爱泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋白a抗体联合检测试纸的制作方法

文档序号:5850931阅读:319来源:国知局
专利名称:爱泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋白a抗体联合检测试纸的制作方法
技术领域
本实用新型是涉及生物应用技术领域,特别是涉及一种以胶体金免疫
层析法快速检测爱泼斯坦-巴尔EB病毒衣壳抗原VCA和胸苷激酶TK蛋白 免疫球蛋白AIgA抗体联合快速检测试纸。
背景技术
EB病毒(Epstehi-Barr Virus, EBV)是一种感染人类并引起重要疾病的 DNA病毒。流行病学、血清学和分子生物学资料证实,与EBV感染有关的 疾病很多,特别是与鼻咽癌nasopharyngeal carcinoma, NPC的发生有密切 关系。1997年世界卫生组织的国际抗癌联盟年会上把EBV归类为第一类致 癌物。血清EB病毒-衣壳抗原-免疫球蛋白AEBV-VCA-IgA, EB病毒-早期 抗原-免疫球蛋白A (EBV-EA-IgA)检测目前已用于NPC的临床辅助诊断。 衣壳抗原-免疫球蛋白AVCA-IgA检测通常用于筛査以排除NPC的诊断, 灵敏度高于90%,但有报道表明其特异性有时会低于70%;相反,早期抗 原-免疫球蛋白AEA-IgA检测目前被用于鼻咽癌的确定性检测,特异性高于 90%而灵敏度低于80%,两者在鼻咽癌可疑病例诊断时有互补作用。对于鼻 咽癌疑似病人,VCA-IgA其阴性预测率达98%,可作为排除鼻咽癌的指标, 仅有低于10%的假阴性率;VCA-IgA阳性结果由于有时会产生高达30%的 假阳性率,故检测阳性不作为的NPC阳性确认结果。
TK蛋白是EB病毒在DNA的合成调控中起重要作用的蛋白。Connolly等 [Conolly Y, Littler E , Sun N, et al. Antibodies to Epstein Barr virus thymidine kinase: a characteristic marker for the serological detection of nasopharyngeal carcinoma [ J ] . Int. JCancer, 2001, 15 :692-697]用酶联免疫吸附试验(EL ISA)法检测人体血清中针对EB病毒TK蛋白的IgA抗体,证实此抗体是一个 良好的鼻咽癌标志物,与EBV-VCA-IgA相比,具有较高的检测灵敏度和更 高的特异性。近年来陆续也有相关报道支持这一观点。因而将TK-IgA用于 临床辅助诊断应该会进一步提高鼻咽癌诊断的可靠性。以上所有的报道基 本采用ELISA方法对IgA进行检测,没有用免疫层析胶体金技术检测 EBV-VCA-IgA和EB病毒-胸苷激酶-免疫球蛋白AEBV-TK-IgA的报道,特别是制备成同一种试剂进行快速联合检测。运用免疫层析胶体金技术,研制 新型的EB病毒抗体诊断试剂,将为鼻咽癌的诊断提供更多更好的方法。
运用免疫层析胶体金技术诊断时,标记鼠抗人IgA抗体,包被VCA和 TK抗原,检测时在上样垫上加入50 — 100ul被检样品,样品中的IgA将和 标记的鼠抗人IgA结合形成复合物,样品中若含有抗VCA或抗TK-IgA抗 体,亦同样形成复合物,在样品的带动下扩散到NC膜上进一步层析,当遇 到包被在NC膜上T线处VCA或TK抗原时,抗VCA或TK-IgA-胶体金复 合物将和T线上的抗体结合,被捕获在包被处,当被捕获的胶体金复合物 达到一定数量时,则形成肉眼可见的T线;若血清中不含特异性抗体IgA 抗体,则不能形成免疫复合物,亦不能形成T线,C线作为试剂的质控标 准,阳性和阴性样品检测时均会出现。根据C、 T线的有无直接用肉眼判定 结果,操作简单,整个反应在20分钟内完成。
发明内容
本发明的目的是提供一种爱泼斯坦-巴尔EB病毒衣壳抗原VCA和胸苷 激酶TK蛋白免疫球蛋白AIgA抗体联合快速检测试纸,具有操作简便、反 应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
