专利名称：快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条的制作方法
技术领域：
本实用ffiMJl于M兽医学快速检测技术^Wr涉及检 ^ 毒(含A/H1N1， H3N2)的胶体金测试试剂盒，更具体的说是一种快速检测猪流感病毒(A型H1N1， H3N2 流感)的胶体金测试试纸条。
背景技术：
猪流感是由猪流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，但极少传染给人。目前对猪 流感病毒的诊断方法，主要有病毒分离、血清学诊断以及分子生物学方法。但病毒分离 时间长，要求条件高，分离率低，而采集患者急性期与恢复期双份血清进行抗体测定不 能及时进行诊断，因此，使这两种方法在实际使用中受到很大的限制。 发明内容
本实用新型的目的是提供一种快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条。其采用两 条带显色的胶体金层析法制备，显带颜色红色线条，能准确快速检测出样品中猪流感病 毒的有无。为实现上述目的，本实用新型提供如下的技术方案
一种快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条，其特征在于该试纸条是在底衬(1) 上顺次相互搭接地粘帖样品垫(2)、玻璃纤维膜或聚酯膜(3)、包被膜(4)以及吸水纸 (5)组成；其中的包被膜(4)上印制有控制线(7)和检测线(6);控制线(7)包被 抗鼠IgG抗体，检测线(6)包被抗猪流感病毒的抗体；通过控制线(7)和检测线(6) 的显色来定性判断。
本实用新型所述的快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条，其中底衬(1)为不吸 水的塑料硬纸板。所述包被膜为硝酰纤维素膜。所述的样品垫为胶体金颗粒标记抗猪流 感病毒的单克隆抗体的硝酰纤维素膜。粘贴材料为双面胶。
本实用新型所述的包被抗猪流感病毒的抗体为高纯度的单克隆抗体和/或多克隆抗 体。优选为高纯度的单克隆抗体。
本实用新型所述的控制线(7)和检测线(6)为上下排列，其间隔为3-5mm。优选5mmc
本实用新型所述金标抗体包被的玻璃纤维膜宽度的确定:将胶体金玻璃纤维膜裁成4
毫米、5毫米、6毫米规格，与包被膜组成测试条，每条宽4毫米。选择能检出室内质控 样本，无非特异性反应的金标玻璃纤维膜宽度定为使用宽度。
本实用新型所述的快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条，根据需要还可以将包 被膜、吸水纸、玻璃纤维膜或聚酯膜(3)粘贴在塑料底板上，组成大板。或将l份已切 好的试纸条与干燥剂封装在铝箔塑料袋内，组成试剂盒。
本实用新型所述的快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条，是采用免疫亲和技术、 印记技术、免疫标记技术和层析技术的组合制成。特点是将包被抗体，胶体金标记抗体 固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析诊断试条/板，使用时只需要把 试纸条下插入样本溶液，数分钟就可以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作 更简便、快速，且由于为干试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。
本实用新型所述的快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条的制备方法，包括以下
步骤
A. 包被膜的制备-
(l)检测线的制备采用喷膜机，将包被缓冲液稀释抗猪流感病毒的单克隆抗体，
喷涂在硝酰膜上，机器划线，室温晾干20分钟。
(2) 控制线的制备采用喷膜机，将包被缓冲液稀释抗鼠IgG多克隆抗体，喷涂
在硝酰膜上，机器划线，两线间隔5mm，应细致均匀，室温晾干20分钟。封袋备用。
(3) 金标抗体的制备用O. lM碳酸钾调胶体金pH值至7.6,按10微克抗体/毫升 胶体金加入抗猪流感病毒的单克隆抗体，混匀，静置30分钟，12000rpm离心三十分钟， 弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉淀用十分之一初始胶体 金体积的金标抗体保存液溶解，置4'C备用。
B. 样品垫制备将制备好的金标抗体涂覆在硝酰纤维素膜上。所述涂覆金标抗体的 硝酰纤维素膜可以用普通方法将金标抗体涂覆在硝酰纤维素膜上，也可以通过下述方法 得到将标记好的胶体金均匀地铺在硝酰纤维素膜上，每毫升溶液铺10平方厘米，冷冻 干燥，封袋，置4'C备用。
