专利名称：一种免疫层析快速试剂盒及其生产制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一种免疫层析试纸条、其制备方法及含有所述试纸条的试剂盒。具 体而言，本发明涉及一种基于上转发光技术的免疫层析试纸条，采用冻干法生产所述免疫 层析试纸条的生产方法，以及包含所述免疫层析试纸条的检测试剂盒。本发明还涉及了应 用上述生产方法生产的用于检测甲胎蛋白、C反应蛋白的免疫层析试纸条及其试剂盒。
背景技术：
中国专利申请200410034104. 0中记载了一种被称为上转发光材料(UCP)的物质 以及应用该材料作为标记物的免疫层析试纸条。虽然上转发光材料具有高灵敏性、高稳定性、高简易性、高灵活性和高安全性等诸 多优点，使其在作为生物标记物方面具有广泛的应用前景。但是至今仍然没有一种商品化 的上转发光法定量检测试纸可以供临床使用，原因是在于现有的基于上转发光法的免疫层 析试纸条无法满足对定量检测试纸的生产质量要求。如中国专利申请200410034104. 0所 述，以往UPT (上转发光技术，Up-Converting Phosphor Technology)快速试纸的制备方法 中结合垫或结合物释放垫是采用烘干方法。由于UCP颗粒容易团聚，导致烘干结合垫后裁 剪的变异过大，批内精密度低，变异系数(CV)大于15%。变异系数CV常被用于表示精密 度，包括批内和批间变异系数两种(分别对应于批内精确度和批间精确度)，CV越小精密度 越高。批间精密度的CV值一般大于批内，低含量标本的CV值一般大于高含量标本。最常 见的精密度评价是对稳定的样品作多次测定，求这些重复测定值的均值和标准差s，以及变 异系数CV。重复次数一般要求10-20次。若在一批内的重复测定，这是批内精密度；卫生 部发的《临床化学体外诊断试剂盒质量检验总则》WS/T124-1999中有这方面的检测和计算 方法的规定。一般临床免疫试剂的批内和批间CV均应该< 15%。医院实验室对病人标本检测时，由于该行业的沿袭特点，一直是对每份标本只作 一次检测发出报告。因此国际上将精密度性能列为实验方法、仪器或试剂盒分析性能的第 一位。检测结果必须具重现性，也即具有良好的精密度。因此急需开发出具有较高精密度 的基于上转发光法技术的免疫层析试纸条。甲胎蛋白(α -Fetoprotein, AFP)是 1956 年 Bergstrandh 和 Czar 在人胎儿血清 中发现的一种专一性的甲种球蛋白，是胚胎早期的主要蛋白质，来源于胎儿肝脏和卵黄囊。 胎儿的AFP浓度非常高，可达l-10mg/ml，但在出生后迅速下降，生后2个月只有痕量AFP可 检测到，并几乎完全被血清白蛋白所替代。甲胎蛋白是原发性肝细胞癌(PHC)较为特异的 肿瘤标志物，70%以上的患原发性肝细胞癌病人早期血清中AFP含量升高。同时在其它一 些恶性肿瘤中也能发现AFP水平升高，如睾丸癌。对血清中AFP含量的检测可以用作肝癌 高发区普查以及肝癌的早期临床诊断，同时也可以评定肝癌的治疗效果和判断预后。C-反应蛋白(CRP)是参与炎症的主要时机反应蛋白，在各种急性炎症、组织损伤、 心肌梗塞、手术创伤、放射性损伤等疾病发作后数小时迅速升高，并有成倍增长之势。病变 好转时，又迅速降至正常，其升高幅度与感染的程度呈正相关。C-反应蛋白还可用于细菌和病毒感染的鉴别诊断。一旦发生炎症，C-反应蛋白水平即升高，而病毒性感染C-反应蛋白 大都正常。近年来发现C-反应蛋白浓度甚至在正常范围内的轻度升高都与心血管疾病发生 的危险性增加有关，可以推测以后心肌梗死事件发生的可能性。超敏C-反应蛋白是心脑血 管疾病中的一项独立风险预测指标，可以敏感地预测糖尿病合并心、脑血管事件的危险发生率。AFP和CRP都是常见的POCT检测指标。应用上转发光免疫分析技术开发AFP及 CRP快速检测免疫层析试纸条应用于床旁快速检测(POCT)领域有临床应用价值，但是批内 精密度(CV)应不高于15%才能满足临床使用需要。因此需要具有可以应用于POCT检测的 高精密度，基于上转发光技术的成品AFP及CRP快速检测免疫层析试剂条及试剂盒。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足，本发明提供一种基于上转发光技术的采用 经冻干法制备的结合垫或结合物释放垫的免疫层析试纸条，具有精密度高即变异系数 CV^ 15%的特点。本发明的试纸条是检测原理是通过一系列表面修饰与活化，上转换发光材料 UCP (Up-Converting Phosphor, UCP)颗粒可与生物活性分子相结合，利用UPT生物传感器， 对在层析过程中通过特异免疫反应结合于特定区域(检测带与质控带)的UCP颗粒进行扫 描分析，从而利用由UPT快速定量检验系统实现精确定量或定性。