本发明提供一种爱泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋 白A抗体联合检测试纸,其特征是在塑料支撑板8 —端上设置上样垫1, 在上样垫l 一端连接标记有鼠抗人IgA抗体的胶体金垫2,在胶体金垫2 — 端连接硝酸纤维素膜3,在硝酸纤维素膜3的另一端连接吸样垫4,硝酸纤 维素膜3包被有相互分离的检测线5、 6和质控线7,检测线5、 6为分开包 被重组表达的EB病毒VCA和TK蛋白抗原或抗原片段,质控线7为包被 在NC膜上的抗鼠兔疫球蛋白GIgG构成。
所述的爱泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋白A抗体 联合检测试纸,其特征在于所述的上样垫1为玻璃纤维膜或无纺布,吸样 垫4由吸水滤纸,所述的抗鼠免疫球蛋白GIgG,是羊抗鼠或兔抗IgG构成。
检测线为分开包被在NC膜上的重组表达的EB病毒VCA和TK蛋白 抗原或抗原片段,质控线为包被在NC膜上的抗鼠IgG,如羊抗鼠或兔抗 IgG。标记的胶体金蛋白为鼠抗人IgA抗体。单克隆或多克隆抗体。
上样垫为玻璃纤维膜或无纺布,吸样垫由吸水滤纸构成,符合胶体金 类检测试剂的一般要求。
4抗原的包被方法为以0.01MpH7.2 — 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)将包 被抗原稀释成0.2-2mg/ml的溶液,优选为0.5_ 1.0mg/ml,用喷膜仪在NC 膜下部分别划线,包被T1, T2线,同时在NC膜上部包被抗鼠IgG抗体作 为C线,然后干燥NC膜以固定抗原。标记胶体金颗粒的方法为以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为20 一50nm的胶体金溶液,优选为30—40nm胶体金溶液。制备完成后取100ml 胶体金液放在烧杯内,用0.2MK2CO3调至pH7.0 — 9.6,优选为pH8.6。按 100ml胶体金溶液加入0.5—2mg鼠抗人IgA,优选为lmg鼠抗人IgA。室 温搅拌30-60min,再加入适量牛血清白蛋白BSA,聚乙二醇PEG20000封 闭,离心,弃上清,复溶至100ml,铺在玻璃纤维膜或无纺布上,再置干燥 间(温度20-25。C,湿度小于30%)干燥,切成适当宽度的小条,制成胶体 金垫。试纸的装配方法为在干燥室内(温度20-25。C,湿度小于30%),取 塑料支撑板,将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴,在NC膜T 线一侧搭接胶体金垫粘贴,在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫;在NC膜C 线一侧搭接吸样垫;最后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试 纸条,切好的试纸条可以再装入塑料卡内,形成检测卡。试纸的检测方法为将被检血清或血浆平衡至温室,将试纸条或试剂 卡平放,在上样垫上加入50—100ul被检样品,样品溶解胶体金并在NC膜 上层析,然后用肉眼直接观察在5—20分钟内C、 T线的出现情况,判定检 测结果。Tl线出现说明VCA-IgA阳性,T2线出现说明TK-IgA阳性。本发明的有益效果是提供一种利用免疫层析胶体金技术检测EB病毒 VCA和TK蛋白IgA抗体的联合快速检测试纸。同时检测两种抗原的IgA, 而现有的ELISA方法无法同时检测。VCA-IgA倾向于诊断的高灵敏度,相 对于早期抗原-免疫球蛋白A ,胸苷激酶-免疫球蛋白A同时倾向于诊断的 高灵敏度和高特异性。两项检测同为阳性或同为阴性时,检测的准确性较 单项检测更高, 一项检测为阳性时作为怀疑对象作进一步的检测。同时本 发明运用胶体金免疫层析技术检测方法,不同于ELISA方法,具有操作简 便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。


图1泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋白A抗体联合检测试纸结构示意图。附图符号说明: 1:上样垫2:胶体金垫 4:吸样垫3:硝酸纤维素(NC)膜5: VCA检测线 7:质控(C)线6: TK检测线 8:塑料支撑板具体实施方式