4C.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫(硝酰纤维素膜)、玻璃纤维膜、包被膜以 及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
本实用新型所述的一种快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条，采用高纯度的抗 猪流感病毒的单克隆抗体作为包被抗原进行特异的猪流感病毒检査。其原理是试纸条中 含均匀分布的胶体金标记猪流感病毒的单克隆抗体，抗猪流感病毒的抗体及抗鼠IgG抗 体分别固定于硝酰膜上并呈两条线上下排列，抗鼠IgG抗体在上方为阴性对照，抗猪流
感病毒的抗体在下方为检测线。当被检样中含有猪流感病毒的抗原时，猪流感病毒先和
金标记的猪流感病毒的抗体进行特异性吸附，形成Ag-Abe复合物。由于微孔滤膜的毛细 管作用和层析作用，反应复合物沿硝酰膜向前移动，待行至抗a猪流感病毒的抗体线时， 形成Ab a -Ag-Ab P -Au复合物而富集在包被线上，最终形成一条红色沉淀线，是为猪流 感病毒的阳性反应。而试纸条上无关的金标记鼠IgG随尿液继续上行至抗鼠IgG抗体处， 与之形成红色标记的抗原抗体复合物是为阴性对照。
用于检测时，观察检测线6和控制线7的显色和形状来判断阳性还是阴性。如图3 (al)所示，当检测线6和控制线7均显色时，结果为阳性；如图3 (a2)所示，当控制 线7显色而检测线6不显色时，结果为阴性。
本实用新型所述包被缓冲液和封闭液的配方及制备方法是本领域通用的技术。
本实用新型采用双抗体夹心法，可用来检测血液样品或者棉拭子等处理样品。与现 有检测试剂盒比较，由于对检测线(T线)和控制线(C线)进行了特殊的处理，使其能 够产生特异条带，从而满足现地农户、基层检测的需求。
本实用新型利用现代国际最先进的胶体金免疫层析技术，提供一种用于现地农户、 基层自测等检测猪流感病毒的快速诊断测试试纸条。该测试试纸条具有高度特异性、灵 敏度、检测速度等优点，且不需使用仪器设备，成本低廉，操作简便，能广泛应用于现 地农户、基层及个人对于猪流感病毒的检测。该试纸条可以直接使用，也可以装配在塑 料装置中以检测板形式使用。该检测试纸条或检测板形式使用。
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图l为本实用新型所述试纸条的平面结构示意图。其中(1)为底衬、(2)为样品垫、(3)为玻璃纤维膜或聚酯膜、(4)为包被膜、以(5)为吸水纸、(6)为检测线； (7)为控制线。
图2为本实用新型所述试纸条的侧面结构示意图。其中(1)为底衬、(2)为样品 垫、(3)为玻璃纤维膜或聚酯膜、(4)为包被膜、以(5)为吸水纸、(6)为检测线； (7)为控制线。
图3为试纸条检测结果示意图，其中图3 (al)表示试纸条检测为阳性，(a2)所示, 当控制线7显色而检测线6不显色时，结果为阴性。图3 (a3)无效。
具体实施方式
为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细 节影响对本技术方案的描述。
以下结合附图1-3,对本发明做进一步的说明。 实施例1
(1) 包被膜的制备1)检测线的制备采用喷膜机，将包被缓冲液稀释抗猪流感 病毒的单克隆抗体，喷涂在硝酰膜上，喷液量为25微升/35厘米，机器划线，室温晾干 20分钟。2)控制线的制备采用喷膜机，将包被缓冲液稀释抗鼠IgG多克隆抗体，喷 涂在硝酰膜上，喷液量为25微升/35厘米，机器划线，两线间隔5mm，应细致均匀，室 温晾干20分钟。封袋备用。
(2) 金标抗体的制备用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.5，按15微克抗体/毫升 胶体金加入抗猪流感病毒的单克隆抗体，混匀，静置30分钟，12000rpm离心30分钟， 弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次其去上清，将沉淀用十分之一初始胶体 金体积的金标抗体保存液溶解，置4"C备用，效期7天；
(3) 涂覆金标抗体的硝酰纤维素膜的制备将制备好的金标抗体涂覆在硝酰纤维素 膜上。也可以将标记好的胶体金均匀地铺在硝酰纤维素膜上，每毫升溶液铺10平方厘米， 冷冻干燥，封袋，置4'C备用。
然后按图1所示，在底衬U)上顺次相互搭接地粘帖样品垫(2)、玻璃纤维膜(3)、 包被膜(4)以及吸水纸(5)得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。其中包被膜 (4)上有检测线(6)和控制线(7),检测线(6)包被猪流感病毒的抗单克隆抗体，控制线(7)包被抗鼠IgG抗体。控制线(7)和检测线(6)为上下排列，其间隔为5mm。 通过检测线(6)和控制线(7)的显色和形状来判断阳性还是阴性。 实施例2