具体地，本发明提供了一种基于上转换发光技术的免疫层析试纸条，其特征在于 含有上转换发光材料(UCP)-生物分子颗粒的结合垫或结合物稀释垫是经冻干的。在一个优选的实施方案中，所述免疫层析试纸条的分析膜为硝酸纤维素膜。在另一个优选的实施方案中，所述试纸条包括一外壳，所述外壳上包括加样孔、结 果判读窗口和终点指示窗口，如图2B所示。在另一个优选的实施方案中，通过所述加样孔，将生物样品添加到样品垫上；结果 判读窗口对应于分析膜上的检测带和质控带；终点指示窗口对应于吸水垫上的终点指示 带，如图2B所示。在另一个优选的实施方案中，所述生物分子选自AFP抗体、CRP抗体、肌钙蛋白I CTN-I抗体、脑钠肽BNP抗体、N端前体脑钠肽N-pro-BNP抗体、盐酸克伦特罗(瘦肉精)抗 体、盐酸莱克多巴胺抗体、丙型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A抗体、乙肝表面抗原 抗体和髓过氧化物酶MPO抗体。优选地，所述上述抗体均为单抗。本发明还提供了一种制备上述免疫层析试纸条的方法，其中在制备结合垫或结合 物稀释垫的过程中，所述结合垫或结合物稀释垫是经冻干的。在一个优选的实施方案中，所述所述制备结合垫或结合物稀释垫的过程包括a)将UCP-生物分子悬浊液离心并弃上清；b)向a)步骤得到的UCP-生物分子沉淀物中加入UCP保存液，吹打混勻；c)向b)步骤得到的UCP-生物分子悬浊液中加入冻干液；d)将C)步骤得到的UCP-生物分子悬浊液中加于玻璃纤维上；e)将玻璃纤维放于_80°C下，预冻时间0. 5小时，真空冻干2小时。
在一个优选的实施方案中，所述UCP保存液为pH7. 2的0. 15M的磷酸缓冲液，含 有2wt% BSA和0. 05wt% NaN3，所述冻干液为ρΗ7· 2的0. 15Μ的磷酸缓冲液，含有4. 2wt% BSA,5. 6wt%多糖和 1.氨酸。本发明还提供了一种基于上转换发光技术的免疫层析快速试剂盒，包括本发明的 上述免疫层析试纸条。在一个优选的实施方案中，上述试剂盒中试纸条的生物分子选自AFP抗体、CRP抗 体、肌钙蛋白I CTN-I抗体、脑钠肽BNP抗体、N端前体脑钠肽N-pro-BNP抗体、盐酸克伦特 罗(瘦肉精)抗体、盐酸莱克多巴胺抗体、丙型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A抗 体、乙肝表面抗原抗体和髓过氧化物酶MPO抗体。优选地，所述上述抗体均为单抗。在一个实施方案中，本发明提供了一种含有上述AFP-UPT快速检测免疫层析试剂 条的试剂盒。在另一个实施方案中，本发明提供了一种含有上述CRP-UPT快速检测免疫层析试 剂条的试剂盒。本发明克服了以往烘干法生产上转发光免疫层析试纸条碰到的精密度低，变异系 数cv%过大的问题，克服了上转发光法免疫层析试纸条产业化当中的极其重要的问题。使 得上转发光法免疫层析试纸条可以应用于临床。
图1为两个光子激发UCP产生上转发光的过程。图2为附图为本发明冻干法上转发光免疫定量检测免疫层析试纸条免疫层析试 纸条的剖面结构示意图。其中图2A中1为样品垫、2为结合垫、3为分析膜、4为吸水垫、5 为粘性低衬、6为UCP结合物、7为检测带T线、8为质控带C线。图2B中9为加样孔、10为 结果判读窗口、11为终点指示窗口。图3为对比烘干法和冻干法方法差别。图4为烘干法和冻干法制备的免疫层析试纸条的测量变异对比。图5为本发明AFP-UPT试剂盒的对AFP定量标准品线性检测结果。图6为本发明AFP-UPT上转发光检测试剂盒和AFP电化学发光免疫试剂盒测定 AFP临床样本比较。图7本发明CRP-UPT试剂盒对CRP定量标准品的线性检测结果。图8为为本发明CRP-UPT上转发光检测试剂盒和免疫比浊法贝克曼CRP试剂盒测 定CRP临床样本比较。
具体实施例方式下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本 发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的具体改进都属于本发明要 求保护的范围。实施例1 基于上转发光法技术的免疫层析试纸条制备过程中采用烘干法和采用 冻干法时的差别及其对CV的影响A)对比烘干法和冻干法方法差别(如图3所示)
冻干结合垫的制备UCP颗粒采购自上海科润光电技术有限公司，玻璃纤维、纤维 素膜采购自Millipore公司、塑料卡和吸水垫购买自上海金标生物科技有限公司，塑料卡 购买自深圳市金灿华实业有限公司。a)将50ml UCP标记物(UCP-生物分子)悬浊液，以12000rpm在4°C下离心30min，