实施例1:泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋白A抗 体的联合快速检测试纸制备 1主要材料UEBV的VCA、 TK抗原利用基因工程重组表达,由中国医学科学院提 供,用于硝酸纤维素NC膜的检测线的包被;鼠抗人IgA单克隆抗体,军事 医学科学院产品,用于胶体金的标记;羊抗鼠IgG:军事医学科学院产品, 用于NC膜质控线的包被。氯金酸Sigma公司产品;NC膜Millipore公 司产品;牛血清白蛋白(BSA),聚乙二醇PEG20000,水解酪蛋白Sigma 产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。1.2鼻咽癌(NPC)阳性或阴性内控血清由公司收集并配制。2.1 IgA胶体金标记氯金酸一柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体 金溶液,制备完成后取三份胶体金,分别用0.2MK2CO3将溶液调到pH7.0、 pH8.6禾BpH9.6。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌,按每100ml溶液 加入0.5mg、 lmg、 2.0mg将鼠抗人IgA缓慢滴加到胶体金溶液中,继续搅 拌30-60分钟,再加入到终浓度为0.1%的PEG 20000和1%的BSA进行封 闭,标记结束后以12000 r/m离心,弃上清,沉淀按原体积复溶至不同配比 的胶体金工作液硼酸盐缓冲液,pH8.0,含BSA、羊血清,蔗糖和表面活性剂 中。然后将标记胶体金溶液按lml溶液铺22cn^的比例加样于无纺布上, 在温度20-25'C,相对湿度在<30%的干燥间干燥2-4小时,制成胶体金垫。2.2 VCA和TK蛋白的包被用0.01MpH7.2PBS将VCA和TK分别稀释 成0.2/ml、 0.5mg/ml、 lmg/ml、 2mg/ml,然后用喷膜仪在NC膜下部按lul/cm 进行划线包被,同时在NC膜上部包被抗鼠IgG抗体,用于产品的质控,包 被完成后将NC膜在在温度20-25°C ,相对湿度在<30%的干燥间干燥8-102方法6小时。2.3联合快速检测试纸的组装在干燥室内取塑料支撑板8 —端上设置上 样垫l,在上样垫l 一端连接标记有鼠抗人IgA抗体的胶体金垫2(搭胶体 金垫的1/5),在胶体金垫2 —端连接硝酸纤维素膜3,在硝酸纤维素膜3 的另一端连接吸样垫4 (搭吸样垫的1/10),硝酸纤维素膜3包被有相互分 离的检测线5、 6和质控线7,检测线5、 6为分开包被重组表达的EB病毒 VCA和TK蛋白抗原或抗原片段,质控线7为包被在NC膜上的抗鼠免疫 球蛋白GIgG构成然后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸 条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内,形成抗体检测试剂卡。上样垫l 为玻璃纤维膜或无纺布,吸样垫4由吸水滤纸,所述的抗鼠免疫球蛋白 GIgG,是羊抗鼠或兔抗IgG构成。2.4检测方法将被检血清或血浆平衡至温室,将试纸条或试剂卡平放,在上样垫上加入50—100ul被检样品,样品溶解胶体金并在NC膜上层析,然后用肉眼直接观察在5—40分钟内C、 T线的出现情况,判定检测结果。Tl线出现说明VCA-IgA阳性,T2线出现说明TK-IgA阳性。2.5试纸工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对,制备小样,用标准的NPC阳性和阴性血清检测,发现最佳组合。2.6性能分析以优化的工艺对数制备小样,按标准方法对试剂的分析灵敏度、分析特异性、不精密度和稳定性进行分析。3结果3.1试纸工艺参数的确定根据小样的检测结果,确定了胶体金标记IgA 的最佳pH值为8.6;最佳标记浓度为0.5-lmg每100ml胶体金溶液;最佳 的胶体金工作液为10mM硼酸酸盐缓冲液,pH8.6,含0.5%BSA、 10%羊血清, 2%蔗糖,0.2%Tween20;最佳包被VCA、 TK蛋白的包被浓度各为0.5 — lmg/ml。检测结果的最佳判定时间为5-30分钟。