用于同时分析能够彼此络合的蛋白质的校准物/对照物的制作方法

专利名称：用于同时分析能够彼此络合的蛋白质的校准物/对照物的制作方法
技术领域：
本发明涉及组合物和方法，该方法包括改变两种或更多种蛋白质以抑制其相互识 别和结合。该组合物可在分析检测时用作能够检测改变的和未改变的两者形式或天然形式 的蛋白质中的一种或多种的参照物、校准物或对照物。
背景技术：
先兆子痫是高血压、浮肿和蛋白尿的综合征，影响5%到10%的妊娠，并导致大量 的母体和胎儿的发病率和死亡率。先兆子痫每年造成全世界至少200，000例孕产妇死亡。 先兆子痫的症状通常在妊娠第20周后出现。胎儿和胎盘的发育由若干生长因子介导。血管内皮生长因子(VEGF)是一种内皮 细胞特异性有丝分裂原和血管生成诱导因子。VEGF介导血管渗透性，并已表明参与肾小球 毛细血管的修复。VEGF作为同源二聚体结合到两种同源跨膜受体酪氨酸激酶(fms样酪氨 酸激酶(Flt-I)和激酶结构域受体(KDR))中的一种。胎盘生长因子(PlGF)为VEGF家族成员，该成员也与胎盘发育有关。PlGF由细胞 滋养层细胞和合体滋养层细胞表达，并能够诱导内皮细胞的增殖、迁移和活化。PlGF作为同 源二聚体结合到Flt-I受体，但不结合到KDR受体。PlGF和VEGF两者均有助于提高有丝分 裂活性和促进血管生成，这对于发育中的胎盘很关键。一种可溶形式的Flt-I受体(sFlt-Ι)已在人脐静脉内皮细胞培养基中被鉴别出， 并随后在胎盘组织中实现了体内表达。sFlt-Ι是Flt-I受体的剪接变体，缺乏跨膜域和胞 质域。sFlt-Ι以高亲和性结合到VEGF，但sFlt-1不促进内皮细胞的有丝分裂。据信sFlt_l 充当“生理性汇点”来抑制VEGF的信号通路。因此，sFlt-Ι含量的调控起到调节VEGF和 VEGF信号通路的作用。精细调控VEGF和VEGF的信号通路对于通过发育中的胎盘中的滋养 层细胞维持适当的增殖、迁移和血管生成是很关键的。单个基因进行编码以用于人P1GF。然而，对成熟PlGF mRNA进行剪接会产生三种 不同长度的同工型P1GF-1(P1GF131)、P1GF-2(P1GF152)和 P1GF-3 (P1GF203)。已报道存在 另一禾中变体 P1GF-4 (Yang，et al, JReprod Immunol, ν 60，ρ53_60，2003 (Yang 等人，《生殖 免疫学杂志》，第60卷第53-60页，2003年))。PlGF以糖基化同源二聚体的形式分泌。最近已表明SFlt-I和PlGF可以单独或联合用作生物标记来预测、诊断或监测先 兆子痫(Levine et al，NEJM，v 350, ρ 672-683，2004 (Levine等人，《新英格兰医学杂志》， 第 350 卷第 672-683 页，2004 年))。成熟人PlGF-I的氨基酸序列(氨基酸残基1-132)已公布，并可得自Protein Data Bank(蛋白质数据库)，标识为PDB IFZV(Iyer, et al, J. Biol Chem, ν 276，ρ 12153-12161， 2001 (Iyer等人，《生物化学杂志》，第276卷第12153—12161页，2001年))。该序列在本文标识为序列标识号1 MLPAVPPQQff ALSAGNGSSE VEVVPFQEVff GRSYCRALERLVDVVSEYPS EVEHMFSPSC VSLLRCTGCC GDENLHCVPVETANVTMQLL KIRSGDRPSY VELTFSQHVR CECRPLREKMKPERC⑶AVP RR对易患先兆子痫或患有先兆子痫的个体的诊断可以通过确定在取自个体的生物 样品(例如尿液、全血、血清、血浆、唾液等)中的血管内皮生长因子(尤其是P1GF)和/或 受体酪氨酸激酶(尤其是sFlt-Ι)的存在或含量来进行。在分析检测中，参照物、校准物和 对照物组合物对于确定目的被分析物的含量或确认被分析物的存在，以用于建立准确和精 密的分析检测是很重要的。只要被分析物易得，可溶于适当的溶剂_对于生物被分析物通 常为含水的、稳定的，并且不会与可能存在于该组合物中的其他组分有害地进行交互，制备 此类液体或干物形式的组合物通常不会存在困难。如上所述，PlGF结合sFlt-Ι以形成稳 定的缔合复合物。因此，不能制备包含一起以独立量存在的天然蛋白质的组合物，这些天然 蛋白质在分析检测中适于用作参照物、校准物或对照物来检测PlGF或sFlt-Ι或检测PlGF 和sFlt-Ι两者。虽然可以制备含有各个分离的蛋白质的组合物，但有利的是能够制备含有 蛋白质两者一起的组合物。因此，存在对包含这些已知量和独立量一起的蛋白质的参照物、 校准物或对照物组合物的需求。本发明满足了该需求。

发明内容
在一个方面，本发明涉及组合物，该组合物含有两种或更多种蛋白质，该蛋白质中 的一种或多种经过改变以充分地减弱或基本防止或消除相互识别和结合。在分析检测组合 物中的蛋白质中的一种或多种时，此类组合物可用作参照物、校准物或对照物。为了清楚说明，鉴于形成非共价键缔合复合物的未改变的/天然蛋白质A和B这 两种蛋白质，术语“基本防止或消除其相互识别和结合”意指在测定其相互结合的分析中， 改变的A结合到未改变的/天然的B、或未改变的/天然的A结合到改变的B、或改变的A 结合到改变的B不可检测或几乎不可检测，或通过亲和常数的测定所定量测量的相互亲和 力小于观察到的未改变的/天然的A与未改变的/天然的B的相互亲和力的大约10%。术 语“充分地减弱”意指进行相互结合，但已减弱到对于特定应用为合格的程度。考虑凡是有待在分析检测中确定未改变的或天然蛋白质A的存在或含量的情况， 该分析检测采用了蛋白质A表位特异性的一种或多种受体。