例 如立体化学性、键合、大小和/或电荷、该模建使用了来自多种来源例如光谱技术、χ-射线 衍射和NMR的数据。计算分析、相似性制图(其模拟了药效团的电荷和/或体积，而非原子 间键合)以及其他技术可用于该模建过程中。在该方法的变型中，模建配体及其结合伴侣 的三维结构。这一方法特别适用于配体和/或结合伴侣在结合中产生构象变化的情况，从 而容许在模拟物设计中对该模型作进一步考虑。然后，选择可将模拟药效团的化学基团移植到其上的模板分子。可便利地选择所 述模板分子及移植到其上的化学基团，从而容易地合成所述模拟物；而所合成的模拟物除 了保持前导化合物的生物活性外，还可能是药理学可接受的，并且不会在体内降解。通过这 一手段获取的模拟物经筛选后，即可得知其是否具有目标性质或者在什么程度上显示了目 标性质。然后，可进行进一步的优化和改性，以获得用于体内或临床测试的一种或多种最终 的模拟物。无论是就本发明而言用于人体给药的多肽、抗体、肽、核酸分子、小分子、模拟物还 是其他药学上有用的化合物，优选的给药剂量都是“预防有效剂量”或“治疗有效剂量”(当 然预防也可被认为是治疗的一个方面)，这样的剂量足以显示对个体的有益效果。本发明的实际给药剂量、给药频率以及给药时间随受治疗疾病的性质和严重程度而定。治疗处方，如 剂量确定等问题，由医生或其他医务工作者按情况而定。药物组合物可依据情况单独给药 或联合给药。 根据本发明并供本发明所用的药物组合物，除活性成分外，可包括药学上可接受 的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其它本领域公知的物质。这类物质应当是无毒且不会影 响活性成分效力的物质。载体或其他物质的确切性质依据给药方式而定；所述给药方式包 括口服和注射；而注射则进一步包括皮下注射、肌肉注射以及静脉注射等。上述技术和给药 方案的实例可见 Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 16 版，Osol，Α·(编)，1980。本发明还提供了一种鉴定可与干扰素相互作用的候选化合物的方法，所述方法包 括步骤(a)提供本发明的干扰素晶体；(b)确定步骤(a)中干扰素晶体的原子坐标；和(c) 选择包含能与步骤(a)中获得的结构相互作用的结构特征的候选化合物，从而鉴定能与所 述干扰素相互作用的候选化合物。蛋白的三维结构可由多种方式展示，包括表面电荷或者 疏水核排列。在一个实施方案中，候选化合物的结构特征包括抗原性位点、亲水特性、表面 可接近性和结构基序。在一个实施方案中，基于计算机进行候选化合物的选择和鉴定。举例来说，所述的 基于计算机的选择可包括以下步骤对多个候选化合物生成三维结构；将上述三维结构各 自与包含本发明干扰素晶体的原子坐标的三维结构进行拟合，以发现在能量上最有利的相 互作用，从而鉴定能与所述干扰素相互作用的候选化合物。在另一个实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤获取或合成候选化合物； 使所述候选化合物与干扰素接触以确定该候选化合物与所述干扰素相互作用的能力。该方 法还可包括测定所述干扰素与候选化合物接触时的活性。举例来说，要被测试的干扰素活 性包括抗病毒活性、抗肿瘤活性、抗增殖活性、天然杀伤细胞活性以及免疫调节活性。本发明还提供了设计干扰素模拟物的方法，包括步骤(a)对多个模拟物生成三 维结构；和(b)将步骤(a)中的各个三维结构与包含本发明干扰素晶体的原子坐标的三维 结构进行拟合，以发现所述干扰素的最佳拟合模拟物。本发明还提供了基于计算机的合理药物设计方法，包括步骤(a)提供包含本发 明干扰素晶体的原子坐标的三维结构；(b)提供多个分子片段；(c)将所述多个分子片段与 步骤(a)的结构进行拟合；和(d)将所述分子片段组装到一个分子中，从而得到候选药物。 在一个实施方案中，将所述多个分子片段与包含SEQ ID N0:4(AB环的序列)的序列进行拟 合。在另一个实施方案中，将所述多个分子片段与包含SEQ ID NO :5 (BC环的序列)的序列 进行拟合。上述方法还可包含以下步骤获得或合成候选药物；以及令所述候选药物与干 扰素接触，从而确定候选药物与所述干扰素相互作用的能力。所述方法可用于构建干扰素 同系物或与所述干扰素相互作用的配体。本发明将通过下列实施例得以详细描述，所述实施例仅作为解释说明目的，并不 意在限制本发明的范围。可对本发明进行修改而不背离的本发明的范围。所有出版物、专利和专利申请在此以其整体并入作为参考，如同每篇独立出版物、 专利或专利申请被明确且单独地指出以其整体并入作为参考一样。


图l显示了用于晶体结构分析的本发明的重组干扰素(rSIFN-(。)的单晶。
图2显示了rSIFN-(。晶体的X一射线衍射图(分辨率为2．6人)。
图3显示了rSIFN-(。分子晶体结构中局部2F(’一FC的1．0 a电子密度图。
图4显示了rSIFN-(。的所有原子的平均温度因子随残基的分布图；其中图4a为A链的图；图4b为B链的图。