3.2性能分析分析性能表明试剂具有良好的灵敏度,对内控阳性血清最 高的检测滴度到l: 128,和ELISA试剂接近。对一般性血清干扰物如高血 脂、溶血、黄疸无非特异性反应,对艾滋病病毒(HIV)、乙肝表面抗原(HBSAG)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒(TP)等传染病血清样本无非特 异性反应,对甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺素特异性抗原(PSA)等其它肿瘤标志物无非特异性反应。对肝素、乙二铵四乙酸二钠(EDTA)和枸橼酸纳等抗凝剂亦无非特异性反应。实施例2:联合快速检测试纸临床样本试验1材料1.1 EBV VCA和TK蛋白IgA抗体的联合快速检测试纸,由公司按优化的参 数制备。1.2 NPC临床血清NPC阳性血清,包括NPC 1、 2、 3和4期血清,共420 份;NPC阴性血清400份。由公司在相关医院获得。2方法按优化的方法进行。对临床样本的检测结果进行分析统计。 3结果样本的检测结果如下-表1联合快速检测试纸对临床样本的检测结果临床样本数量VCA阳性TK阳性VCA&TK阳性VCA&TK阴性NPC阴性40034115358NPC I期383838380NPC II期474747470NPC III期10510198984NPC IV期23021621221212从检测结果可以看出,联合检测试纸对鼻咽癌阳性样本检测时全为阳性的检出率为395/420=94%,只较单独VCA阳性95.7%稍有下降,但不明显。而在阴性样本的检 测方面,全为阳性的假阳性为1.25%,较VCA阳性8.5。/。有明显下降。全为阴性的特异性 为89.5%,较单独的VCA特异性91.5。/。略有上升,但多数是一个阳性的可疑检测结果, TK检测的特异性达到97.3y。。可以看出联合检测的试纸条提供了更多的检测信息,综合 检测判定结果更为准确,可靠。8
权利要求1、一种爱泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白免疫球蛋白A抗体联合检测试纸,其特征是在塑料支撑板(8)一端上设置上样垫(1),在上样垫(1)一端连接标记有鼠抗人IgA抗体的胶体金垫(2),在胶体金垫(2)一端连接硝酸纤维素膜(3),在硝酸纤维素膜(3)的另一端连接吸样垫(4),硝酸纤维素膜(3)包被有相互分离的检测线(5)、(6)和质控线(7),检测线(5)、(6)为分开包被重组表达的EB病毒VCA和TK蛋白抗原或抗原片段,质控线7为包被在NC膜上的抗鼠免疫球蛋白G(IgG)构成。
2、 根据权利要求1所述的爱泼斯坦-巴尔病毒衣壳抗原和胸苷激酶蛋白 免疫球蛋白A抗体联合检测试纸,其特征在于所述的上样垫(1)为玻璃纤 维膜或无纺布,吸样垫(4)为吸水滤纸,所述的抗鼠免疫球蛋白G (IgG), 是羊抗鼠或兔抗IgG构成。
专利摘要本实用新型是涉及一种爱泼斯坦-巴尔EB病毒衣壳抗原VCA和胸苷激酶TK蛋白免疫球蛋白AIgA抗体联合快速检测试纸。在塑料支撑板一端上设置上样垫,在上样垫一端连接标记有鼠抗人IgA抗体的胶体金垫,在胶体金垫一端连接硝酸纤维素膜,在硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫,硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线,检测线为分开包被重组表达的EB病毒VCA和TK蛋白抗原或抗原片段,质控线为包被在NC膜上的抗鼠免疫球蛋白G(IgG)构成。检测时将被检样品加在试纸条卡上样垫上,然后直接观察免疫反应结果,具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
文档编号G01N33/569GK201413329SQ20092009690
公开日2010年2月24日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者洲 李, 杨发青 申请人:天津中新科炬生物制药有限公司
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1