并且考虑蛋白质A经过改变以 减弱或基本消除与蛋白质B的结合。虽然蛋白质A经过改变，但该表位一直为完整或合格 地完整，使得它们保持识别并结合受体的能力。从而，改变的蛋白质A在校准分析中使用为 合格的，从而确认样品中未改变的/天然蛋白质A的存在或用于验证分析未改变的/天然 的蛋白质A的准确性和精密性。因此，受体通常能够识别并结合改变的和未改变的/天然 形式的蛋白质两者。包括受体的分析检测通常为免疫分析法，该分析法使用以下物质作为 受体多克隆或单克隆抗体；完整的、聚合的和/或嵌合形式的抗体或抗体片段。也使用其 他类型的受体，例如适体(US 5, 840, 867 ；US 6，207，388)。在使用蛋白质B表位特异性受 体来测定未改变的/天然蛋白质B的分析检测中，改变的蛋白质A的表位不必要一直为完 整的。唯一重要的是改变的蛋白质A和蛋白质B的相互识别和结合已充分地减弱或基本消
如果蛋白质A和蛋白质B两者均被改变以减轻或基本消除其相互识别和结合，那 么，在测定未改变的/天然蛋白质A的分析检测中、或在测定未改变的/天然蛋白质B的分 析检测中、或在分析未改变的/天然蛋白质A和B两者的分析检测中(该分析使用蛋白质 A表位特异性受体和蛋白质B表位特异性受体)，这些改变的蛋白质中的表位在分析中保持 识别和结合受体的能力。然后，含有改变的蛋白质A和改变的蛋白质B两者一起的组合物 可用于校准检测，从而确认存在未改变的/天然蛋白质A、或存在未改变的/天然蛋白质B、 或存在未改变的/天然蛋白质A和未改变的/天然蛋白质B两者，并用于验证检测的准确 性和精密性。在另一方面，本发明涉及用于分析第一蛋白质或第二蛋白质或分析第一和第二蛋 白质两者的参照物、校准物或对照物组合物，其中第一蛋白质或第二蛋白质或第一蛋白质 和第二蛋白质的一个或多个氨基酸或一个或多个非氨基酸基团已被删除、修饰或被不同的 氨基酸基团或非氨基酸基团替换，从而减弱或基本消除了第一蛋白质和第二蛋白质的相互
纟口口。在另一方面，本发明涉及含有受体酪氨酸激酶(优选fms样酪氨酸激酶，更优选 sFlt-Ι)和血管内皮生长因子(其中任一者或两者被氨基酸或糖基删除、修饰或置换而改 变)的组合物。血管内皮生长因子可以是胎盘生长因子，并优选P1GF-1。优选的组合物包 含sFlt-Ι和改变的PlGF-I，改变的PlGF-I使丙氨酸取代以下物质a)序列标识号1的第25位脯氨酸，或b)序列标识号1的第27位谷氨酰胺，或c)序列标识号1的第60位半胱氨酸，或d)序列标识号1的第72位天冬氨酸，或e)序列标识号1的第73位谷氨酸，或f)序列标识号1的第84位天冬酰胺，或g)序列标识号1的第98位脯氨酸，或h)序列标识号1的第100位酪氨酸，或改变的PlGF-I具有取代序列标识号1的第 70位半胱氨酸的甘氨酸、或在a)到h)中的丙氨酸置换和甘氨酸置换的任何组合。优选的组合物包含sFlt_l ；和改变的P1GF-1，其具有取代序列标识号1的第72 位天冬氨酸的丙氨酸和取代序列标识号1的第73位谷氨酸。另一个优选的组合物包含sFlt-l ；和改变的P1GF-1，其具有取代序列标识号1的 第70位半胱氨酸的甘氨酸、取代序列标识号1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代序列标 识号1的第73位谷氨酸的丙氨酸。在另一方面，本发明涉及用于对样品中蛋白质的检测进行校准的方法，该方法包 括以下步骤将上述含有已知量的蛋白质的组合物与蛋白质的第一表位特异性受体接触，从而 形成包含受体和组合物的蛋白质的复合物；将第1)步骤中形成的复合物与蛋白质的第二表位特异性标记受体接触，从而形 成包含受体、组合物的蛋白质和标记受体的复合物；检测来自结合的标记受体的信号或来自游离的标记受体的信号；以及，
将来自游离的或结合的标记受体的信号与组合物中已知量的蛋白质相关。在另一方面，本发明涉及用于对样品中蛋白质的检测进行校准的方法，该方法包 括以下步骤1)将上述含有已知量的蛋白质的组合物与蛋白质的第一表位特异性的固定的受 体接触，从而形成包含固定的受体和组合物的蛋白质的复合物；2)将第1)步骤中形成的复合物与蛋白质的第二表位特异性标记受体接触，从而 形成包含固定的受体、组合物的蛋白质和标记受体的复合物；将结合的标记受体与游离的 标记受体分离；3)检测来自结合的标记受体的信号或来自游离的标记受体的信号；以及，4)将来自游离的或结合的标记受体的信号与组合物中已知量的蛋白质相关。在另一方面，本发明涉及对样品中受体酪氨酸激酶和/或血管内皮生长因子的检 测进行校准的方法，该方法包括以下步骤1)制备含有已知量或预先确定量的受体酪氨酸激酶和已知量或预先确定量的血 管内皮生长因子(其中任一者或两者如上所述被改变以减弱或基本消除其相互识别和结 合)的组合物；2)将组合物与受体酪氨酸激酶的第一表位特异性受体和/或血管内皮生长因子 的第一表位特异性受体接触，从而形成受体酪氨酸激酶的第一表位特异性受体和受体酪氨 酸激酶和/或血管内皮生长因子的第一表位特异性受体和内皮生长因子的第一复合物；3)将第2)步骤中形成的复合物与受体酪氨酸激酶的第二表位特异性标记受体和 /或内皮生长因子的第二表位特异性标记受体接触；从而形成包含受体酪氨酸激酶的第一 表位特异性受体、受体酪氨酸激酶和受体酪氨酸激酶的第二表位特异性标记受体和/或内 皮生长因子的第一表位特异性受体、内皮生长因子和内皮生长因子的第二表位特异性标记 受体的第二复合物；4)将结合的受体酪氨酸激酶的特异性标记受体与游离的受体酪氨酸激酶的特异 性标记受体分离和/或将结合的内皮生长因子的特异性标记受体与游离的内皮生长因子 的特异性标记受体分离；5)检测来自结合的受体酪氨酸激酶的特异性标记受体的信号或来自游离的受体 酪氨酸激酶的特异性标记受体的信号；和/或，6)检测来自结合的内皮生长因子的特异性标记受体的信号或来自游离的内皮生 长因子的特异性标记受体的信号；和7)将来自游离的或结合的受体酪氨酸激酶的特异性标记受体的信号和/或来自 游离的或结合的内皮生长因子的特异性标记受体的信号与组合物中已知量的受体酪氨酸 激酶和/或内皮生长因子相关。在一个优选的实施例中，受体酪氨酸激酶为sFlt-Ι并且内皮生长因子为P1GF-1， 该PlGF-I已被改变以使丙氨酸取代以下物质a)序列标识号1的第25位脯氨酸，或b)序列标识号1的第27位谷氨酰胺，或c)序列标识号1的第60位半胱氨酸，或d)序列标识号1的第72位天冬氨酸，或