图5显示了rSIFN-(。蛋白质分子结构模型中所有氨基酸残基的(中，＼V)值在拉氏构象图上的分布，此图参考了分辩率至少2．o埃、R因子低于20％的118个结构，在最佳区域内有90％o以上是高质量的模型，其统计数据如下
统计数据
在最适区域内的残基[A、B、L]I24090．6％o
在附加允许区域内的残基[a、b、l、p—J249．1％
在一般允许区域的残基[a、飞、l、p’Ji0．4％
在不允许区域内的残基00．o％
一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一[OL OO] 除甘氨酸和脯氨酸以外的残基数265100．o％
末端残基数(甘氨酸和脯氨酸除外)127
甘氨酸残基数18
脯氨酸残基数6
一一一一一一一一一一
总残基数416
图6显示了rSIFN-(。晶胞堆积图。
图7显示了rSIFN-(。二聚体结构的组装结构对。
图8显示了rSIFN-(。晶体学二聚体的组织(图8a，图帥)及。碳原子的均方根偏差(RMSD，方框代表缺失残基)(图8C)。
图9显示了rSIFN-(。单分子的结构(仅示出主肽链)；其中图9a为侧视图；图9b为俯视图；图9C为拓扑示意图；图9d为二级结构的拓扑组织方式。
图lo显示了rSIFN-(。二级结构与氨基酸序列匹配图；其中灰线方框代表在结构中未搭建的氨基酸残基，蓝线方框代表在结构中构建为Ala，或Gly n9氨基酸残基，连线为两对二硫键，下标绿色为结构中已构建的l对二硫键。
图11显示了rSIFN-(。蛋白与同源IFN多肽的序列对比图。
图12显示了rSIFN-(。
IFN-a 2b比较结果示意图。
图13显示了rSIFN-(。(红色) IFN-a 2b(黄色)二聚体叠合图。
图14显示了(a)工FN-a类蛋白与受体的结合模型；(b)工FN-a类功能区示意图(蓝圈区为重要功能区)。
具体实施方式
实施例l
重组王拢蓋工茎I型--CO的击0备
本实施例为重组干扰素rSIFN_co(以下也可称为“rSIFN_co”)(原液)的制备方 法(具体参见美国专利第7，364，7M号说明书实施例1和2以及中国专利公开号CN1740197 说明书中第11-17页记载的方法)。一、基因克隆根据已发表的编码DNA序列及推断的氨基酸序列资料(Klein ML, Bartley TD, Lai PH, et al. , Structural characterization of recombinant consensusinterferon-alpha. Journal of Chromatography, 1988 ；454 :205-215)，禾用大 肠杆菌优先表达密石马子(The Wisconsin Package, by Genetics Computer Group, Inc. Copyright 1992，Medison, Wisconsin, USA)，在保证氨基酸序列不变的情况下，对其DNA编 码序列进行分子设计，然后人工合成其rSIFN-co全长cDNA编码基因。 大肠杆菌cDNA序列的合成rSIFN-co cDNA序列的重新设计合成rSIFN-co cDNA 序列rSIFN-co cDNA 5'-端和3'-端半分子的合成用PCR 方法直接合成 rSIFN-co cDNA 5'-端 ^Obp (I 片段)和 3 ‘-端洸8bp(II 片段)两个cDNA半分子。片段I的3'-端与片段II的5'-端有41bp的核苷酸序列重
叠互补。化学合成如下寡聚脱氧核苷酸片段Oligomer A 5 ‘ ATGTGCGACCTGCCGCAGACCCACTCCCTGGGTAACCGTCGTGCTCTGATCCTGCTGGCTCAGATG CGTCGTATCTCCCCGTTCTCCTGCCTGAAAGACCGTCACGAC3'OligomerB 5 ‘ CTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAGAGGTTCGACGGTAACCAGTTCCAGAAAGCT CAGGCTATCTCCGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGACCTTC3'Oligomer C 5' GCTGCTGGTACAGTTCGGTGTAGAATTTTTCCAGCAGGGATTCGTCCCAAGCAGCGGAGGAGTCTT TGGTGGAGAACAGGTTGAAGGTCTGCTGGATCATTTC3'Oligomer D 5 ‘ ATCCCTGCTGGAAAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTTGCGTTAT CCAGGAAGTTGGTGTTGAAGAAACCCCGCTGATGAAC3'Oligomer E 5 ‘ GAAGAAACCCCGCTGATGAACGTTGACTCCATCCTGGCTGTTAAAAAATACTTCCAGCGTATCACC CTGTACCTGACCGAAAAAAAATACTCCCCGTGCGCTTGGG3'Oligomer F 5 ‘ TTATTCTTTACGACGCAGACGTTCCTGCAGGTTGGTGGACAGGGAGAAGGAACGCATGATTTCAGC ACGAACAACTTCCCAAGCGCACGGGGAGTATTTTTTTTCGGTCAGG3'O) PCR 反应PCR反应I合成rSIFN-co 5'-端半分子用寡聚脱氧核苷酸片段B作为模板， A和C两个寡聚脱氧核苷酸片段作为引物，进行PCR反应合成长度为^Obp的rSIFN-co5'-端半分子产物。PCR I反应混合物如下(单位μ 1)(总体积:50 μ 1)
