专利名称：高通量食源性微生物快速检测仪的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测仪，尤其是涉及高通量食源性微生物快速检测仪。
背景技术：
随着分子生物学在医学领域的广泛应用，芯片技术必将成为未来临床疾病 诊断中不可缺少的一个新内容。芯片技术是伴随人类基因组计划而产生的，是 近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展，其突出特点在于高速度、高通 量、高并行性及多样化、微型化、自动化等，已经成为当今生物医学技术研究 的热点，在基因诊断、药物开发和毒性分析、病原检测等多个领域显示出巨大 的发展潜力和应用价值。
目前，尽管芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但是仍然 存在着许多的问题，而且价格昂贵，从而严重地制约了芯片技术的广泛应用和 进一步发展。如在标记方法上,荧光法是目前4吏用最多的方法，但它的灵敏度 不高、需要避光，杂交完成后要快速检测以免荧光淬灭，另外结果检测需用价
格极其昂贵的激光扫描仪等特殊设备；同位素标记法由于需要同位素和放射自 显影，有使用不便，操作复杂，耗时较长、有污染的缺点。尤其是在基因芯片 的检测中，由用萸光标记会影响PCR扩增效率，同位素标记常用的如，和， 半衰期又太短，均不易推广使用，而且PCR扩增既需要设计引物，又要PCR仪， 需要对各检测对象的乾序列建立不同的扩增体系、扩增方法和扩增条件，这显 然大大增加了工作量和工作难度。总之，芯片技术在样品的制备、探针合成与 固定、分子的标记、数据的读取与分析等凡个方面仍然存在着许多难以解决的 问题。特别是技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析泛围较 狹窄等问題限制了该技术在生物检測中的应用。
肽核酸(Peptide Nucleic Acid, PNA)是借助计算机辅助设计的一种DM 模拟物，与DM —样也是由ATCG四种碱基的单体聚合而成，只是两者的骨架 结构不同DM是由磷酸二酯键连接而成的磷酸戊糖骨架；而P似是由酰J9^ 连接的重复的N-2-氨乙基苷氨酸单位构成的。PM不易被蛋白酶、核酸酶等降 解，也不与血清中蚤白结合，但可以通过ATCG四种^^的互补配对原則和DNA 杂交结合-由予PNA的假肽骨架是电中性的，PNA与DM或RNA间的杂交不存 在静电斥力.因而具有更强的亲和姓，其结合的穩定姓和特异性都大大提高.虽然目前还夫有以PNA作为4笑々+用于基囡或乂务白芯.H ,务劍方面的報道，但 我们的分浙认为、与传统的DNA -探针相比，PNA做为核酸杂交棂钍在斑;仑上可 能更具有优势.因为倍统,DNA攛抖只能鸟蕈链的DNA杂交结合，疾们知道PCR
产物靠是双链的，因此在杂交蕭必领:汤过t'Ht过菘传双链的PCR产物解休力笨
锫的DNA片殺，而a在杂交过菘中必须俣掊低温以^rjh产物DNA复性而影响杂 交敛率，产生^！阴性结莱.，但PNA作为探钍其不仅仅可以鸟車絲的DNA杂交高 效杂交 甚至还可以直接与双链以链侵袭模式结合形成稳定的 DNA-PN.A-DNA的三错复合物，因此大大增加了对DNA的检观!能力，BL可降低标 本处斑的复杂姓，简化前期标束的i备时间如搡作过菘，从而为临泉快速基因 检测提供了可能.