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e)序列标识号1的第73位谷氨酸，或f)序列标识号1的第84位天冬酰胺，或g)序列标识号1的第98位脯氨酸，或h)序列标识号1的第100位酪氨酸，或改变的PlGF-I具有取代序列标识号1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、或在a)到h) 中的丙氨酸置换和甘氨酸置换的任何组合。在一个更优选的实施例中，受体酪氨酸激酶为sFlt-Ι并且内皮生长因子为 PlGF-I，该PlGF-I已被改变以使丙氨酸取代序列标识号1的第72位天冬氨酸以及使丙氨 酸取代序列标识号1的第73位谷氨酸。在另一个更优选的实施例中，受体酪氨酸激酶为sFlt-Ι并且内皮生长因子为 PlGF-I，该PlGF-I已被改变以使甘氨酸取代序列标识号1的第70位半胱氨酸、使丙氨酸取 代序列标识号1的第72位天冬氨酸以及使丙氨酸取代序列标识号1的第73位谷氨酸。另一方面，本发明涉及测定样品中蛋白质的量或确认样品中蛋白质存在的方法， 该方法包括以下步骤a)将样品与蛋白质的第一表位特异性的固定的受体接触，从而形成包含蛋白质的 第一表位特异性的固定的受体和蛋白质的第一复合物；b)将第一复合物与蛋白质的第二表位特异性标记受体接触，从而形成蛋白质的第 一表位特异性受体、蛋白质和蛋白质的第二表位特异性标记受体的第二复合物；c)将在第二复合物中结合的标记受体与游离的标记受体分离；d)测定来自在第二复合物中结合的标记受体的信号或来自游离的标记受体的信 号；e)将蛋白质的第一表位特异性的固定的受体与上述含有已知量或预先确定量的 蛋白质的组合物接触，从而形成包含蛋白质的第一表位特异性的固定的受体和组合物的蛋 白质的第三复合物；f)将第三复合物与蛋白质的第二表位特异性标记受体接触，从而形成蛋白质的第 一表位特异性受体、组合物的蛋白质和蛋白质的第二表位特异性标记受体的第四复合物；g)将在第四复合物中结合的标记受体与游离的标记受体分离；h)测定来自在第四复合物中结合的标记受体的信号或来自游离的标记受体的信 号；和i)比较d)和h)中测定的信号，进而确认蛋白质存在或测定样品中蛋白质含量。在一个优选的实施例中，待测定的蛋白质为血管内皮生长因子。在一个更优选的 实施例中，待测定的蛋白质为P1GF，尤其是P1GF-1，并且组合物中的第二蛋白质为受体酪 氨酸激酶。在一个更优选的实施例中，待测定的蛋白质为PlGF-I并且组合物中的第二蛋白 质为sFlt-Ι。在一个更优选的实施例中，待测定的蛋白质为P1GF-1，组合物中的第二蛋白 质为sFlt-Ι，组合物的PlGF-I已被改变以具有取代以下物质的丙氨酸a)序列标识号1的第25位脯氨酸，或b)序列标识号1的第27位谷氨酰胺，或c)序列标识号1的第60位半胱氨酸，或d)序列标识号1的第72位天冬氨酸，或
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e)序列标识号1的第73位谷氨酸，或f)序列标识号1的第84位天冬酰胺，或g)序列标识号1的第98位脯氨酸，或h)序列标识号1的第100位酪氨酸，或改变的PlGF-I具有取代序列标识号1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、或在a)到h) 中的丙氨酸置换和甘氨酸置换的任何组合。在一个更优选的实施例中，待测定的蛋白质为P1GF-1，组合物中的第二蛋白质为 sFlt-Ι，并且组合物的PlGF-I具有取代序列标识号1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代 序列标识号1的第73位谷氨酸的丙氨酸。在另一个更优选的实施例中，待测定的蛋白质为P1GF-1，组合物中的第二蛋白质 为sFlt-Ι，并且组合物的PlGF-I具有取代序列标识号1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、取 代序列标识号1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代序列标识号1的第73位谷氨酸的丙氨酸。


图IA示出了基于ELISA的P1GF-1变体结合到Flt-I的可溶性部分。用浓度在1 和16ng/ml之间的范围递增的可溶性蛋白质进行PlGF-I变体到人Flt-I (以0. 5 μ g/ml在 96孔板上涂布)的结合。野生型PlGF-I用作阳性对照。图IB示出了基于ELISA的P1GF-1变体结合到Flt-I的可溶性部分。计算P1GF-1 变体在浓度为8ng/ml时的结合相对于野生型PlGF-I的结合的百分比。所示结果代表三次 独立实验的平均值。图2示出了三种PlGF重组蛋白质的纯度。银染(A 通道1、2和3)和用单克隆 Rat-4进行的蛋白质印迹出通道4、5和6)。通道分配M :SeaBlue Iadder(Invitrogen)； 通道 1、4 :P126(DE)；通道 2、5 :P126 (AA)以及通道 3、6 :P126 (GAA)。