弃去上清液；b)在UCP沉淀物中加入5ml的保存液(pH = 7. 2的0. 15M磷酸缓冲液，含2wt% BSA 和 0. 05wt% NaN3)，吹打混勻；c)加入 45ml 的冻干液(pH = 7. 2 的 0. 15M 磷酸缓冲液，含 4. 2wt% BSA,5. 6wt% 海藻糖和1.5wt%甘氨酸)；d)将UCP标记物悬浊液按12. 5ml/cm2加于玻璃纤维上；e)将玻璃纤维在-80°C下，预冻0. 5h ；真空冻干2h ；f)裁剪玻璃纤维，装塑料卡烘干法制备结合垫的步骤a) d)与冻干结合垫的制备相同，e):将玻璃纤维在37°C的鼓风干燥箱中2小时。f)裁剪玻璃纤维，装塑料卡B)两种生产方法的成品(C反应蛋白CRP上转发光法免疫层析试纸条)进行CV检 测对比取高、低浓度血清各一份，用两种方法制备的试纸条测量，同一份血清用每种试纸 条各测10次，计算10次测量结果的变异系数(CV)。结果如图4及表1和表2所示表1高浓度血清测量结果(单位ng/ml)
权利要求
1.一种基于上转换发光技术的免疫层析试纸条，其特征在于含有上转换发光材料 (UCP)-生物分子颗粒的结合垫或结合物稀释垫是经冻干的。
2.权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于分析膜为硝酸纤维素膜。
3.权利要求1所述的免疫层析试纸条，其中所述试纸条包括一外壳，所述外壳上包括 加样孔、结果判读窗口和终点指示窗口。
4.权利要求3所述的免疫层析试纸条，其中通过所述加样孔，将生物样品添加到样品 垫上；结果判读窗口对应于分析膜上的检测带和质控带；终点指示窗口对应于吸水垫上的 终点指示带。
5.权利要求1-4任一项所述的免疫层析试纸条，其中所述生物分子选自AFP抗体、CRP 抗体、肌钙蛋白I CTN-I抗体、脑钠肽BNP抗体、N端前体脑钠肽N-pro-BNP抗体、盐酸克伦 特罗(瘦肉精)抗体、盐酸莱克多巴胺抗体、丙型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A 抗体、乙肝表面抗原抗体和髓过氧化物酶MPO抗体。
6.一种制备权利要求1-4任一项所述的免疫层析试纸条的方法，其中在制备结合垫或 结合物稀释垫的过程中，所述结合垫或结合物稀释垫是经冻干的。
7.权利要求6所述的方法，其中所述制备结合垫或结合物稀释垫的过程包括a)将UCP-生物分子悬浊液离心并弃上清；b)向a)步骤得到的UCP-生物分子沉淀物中加入UCP保存液，吹打混勻；c)向b)步骤得到的UCP-生物分子悬浊液中加入冻干液；d)将c)步骤得到的UCP-生物分子悬浊液中加于玻璃纤维上；e)将玻璃纤维放于_80°C下，预冻时间0.5小时，真空冻干2小时。
8.权利要求6或7所述的方法，其中所述UCP保存液为pH7.2的0. 15M的磷酸缓冲液， 含有2wt% BSA和0. 05wt%NaN3,所述冻干液为pH7. 2的0. 15M的磷酸缓冲液，含有4. 2wt% BSA,5. 6wt%多糖和 1. 氨酸。
9.一种基于上转换发光技术的免疫层析快速试剂盒，其特征在于包括权利要求1-4任 一项所述的免疫层析试纸条。
10.权利要求9所述的试剂盒，其中所述免疫层析试纸条中的生物分子选自AFP抗体、 CRP抗体、肌钙蛋白I CTN-I抗体、脑钠肽BNP抗体、N端前体脑钠肽N-pro-BNP抗体、盐酸克 伦特罗(瘦肉精)抗体、盐酸莱克多巴胺抗体、丙型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A 抗体、乙肝表面抗原抗体和髓过氧化物酶MPO抗体。
全文摘要
本发明涉及了一种免疫层析试纸条的生产方法及应用这种生产方法而制备的甲胎蛋白快速定量免疫层析试纸条和C反应蛋白快速定量免疫层析试纸条。该层析试纸条采用上转发光材料即UCP作为生物标记物。其结构主要包括样品垫、结合垫或结合物稀释垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料卡组成。本发明涉及了产业化生产这种上转发光法免疫层析试纸条的方法、使用方法。应用该上转发光检测免疫层析试纸条可快速、简便、定量的测定被检测物的含量，准确的对疾病进行，为疾病的预防、诊断、治疗提供支持。
文档编号G01N33/52GK102116770SQ20091026278
公开日2011年7月6日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者周蕾, 李华柏, 杨瑞馥, 林长青 申请人:北京热景生物技术有限公司, 周蕾, 杨瑞馥