基于上i术斑-沦，我们畀创嫂地以PN.A为4笑钍，对PNA与DNA、蛋白廣的结合 活姓，及对其做为芯片检测的探朴特性和杂交特姓等系统地进行了研究、并鸟 现行的芯片检测4笑针进行比较在此基础.匕并首欢将PNA芯片引入表面等离
子汰共振传感器，对其做为;^测探针的芯片的特异娃、敏感性，及实际i合测应 用的方法与特嫂进.f亍了详細的研究「
表面等离子汰共振(Surface Plasmon Resonance.. SPR〗传感器是近年迅 速发—廣—起夹的新型光学倍感器装f ,其突出特点是可以实3十(real n me L在 线〖on line)地检测生物分子之间的相反作用，而EL不需要标记芨纯化，是 当前国际传感器4夷谅_的.研究热点之一 ，
作为探针固定的疏醇化合物表面蕈分子层自纽装层(Self- assembled Monolayer: SAM)技東自20世纪80年代初振道以来，由于其满足了作为模型 界面的几个主要要求，包括和基底的本固结合，可控制的分子3又向有序排列， 可控制的外表面性质及可控制的厚度等方面，因此耀-快地得到了各方的关汰— 总的来说，SAM是基千巯基化合牆与基底材料(如金、银，铂等)的强烈化学 结合而形成的.如在金膜表面，巯基被氣化而生成疏金化合键.—.其化学反应式 如下2Au+2RSH—2Au-SR+H7, Au-S之间的化学键合力很强，其键能高达184k JZ鹏〗，很少有其他基团可以与其竟争，这就保证了结合的选择性。同时，SAM 的排列紧密有序、对酸， >喊、离子渗透等有^^强的4艮抗力—应用此方法固定揮: 朴可以使探朴结会牢固.且排列有序、分东均匀，我们基干巯基与金属表面的 这种强烈化学结合的转性，在本实用浙型中将巯基修饬的PNA探朴与SPR设备 的金属薄膜结合、制成PNA -深针阵列的芯片，从而完成对各种lfe基因i蛋白的
发明内容本实用新型的目的在于提供肽核酸(PNA )作为探针的高通量食源性微生 物快速检测仪。通过本实用新型，可以绕过对样品进行扩增、简化样本处理步 骤，提高检测的灵敏度和特异性；且以光学信号作为检测信号，既稳定，又易 于检测，使结果检测、分析的设备和技术大为简化。从而可以充分利用生物芯 片技术的高通量，高敏感、高特异的特性，克服目前检测芯片存在的主要缺点。 并且为了进一步提高芯片;除测的效率。我们还在传统SPR传感器的基础上，研 究开发了一种更简单的、易实施的、价廉的纳米金属膜的镀制方法，自行设计 编制了相应的的信息处理和操作控制软件，设计裝配了小型的流动样本注入系 统，及适用于芯片预杂交、杂交及漂洗的温控测试池，从而4吏该传感器更具有 了适用于芯片检测的高自动化及智能化。由于本实用新型研究提供的这种生物 芯片及其快速检测的方法具有杂交、检测设备简单，技术稳定易于掌握，灵敏 度高，重复性好、应用范围广等的特性，其必将成为可广泛应用于普通实验室， 甚至野外环境的新一代生物芯片a
本实用新型的目的是这样实现的本实用新型包括检测仪主架，其特征在 于检测仪主架上有反应池，在反应池上有一部分浸入在反应池的肽核酸探针 生物芯片，在肽核酸探针生物芯片上组装有棱镜，在棱镜的一端的上方安装有 偏振片，在偏振片的上方有激光发生器在棱镜的另一端的上方安装检测器；肽 核酸探针生物芯片表面附着的有金属薄膜，金属薄膜表面点制有肽核酸探针阵 列；金属薄膜最好是厚度为10簡~150謂的纳米金膜。本实用新型工作原理是 当入射光以一定的角度经一组光学器件一一通常为一高折射率的棱镜上顺序 放置一层低折射率的耦合层(多为金属薄膜)耦合激发后，在金属膜界面上发 生表面等离子体共振，即入射光与界表面的自由电子会发生相互作用，其中部 分入射光波被电荷密度波吸收，则入射光线不能发生全反射，从而导致反射光 的强度大大减弱，反射角也发生明显的偏差，而且这种反射光的强度和角度的 变化与界面上吸附的生物物质7一子數—量的多少成一定的比例关系。
本实用新型所使用的术语"生物芯片"是由生物大分子或组织附着于玻 璃-.陶资、金属片或尼龙膜-，竭酸纤維素膜等基片物质上构建而成的阵列。生 物芯片的实例包括基因(核酸)芯片、细胞芯片、蛋白芯片、抗体芯片或组织芯 片等，
本实用浙型所述的核酸包括DNA、 RNA、 cDNA或PNA. 本实用新型所使用的术语"肽核酸"是核酸的一种DNA模拟物，与—
样也是由ATCG四种碱基的单休聚合而成，只是两者的骨架结构不同DNA是由 磷酸二酯键连接而成的磷酸戊糖骨架而PNA是由酰胺键连接的重复的N-2-賓乙基苷義酸单位賴成的。
本实用新型所迷的蛋白包括各种坑体、抗原、核酸功能相关酶等,