具体实施例方式虽然本发明将以与先兆子痫和生物标记蛋白质sFlt-Ι和PlGF-I相关的某些优选 的实施例进行描述，但应当理解本发明涉及任何蛋白质组合物及其用途，其中该组合物的 一种或多种蛋白组分已被改变以减弱相互识别和结合。不管先兆子痫生物标记蛋白质是使用单个分析平台或单个试剂盒测定，或在独立 分析或试剂盒中独立地测定，有利的是具有在同一配方中包含生物标记蛋白两者一起的对 照物或校准物，这两种生物标记蛋白具有已知的或预先确定的浓度和所需的浓度比率。至 少有两个问题与一起使用天然或未改变形式的sFlt-Ι和PlGF来制备参照物、校准物或对 照物组合物相关首先sFlt-Ι和PlGF通过上述每一个蛋白质上存在的特定结合域彼此结 合；其次，在中期到晚期孕妇的血清中，无论她们是否患有先兆子痫，sFlt-Ι相对于PlGF通 常都显著过剩。由于PlGF几乎可以定量结合到sFlt-Ι，因此，将未修饰的或天然的PlGF与 未修饰的或天然的sFlt-Ι —起混合并保存，在用于校准PlGF或sFlt-1的检测的分析的组 合物中不会起到符合要求的作用。已对PlGF进行了氨基酸置换以减弱或基本消除sFlt-Ι和PlGF的相互识别和结合(Errico et al J. Biol. Chem. 279，43929-43939，2004 (Errico 等人，《生物化学杂志》，第 279卷第43929-43939页，2004年))。这些氨基酸置换对PlGF的整个蛋白质结构没有显著 的影响。结合表位一直为完整的，并使得这些改变的蛋白质与组合物中的sFlt-1 —起混合 和保存用作分析检测的参照物、校准物或对照物，这些分析检测设计用于检测未改变的或 天然P1GF、未改变的或天然sFlt-Ι或两者。由于可获得PlGF的氨基酸序列和三维晶体结构，因此为针对PlGF进行氨基酸修 饰、删除或置换以便减弱或基本消除与sFlt-Ι的结合提供了便利。通常，有利的是知道结合蛋白质的二级、三级和四级结构、翻译后修饰(如磷酸 化、糖基化、硫酸化和泛素化)、三维晶体结构以及与之共同形成缔合复合物的蛋白质的三 维晶体结构。然而，该信息对于实践本发明是不需要的。虽然可进行与翻译后修饰相关的 基团修饰、删除或置换，但优选可相互识别和结合的蛋白质中的一种或多种的一个或多个 氨基酸的修饰、删除或置换。蛋白质位点特异性化学修饰为本领域所熟知(Techniques in Protein Modif ication, Lundblad RL, CRC Press，1995 (《蛋白质修饰技术》，Lundblad RL, CRC 出版社，1995 年)Chemical Reagents for Protein Modification, Lundblad, RL, CRCPress, 3rd Ed，2005 (《蛋白质修饰化学试剂(第三版)》，Lundblad，RL，CRC出版社，2005 年))。可用氨基酸化学/合成修饰实践本发明。优选的方法涉及基因工程技术。直接获 得蛋白质的氨基酸序列是本领域的标准作法。相似地，从编码蛋白质的基因的核苷酸序列 间接获得蛋白质的氨基酸序列是本领域的标准作法。可轻易地获得基因的核苷酸序列。并 且，当可获得该基因时，可进行定点诱变以删除、置换或修饰一个或多个氨基酸。可以随机 的方式或预定的方式进行。用定点诱变改变或突变的蛋白质可被克隆并易于得到。蛋白 质和基因工程的详细资料和方案易于从许多出版物和其中的引用文献中得到(Molecular Cloning,Sambrook Jand Russell Dff,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002( Vjf 子克隆》，Sambrook J 和 Russell Dff,Cold Spring Harbor Laboratory 出版社，2002 年)； Recombinant Gene Expression Protocols, Tuan RSed, Humana Press, 1997 (《重组基因 的表达方案》，Tuan RS 编辑，Humana 出版社，1997 年)^Methods in Molecular BioIory andProtein Chemistry, Spangler BD, John Wiley & Sons Ltd. 2002 (《分子生物学和蛋 白质化学方法》，Spangler BD, John Wiley &SonsLtd.，2002 年);Genetic EnRineerinR Fundamentals, Kammermeyer Kand Clark VL, Marcel Dekker Inc, 1989 (《基因工禾呈基本 原理》，Kammermeyer K 禾口 Clark VL, Marcel Dekker Inc, 1989 年)；Mayo etal, Nature ν 306，ρ 86-88，1983 (Mayo 等人，《自然》，第 306 卷第 86-88 页，1983 年)；Suggs et al,Proc Nat Acad Sci USA ν 78，ρ6613_6617 1981 (Suggs等人，《美国国家科学院院刊》，第78卷 第 6613-6617 页，1981 年)；Scott et al Nature ν 302，ρ 538-540，1983 (Scott 等人，《自 然》，第 302 卷第 538-540 页，1983 年)；Helfman et al, Proc Nat Acad Sci USA, ν 80，ρ 31-35，1983 (HeIfman等人，《美国国家科学院院刊》，第80卷第31-35页，1983年)；Young et al, Proc Nat Acad Sci USA, ν 80，ρ 1194-1198，1983 (Young 等人，《美国国家科学院 院刊》，第 80 卷第 1194-1198 页，1983 年)；US 4, 237, 224 ；US 4, 273, 875 ；US 4, 293, 652 ； US4, 870，009)。可检测改变的蛋白质来测定与它的伴侣蛋白质的相互识别和结合是否已减弱或 基本消除。可使用本领域熟知的实验方案进行该检测。也可用表位特异性受体/抗体来