权利要求
1.一种包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的重组干扰素的晶体，其中该晶体的空间 群为P3i21，在一个不对称单位中包含2个分子，以及单晶胞参数为a = b = 77. 92埃，c = 125. 935 埃，α = β = 90° , γ = 120°。
2.权利要求1的干扰素晶体，其中将所述重组干扰素的α碳原子骨架与IFN-α2b的 α碳原子骨架以最小二乘法方式进行叠合后，该重组干扰素在对应于IFNa 2b蛋白质分子 中第25-33位残基上的各α碳原子与IFNa 2b蛋白质分子在对应位残基上的α碳原子均 方根偏差为3. 63埃。
3.权利要求2的干扰素晶体，其中与IFNa2b对应位残基相比，所述重组干扰素在第 25-33 位残基上的 α 碳原子偏差分别是 3. 291,4. 779,5. 090,3. 588,2. 567,2. 437,3. 526、 4. 820 和 2. 756 埃。
4.权利要求1的干扰素晶体，其中将所述重组干扰素的α碳原子骨架与IFN-α2b的 α碳原子骨架以最小二乘法方式进行叠合后，该重组干扰素在对应于IFNa 2b蛋白质分子 中第44-52位残基上的各α碳原子与IFNa 2b蛋白质分子在对应位残基上的α碳原子均 方根偏差为2. 90埃。
5.权利要求4的干扰素晶体，其中与IFNa2b对应位残基相比，所述重组干扰素在第 44-52 位残基上的 α 碳原子偏差分别是 1. 614、1. 383,2. 735,2. 709,5. 018,4. 140,3. 809、 2. 970 和 0. 881 埃。
6.权利要求1的干扰素晶体，进一步包含共价或非共价结合的金属离子。
7.一种包含权利要求1的干扰素晶体的组合物。
8.权利要求1的干扰素晶体的模拟物。
9.权利要求8的模拟物，其中所述模拟物是功能性模拟物或者结构性模拟物。
10.一种鉴定能与干扰素相互作用的候选化合物的方法，所述方法包括步骤(a)提供权利要求1所述的干扰素晶体；(b)确定步骤(a)中干扰素晶体的原子坐标；和(c)选择包含能与步骤(a)中获得的结构相互作用的结构特征的候选化合物，从而鉴 定能与所述干扰素相互作用的候选化合物。
11.权利要求10的方法，其中所述结构特征选自抗原性位点、亲水特性、表面可接近性 和结构基序。
12.权利要求10的方法，其中基于计算机进行候选化合物的选择和鉴定。
13.权利要求12的方法，其中所述基于计算机进行候选化合物的选择和鉴定包括步骤(i)对多个候选化合物生成三维结构；和( )将步骤(i)的三维结构各自与包含权利要求1的干扰素晶体的原子坐标的三维结 构进行拟合，以发现在能量上最有利的相互作用，从而鉴定能与所述干扰素相互作用的候 选化合物。
14.权利要求10的方法，进一步包括步骤(i)获取或合成候选化合物；和( )使所述候选化合物与干扰素接触以确定该候选化合物与所述干扰素相互作用的 能力。
15.权利要求14的方法，进一步包括测定所述干扰素与候选化合物接触时的活性。
16.权利要求15的方法，其中所述干扰素活性选自抗病毒活性、抗肿瘤活性、抗增殖活 性、天然杀伤细胞活性和免疫调节活性。
17.一种设计干扰素模拟物的方法，包括步骤(a)对多个模拟物生成三维结构；和(b)将步骤(a)的各个三维结构与包含权利要求1的干扰素晶体的原子坐标的三维结 构进行拟合，以发现所述干扰素的最佳拟合模拟物。
18.一种基于计算机的合理药物设计方法，包括步骤(a)提供包含权利要求1的干扰素晶体的原子坐标的三维结构；(b)提供多个分子片段；(c)将所述多个分子片段与步骤(a)的结构进行拟合；和(d)将所述分子片段组装到一个分子中，从而得到候选药物。
19.权利要求18的方法，进一步包括步骤 (i)获得或合成候选药物；和( )令所述候选药物与干扰素接触，从而确定候选药物与所述干扰素相互作用的能力。
20.权利要求18的方法，其中将所述多个分子片段与包含SEQID NO :4或5的序列进 行拟合。
全文摘要
本发明提供了一种重组干扰素晶体，其具有(i)与人共有干扰素相同的氨基酸序列，以及(ii)与IFN-α2b相比改变了的三维结构。本发明的干扰素具有增强的生物活性。本发明还提供了一种可用于药物筛选和/或药物设计的结构模型。
文档编号G01N33/68GK102101886SQ200910259339
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月18日 优先权日2009年12月18日
发明者王大成, 魏光文 申请人:四川辉阳生命工程股份有限公司