本实用新型考镇用的术语"纳来金属膜"是指由直径在10mn-150mn之间的 纳泉金顆較形成^i^度为10nm-〗50nm余瞎层—束实用浙^传用的优选W纳夫 金属膜层为厚度为50nm的纳束金膜
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(1) 本实用新型采用PNA做为杂交探针，较之普通DNA或PNA探针具有更高
的灵敏度和特异性；
(2) 本实用新型采用PNA做为杂交探针，不但避免了PCR反应，而且降低了
样品的处理要求,简化了操作步骤,缩短了检测时间;
(3) 本实用新型采用PNA做为杂交探针,并应用SPR技术进行信号检测,不 需要昂贵的检测仪器，降低了芯片的使用成本及实验条件。
总之,本实用新型的研制成功将真正实现芯片技术的高通量、特异性、敏
感性以及快速等特点。既可对病原微生物进行快速而准确的检测和筌定，也可 以进行某一或多个特定基因、或与其相关的表达产物的研究，还可以进行基因
和蛋白质与疾病关系的研究、疾病相关基因的验证以及新药物的开发与筛选， 疾病的分子i貪断，治疗过程的追踪和预后等方面，为临床疾病的预防和治疗提
供重要的指导作用；同时该"l支术也可以应用到在野战条件下由基层检验人员实 施战场病原体分布的调查、战伤感染的早期诊断、生物战剂的早期发现等方面， 将会产生较好的经济效益和社会效益。
图i为本实用新型结构示意图具体实施方式
本实用新型包括检测仪主架9，在检测仪主架9上有反应池8，在反应池8
上有一部分浸入在反应池8的肽核酸探针生物芯片5，在肽核酸^:针生物芯片
5上组装有棱镜3，在棱镜3的一端的上方安装有偏振片2,在偏振片2的上方 有激光发生器1在棱镜3的另一端的上方安装检测器4，肽核酸探针生物芯片 5表面附着的有厚度为50nm的纳米金膜6,金属薄膜6表面点制有肽核酸探针 阵列7。本实用新型工作原理是当激光发生器1激发的入射光以一定的角度经 高折射率的棱镜3上顺序放置一层低折射率的金膜6辆合激发后，在金膜6界 面上发生表面等离子体共振，即入射光与界^^面的自由电子会发生相互作用， 其中部分入射光波被电荷密度波吸收，则入射光线不能发生全反射，从而导致 反射光的强度大大减弱，反射角也发生明显的偏差，而且这种反射光的强度和 角度的变化与界面上吸附的生物物质分子数量的多少成一定的比例关系，反射光射入检测器4后，检测器4检测这种反射光的强度和角度，并将这种变化 值输入分析设备(如电脑)后能检测出生物物质分子数量的。
权利要求1、高通量食源性微生物快速检测仪，包括检测仪主架(9)，其特征在于检测仪主架(9)上有反应池(8)，在反应池(8)上有一部分浸入在反应池(8)的肽核酸探针生物芯片(5)，在肽核酸探针生物芯片(5)上组装有棱镜(3)，在棱镜(3)的一端的上方安装有偏振片(2)，在偏振片(2)的上方有激光发生器(1)在棱镜(3)的另一端的上方安装检测器(4)。
2、 根据权利要求1所述的高通量食源性微生物快速检测仪，其特征在于肽 核酸探针生物芯片(5)上连接有肽核酸检测探针(7 )，肽核酸探针(7 )附着 有金属薄膜(6 )。
3、 根据权利要求1或2所述的高通量食源性微生物快速检测仪，其特征在于 金属薄膜(6 )是厚度为10nra~ 150腿的纳米金膜。
专利摘要本实用新型公开了一种高通量食源性微生物快速检测仪，包括检测仪主架，其特征在于检测仪主架上有反应池，在反应池上有一部分浸入在反应池的肽核酸探针生物芯片，在肽核酸探针生物芯片上组装有棱镜，在棱镜的一端的上方安装有偏振片，在偏振片的上方有激光发生器在棱镜的另一端的上方安装检测器；肽核酸探针生物芯片表面附着的有金属薄膜，金属薄膜表面点制有肽核酸探针阵列。本实用新型的研制成功将真正实现芯片技术的高通量、特异性、敏感性以及快速等特点。既可对病原微生物进行快速而准确的检测和鉴定，也可以进行某一或多个特定基因、或与其相关的表达产物的研究，还可以进行基因和蛋白质与疾病关系的研究、疾病相关基因的验证以及新药物的开发与筛选，疾病的分子诊断，治疗过程的追踪和预后等方面，为临床疾病的预防和治疗提供重要的指导作用；同时该技术也可以应用到在野战条件下由基层检验人员实施战场病原体分布的调查、战伤感染的早期诊断、生物战剂的早期发现等方面，将会产生较好的经济效益和社会效益。
文档编号G01N21/17GK201372286SQ20092013565
公开日2009年12月30日 申请日期2009年3月17日 优先权日2009年3月17日
发明者唐国林, 辛焕发, 清 陆, 顾大勇 申请人:唐国林;顾大勇;陆 清;辛焕发