12检测改变的蛋白质，以测定表位相比于未改变的或天然蛋白质是否充分地保持了原状。 可定量地或定性地鉴别亲和力。(Errico et al, J Biol Chem, ν 279，ρ 43929-43939， 2004 (Errico等人，《生物化学杂志》，第279卷第43929-43939页，2004年)；Piehler et al, J Immunol Methods, ν 201 (2)，ρ189_206，1997 (Piehler 等人，《免疫学方法杂志》， 第 201 卷第 2 期第 Ι89-2。6 页，1"7 年)；Casasnovas et al, ν 270, ρ 13216-13224, 1995 (Casasnovas 等人，第 270 卷第 13216-13224 页，1995 年)；Boone etal, J Virol, ν 11， P 515-519，1973 (Boone等人，《病毒学杂志》，第11卷第515-519页，1973年)；美国专利 7，081，346 ；US7, 081，346 ；US 5，324，633 ；US 4，340，668 ；US 2005/0175999)。无论基团(氨基酸和/或非氨基酸)的性质如何改变，或蛋白质性质如何改变(基 团的修饰(直接化学修饰氧化、还原等)、删除或置换)，无论参与相互识别和结合的蛋白 质中的一个或每一个被改变，两个重要的功能特征是1)改变的蛋白质与未改变的伴侣蛋 白质的相互识别和结合的特性、或当每一个已被改变时伴侣蛋白质的结合使得相互识别和 结合被充分地减弱或基本消除，以及2)如果该特性如前所讨论为特定的应用所需的话，任 何改变的蛋白质中的一个或多个表位保持的结合特性与未改变的或天然蛋白质中的表位 充分地类似或基本相同。实例I人PlGF-I和变体、sFlt-Ι、涉及人PlGF的抗人PlGF-I抗体、与sFlt-Ι结合的PlGF 和变体的结合特性、ELISA分析测定PlGF和其他材料以及实验方案在Errico et al,J Biol Chem, ν 279，ρ 43929-43939，2004 (Errico 等人，《生物化学杂志》，279 卷第 43929-43939 页，2004年)中描述，并在本文中部分再现。关于本文没有明确说明的细胞培养、质粒、细胞 系的选择和其他材料以及实验方案，可查阅Errico等人的参考文献获取详细内容。材料如Errico等人所述，抗人PlGF单克隆抗体和人Flt-I (Flt-1/Fc嵌合体)可得自 R&DSystems (Minneapolis,Minnesota USA)。羊抗小鼠 IgG-辣根过氧化物酶(HRP)可得自 Santa Cruz Biotechnology(SantaCruz, California USA ;www. scbt. com)。PlGF变体的构建Errico等人用PCR技术获得PlGF变体，该PCR技术使用称为pchPlGF-1的质粒作 为模板进行，并且PCR使用映射区域的互补引物进行，该区域对有待突变为丙氨酸的氨基 酸进行编码并且进行特定的核苷酸修饰。为了制备具有双重突变的PlGF变体，采用具有突 变两者的引物。将扩增的DNA纯化，并用来转化感受态细菌。用双脱氧核苷酸法对质粒进行 双向测序。以下PlGF-I单个残基突变为丙氨酸Asn-16、Pro-25、Gln-27、Cys-60、Asp-72、 Glu-73、Asn-74、Asn-84、Pro-98 和 Tyr-100。也产生 P1GF-1 的双重突变体Asp 72 突变为 Ala, Glu 73 突变为 Ala。含有改变的PlGF-I的校准物/对照物组合物通过将未改变的sFlt-Ι与改变的P1GF-1、尤其是双重突变体(其中丙氨酸置换序 列标识号1的第72位天冬氨酸以及序列标识号1的第73位谷氨酸)、或三重突变体(其中 还有另一个突变为甘氨酸置换第70位半胱氨酸)混合来制备含有改变的PlGF-I和sFlt-1 的校准物/对照物。这些组合物可以由干物形式的制剂或由工作储备水溶液单独混合而 成，其中工作储备水溶液是使用在所需PH的任何合适的缓冲液(例如磷酸盐(PBS)，pH7. 5)
13所制备，包含任何其他可用的或所需的附加物(例如抗氧化剂、防腐剂等)。为了进行示意 性的说明，改变的PlGF-I的浓度在0到约1000pg/mL的范围内，并且sFlt_l固定在IOOpg/ mL，但两者可以使用其他浓度范围。将未改变的sFlt-Ι与双重突变体或三重突变体的改变 PlGF 混合于 PBS (10g NaCl.O. 25g KCl、1.8g Na2HP04、0. 3g KH2PO4,pH7. 5)中以产生以下参
照物、校准物或对照物组