包被膜、涂覆金标抗体的硝酰纤维素膜的制备过程同实施例1。
按图l所示，在底衬(1)上顺次相互搭接地粘帖样品垫(2)、玻璃纤维膜(3)、
包被膜(4)以及吸水纸(5)得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。其中包被膜 (4)上有检测线(6)和控制线(7)，检测线(6)包被猪流感病毒的抗多克隆抗体，
控制线(7)包被抗鼠IgG抗体。控制线(7)和检测线(6)为上下排列，其间隔为3mm。
通过检测线(6)和控制线(7)的显色和形状来判断阳性还是阴性。
实施例3
(1) 大板的粘贴按要求把包被膜、吸水纸、冻干金标抗体、玻璃纤维膜粘贴在塑 料底板上，组成大板。组装车间温度控制在25。C，湿度20%-30%。
(2) 切条用切条机将大板切成单个人份，每人份宽度3毫米，随机抽检，灵敏度 能检出室内质控，条带显色程度达到一个"+ "号，无非特异性条带。
用于检测时，观察检测线6和控制线7的显色和形状来判断阳性还是阴性。如图3 (al)所示，当检测线6和控制线7均显色时，结果为阳性；如图3 (a2)所示，当控制 线7显色而检测线6不显色时，结果为阴性。 实施例4
试剂盒将l份已切好的试纸条与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，放入试剂盒，
与4-2(TC避光保存。用于检测时，观察检测线6和控制线7的显色和形状来判断阳性还 是阴性。如图3 (al)所示，当检测线6和控制线7均显色时，结果为阳性；如图3 (a2) 所示，当控制线7显色而检测线6不显色时，结果为阴性。如图3 (a3)所示当控制线7 和检测线6均不显色时，结果无效。
权利要求1、一种快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条，其特征在于该试纸条是在底衬(1)上顺次相互搭接地粘帖样品垫(2)、玻璃纤维膜或聚酯膜(3)、包被膜(4)以及吸水纸(5)组成；其中的包被膜(4)上印制有控制线(7)和检测线(6)；所述控制线(7)包被抗鼠IgG抗体，检测线(6)包被抗猪流感病毒抗体；通过控制线(7)和检测线(6)的显色来定性判断。
2、 根据权利要求1所述的测试试纸条，其中所述底衬(1)为不吸水的塑料硬纸板；样品垫(2)为胶体金颗粒标记抗猪流感病毒的单克隆抗体的硝酰纤维素膜。
3、 根据权利要求1所述的测试试纸条，其中所述包被膜为硝酰纤维素膜。
4、 根据权利要求1所述的快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条，其中所述包被 的抗猪流感病毒的抗体为高纯度的单克隆抗体和/或多克隆抗体。
5、 根据权利要求1所述的快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条，其中所述胶体 金颗粒标记抗猪流感病毒的单克隆抗体为高纯度的单克隆抗体。
6、 根据权利要求1所述的快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条，其中所述的控 制线(7)与检测线(6)上下排列，其间隔为3-5mm。
7、 根据权利要求1所述的快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条，其中可将包被 膜(4)、吸水纸(5)、玻璃纤维膜或聚酯膜(3)粘贴在塑料底板上，组成大板或将l份 已切好的试纸条与干燥剂封装在铝箔塑料袋内，组成试剂盒。
专利摘要本实用新型涉及一种快速检测猪流感病毒的胶体金测试试纸条。所述的试纸条是在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸而形成，包被膜有检测线和控制线，检测线包被猪流感病毒的抗体，控制线包被抗鼠抗体；所述检测线和控制线通过控制胶体金颗粒的大小与多少，得到颜色不同深浅的检测线和控制线从而确定猪流感病毒的有无。该试纸条具有特异性强，敏感性高，操作简便快速，检测结果显示直观，准确，成本低，投资少，不需专用仪器设备及专业人员的特点，容易推广实施，具有较高的社会价值和经济价值。
文档编号G01N33/569GK201397332SQ20092009666
公开日2010年2月3日 申请日期2009年5月8日 优先权日2009年5月8日
发明者孙英峰, 崔尚金, 健 张, 莉 张, 张国伟, 李志荣, 李秀丽, 王英珍, 鄢明华 申请人:天津市畜牧兽医研究所