ELISA 法检测 PlGF用检测PIGF的ELISA法确定取自孕妇血清样品中的PlGF的量。用含有上述改变 的PlGF-I和sFlt-Ι的溶液组校准ELISA (以下详细描述)。观察到的该组的每一个PIGF-I 水平的信号与改变的PlGF-I的浓度相关。该关联可以图形形式表示或用适当的统计学和 数学校准方法相联系。将在使用血清样品的ELISA分析中所观察到的信号与校准图形作比 较，以确定样品中PIGF的浓度或用建立的数学联系转化为浓度单位。按如下操作进行ELISA 为了测定样品中的PIGF，用1 μ g/ml抗人P1GF-1单克 隆抗体的PBS溶液涂布96孔板，每孔100 μ 1，并在4°C下孵育过夜。用含0. 05 %的TWEEN 20 (PBT)的PBS清洗孔一次，通过每孔加入280 μ 1的1 %牛血清白蛋白的PBS溶液并在室 温(RT)下孵育3小时来封闭非特异性结合位点。将孔脱气并保持在冷态下直至使用。检 测期间，每一个校准物水平或血清样品取100 μ 1，并用PBET (含有0. 牛血清白蛋白、5mM EDTA、0. 05%的Tween 20)适当稀释，然后在37°C下孵育1小时。用PBT清洗孔五次，并加 入另一种用PBET稀释到37ng/ml的抗人PlGF-I单克隆抗体(此抗体为HRP共轭的)，并在 37°C下孵育1小时。用PBT清洗孔五次，加入100μ 1由lmg/ml的邻苯二胺(溶于50mM柠 檬酸磷酸盐缓冲液，PH5)和0. 006% H2O2组成的HRP底物，并在室温暗处孵育30分钟。每 孔加入25 μ 1的4当量H2SO4终止反应，用微板读数器在490nm处测定信号吸光度。改变的PIGF-I和未改变的PlGF与sFlt_l结合的比较Errico等人描述了测定改变的PIGF-I和未改变的/天然PlGF-I与Flt-I结合的 实验。基本上，96 孔板用 0. 5 μ g/ml 的可溶性人 Flt-I (Flt-l/Fc chimera)的 PBS (ρΗ7· 5) 溶液涂布，每孔100 μ 1，并在室温下孵育过夜。用PBT清洗板五次，在用上述的牛血清白蛋 白溶液封闭孔的非特异性位点后，通过向孔中加入改变的PlGF-I或未改变的/天然PlGF 以使结合反应进行，在37°C下孵育1小时并在室温下孵育1小时。如上所述用PBT清洗孔并用生物素酰化的抗人PlGF-I多克隆抗体孵育(300ng/ml，溶于PBET中)，在37°C下孵育 1小时并在室温下孵育1小时。如上所述用ELISA分析法进行检测，比较用改变的PIGF-I 和未改变的/天然PlGF-I获得的信号。Errico等人获得的结果在图IA和图IB中得到再 现。实例II比较重组 PlGF(DE)和 PlGF(AA)实验目的:就以下两种情况评估两种重组PIGF蛋白质(1)它们与人PIGF特异性单克隆抗 体的结合活性；以及(2)它们与sFlt的结合活性，即配体受体复合物的形成。材料和试剂(1)重组 PlGF 使用两种形式的纯化的重组P1GF。该蛋白质由21个不属于PIGF的氨基酸前导序列组成。前导序列含有“6XHis” 标签和4-氨基酸Xa识别和裂解位点。前导序列序列标识号2 :MRGSHHHHHHGSGSGSGIEGRPlGF (DE)中的PlGF部分序列氨基酸序列对应野生型PIGF的序列标识号1中第 4-132位氨基酸，从而导致以下的DE氨基酸序列序列标识号3:AVPPQQffALS AGNGSSEVEV VPFQEVffGRS YCRALERLVD VVSEYPSEVEHMFSPSCVSL LRCTGCCGDE NLHCVPVETA NVTMQLLKIR SGDRPSYVELTFSQHVRCEC RPLREKMKPE RC⑶AVPRRPlGF (AA)中的PIGF部分序列氨基酸序列对应野生型PIGF的序列标识号1中第 4-132位氨基酸，具有在序列标识号1的第72和73位氨基酸处制备的两个突变，从而导致 以下AA氨基酸序列序列标识号4:AVPPQQffALS AGNGSSEVEV VPFQEVffGRS YCRALERLVD VVSEYPSEVEHMFSPSCVSL LRCTGCCGAA NLHCVPVETA NVTMQLLKIR SGDRPSYVELTFSQHVRCEC RPLREKMKPE RC⑶AVPRR(2)重组 sFlt 得自 Scios Inc. (Mountain View, California USA ；www. sciosinc. com)(批号 9225-89)的全长sFlt，由687个可溶性fms样酪氨酸激酶1 (sFlt_l)的氨基酸组成。sFlt-Ι 序列序列标识号5:MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSKLKDPELSLKGTQHIMQAGQTLHLQCRGEAAHKWSLPEMVSK ESERLSITKSACGRNGKQFCSTLTLNTAQANHTGFYSCKYLAVPTSKKKETESAIYIFISDTGRPFVEMYSEIPEII HMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTH RQTNTIIDVQISTPRPVKLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKRASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDK MQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDKAFITVKHRKQQVLETVAGKRSYRLSMKVKAFPSPEVVWLKDGLPAT EKSARYLTRGYSLIIKDVTEEDAGNYTILLSIKQSNVFKNLTATLIVNVKPQIYEKAVSSFPDPALYPLGSRQILTCTAYGIPQPTIKWFWHPCNHNHSEARCDFCSNNEESFILDADS匪GNRIESITQRMAIIEGKNKMASTLVVADSRISG IYICIASNKVGTVGRNISFYITDVPNGFHVNLEKMPTEGEDLKLSCTVNKFLYRDVTWILLRTVNNRTMHYSISKQK MAITKEHSITLNLTIMNVSLQDSGTYACRARNVYTGEEILQKKEITIRGEHCNKKAVFSRISKFKSTRNDCTTQSNV KH (3)人sFlt-Ι和人PlGF的单克降抗体
0134]单克隆抗体名称来源目录号批号克隆号0135]RD-I小鼠抗sFltRDSysCGG07605B495600136]RD-2小鼠抗sFltRDSysBYC01605A495430137]Rat-I大鼠抗PlGFRDSys不适用11039253589030138]Rat-2大鼠抗PlGFRDSys不适用11039333589390139]Rat-3大鼠抗PlGFRDSys不适用11039313589320140]Rat-4大鼠抗PlGFRDSys不适用11039263589050141]Rat-5大鼠抗PlGFRDSys不适用11039273589070142]MS-I小鼠抗PlGFRDSysMAB264不适用37203实验实例(I)ELISA 分析 1 用0. 5 μ g/mL的重组PlGF (DE)或PlGF (AA)涂布高结合微孔板并用BSA/PBS封 闭·标准的ELISA步骤由以下组成将单克隆抗体稀释于酪蛋白/PBS中；将HRP标 记的驴抗小鼠IgG或驴抗大鼠IgG以1 3K稀释于酪蛋白/PBS中；每孔加入100μ L样品 或缀合物体积；每一个步骤在37°C /30分钟/振摇条件下孵育；清洗板6次，100 μ L的OPD 底物在25°C下显色30分钟；加入25 μ L的终止溶液；记录492nm处的OD值。·分析1的ELISA结果在表1中示出。表1抗PIGF单克隆抗体与重组PIGF (未改变的和改变的)的识别 ·结论所有检测的单克隆抗体对PlGF(DE)和PlGF(AA)两者均做出反应，指示出 D72/E73A突变没有影响单克隆抗体的结合并且这些抗体表位的位点不在这两个突变位点 处。(2) ELISA 分析 2 用0. 5 μ g/mL的重组PlGF(DE)或PlGF(AA)涂布高结合微孔板并用BSA/PBS封 闭·标准ELISA步骤由以下组成第一板使用以不同的浓度稀释于酪蛋白/PBS的 sFlt孵育；第二板使用含有RD-I和RD-2两种单克隆抗体(每一种的浓度为0. 1 μ g/mL)的抗sFlt混合溶液孵育；第三板使用HRP标记的驴抗小鼠IgG(以1 4K稀释于酪蛋白/ PBS中)孵育；以及第四板使用100 μ L的OPD底物孵育，使OPD底物在25°C下显色30分 钟。第一、第二和第三板孵育步骤为37°C下振摇15-20分钟；每一个步骤之间清洗板6次。 第4次孵育后加入25 μ L的终止液并记录492nm处的OD值。·分析2的ELISA结果在表2中示出。表2sFlt ^nm PIGF( Bt夺的和未夺的)的结合 ·益论=SFlt与涂布的PlGF(DE)形成受体配体复合物。然而，使用PlGF(AA)突 变体时，这种复合物的形成极大地减少，指示出序列标识号1的第72和73位氨基酸对于 sFlt-1结合和复合物的形成是十分重要的。(3) Biacore 分析.sFlt 经 NHS/EDC 与 RU = 6738 偶联固定于 Biacore 芯片 FC-2 上。FC-1 为空白， 作为阴性对照。·将PlGF(DE)或PlGF(AA)注入FC-1和FC-2来评估复合物的形成· Biacore结果在表3中示出。表3 sFlt :P1GF 复合物的 Biacore 测定
CM5芯片重组人 PlGF 20 μ g/mLPlGF (DE)PlGF (AA)FCl: Bicore (RU) t2· FC2空白 sFlt11 15612 30-FCl14518· M^ 注入的PlGF(DE)结合于固定的sFlt，从而形成受体配体复合物，而注入 的PlGF(AA)与固定的sFlt的结合较弱。实例III野生型重组PlGF和两个额外的PlGF突变体之间的比较实验目的:构建三种额外的重组PlGF蛋白质，并进行评价以用于⑴它们与人PIGF特异性 单克隆抗体的结合活性；以及(2)它们与sFlt的结合活性，即配体受体复合物的形成。材料和试剂(1)按照如下方式构建三种额外的重组PlGF蛋白质-P 126 (DE)重组PlGF野生型序列标识号6 MRGSAVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSP
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SCVSLLRCTGCCGDENLHCVPVETANVTMQLLKIRS⑶RPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERCGDAVGPGQIVGGVYLL前四个氨基酸残基为无关氨基酸(MRGS)；最后的十个氨基酸为IOG表位(C端标 签)；位于IOG表位前面的两个氨基酸也是无关氨基酸(Gly-Pro)；在无关氨基酸(即在 MRGS之后开始和在GP之前)之间的126位氨基酸序列是与序列标识号1的第4至129位 氨基酸相同的PlGF序列。-P 126 (AA) =PlGF突变体1 序列标识号7 MRGSAVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCCGMNLHCVPVETANVTMQLLKIRS ⑶ RPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERCGDAVGPGQIVGGVYLL与P126(DE)类似，不同的是带下划线的氨基酸(AA)是两个突变的氨基酸-P 126 (GAA) =PlGF 突变体 2 序列标识号 8 MRGSAVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCGGMNLHCVPVETANVTMQLLKIRS ⑶ RPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERCGDAVGPGQIVGGVYLL与PlGF突变体1 P126(AA)类似，不同的是在AA前二位的氨基酸的另外突变是由 C突变为G所有三种重组蛋白质都在细菌中表达并都形成不溶性包涵体。超声波降解后，用 4M尿素的PBS溶液和2M尿素的PBS溶液洗涤，包涵体最终溶解于8M尿素/15mM还原谷胱 甘肽(GSH)/50mM Tris-HCL(pH7. 8)中。PlGF蛋白质通过以下三个步骤的透析进行再折 叠(1)在透析缓冲液中透析24小时，该透析缓冲液包含3M尿素/50mM TRIS (pH7. 5) /2mM EDTA/0. 2M精氨酸/2mM GSH ； (2)在透析缓冲液中透析24小时，该透析缓冲液包含2M尿素 /50mM TRIS (pH7. 5)/2mM EDTA/0. 2M 精氨酸/1. 2mM GSH/0. 4mM 氧化谷胱甘肽(GSSG)；以 及(3)在透析缓冲液中透析24小时，该透析缓冲液包含0. 8M尿素/20mM TRIS (pH7. 5) /2mM EDTA/0. 2M精氨酸/0. 48mM GSH/0. 16mMGSSG。通过将透析的蛋白质溶液装载到亲和柱中来 进一步纯化再折叠的PIGF，通过交联IOG标签特异性单克隆抗体和CNBr活化的S印harose 4Fast Flow(琼脂糖凝胶4FF)树脂(GE目录号17-0981-01)而制备。然后用40%的乙腈 洗提结合的PIGF。最后在缓冲液交换为PBS后得到纯化的PIGF蛋白质。(2)抗人PIGF单克隆抗体、抗人sFlt单克隆抗体可得自R&D Systems (Minneapolis, Minnesota USA) ；HRP 标记的驴抗大鼠 IgG (目录号 712-035-150) 可得自 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (WestGrove, Pennsylvania, USA)； ELISA 板为得自 Corning Life Sciences 的 Costar hind binding (目录号 2592)；电泳凝 胶 NuPAGE 4-12%、PVDF 转移膜和 SeeBlue ladder 得自 Invitrogen (Carlsbad CA, USA)； 阻滞剂酪蛋白/PBS和SuperSignal West Dura蛋白质印迹底物购自Pierce (Rockford，IL， USA)。CNBr活化的S印harose 4 Fast Flow (琼脂糖凝胶4FF)树脂(目录号17-0981-01) 和银染试剂盒(目录号 17-1150-01)得自 GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)实验实例(1)重组PlGF 图2示出了通过银染和蛋白质印迹方法检测的三种PIGF重组蛋白 质的纯度。 ·高结合微孔板用0. 5 μ g/mL的重组P126 (DE)或P126 (AA)或P126 (GAA)涂布并 用BSA/PBS封闭·标准的ELISA步骤由以下组成将单克隆抗体稀释于酪蛋白/PBS中；将HRP标 记的驴抗小鼠IgG或驴抗大鼠IgG以1 3K稀释于酪蛋白/PBS中；每孔加入100μ L样品 或缀合物体积；每一个步骤在37°C /30分钟/振摇条件下孵育；清洗板6次，100 μ L的OPD 底物在25°C下显色30分钟；加入25 μ L的终止溶液；记录492nm处的OD值。· ELISA结果在表4中示出。
表4抗PIGF单克隆抗体与重组PIGF (未改变的和改变的)的识别
涂布的重组
PlGF (0. 5 μ g/mL)
对涂布的PIGF的抗体结合活性(OD)
Pl26(DE) P126(AA) Pl 26 (GAA)
Ing/mL 的抗体
抗PIGF单克隆抗体名称、克隆号和浓度(ng/mL)
Ms-IRatiRat2Rat4372033589033589393589051. 0231. 3681. 4971. 6340. 9671. 3011. 6331. 6811. 1341. 2261. 5301. 591
10ng/mL 的抗体
Rat3Rat53589323589070. 7790. 8340. 6810. 6970. 8060. 799·结论所有检测的单克隆抗体都对P126 (DE)、P126 (AA)和P126 (GAA)做出反应， 指示出D72A/E73A的双重突变和C70G/D72A/E73A的三重突变没有影响单克隆抗体结合并 且这些抗体表位的位点不在这些突变位点处。(3) ELISA 分析 2 ·高结合微孔板用0. 5 μ g/mL的重组P126 (DE), P126 (AA)和P126 (GAA)涂布并用 BSA/PBS 封闭·标准ELISA步骤由以下组成第一板使用以不同的浓度稀释于酪蛋白/PBS的 sFlt孵育；第二板使用含有RD-I和RD-2的两种单克隆抗体(每一种的浓度为0. 1 μ g/mL) 的抗sFlt混合溶液孵育；第三板使用HRP标记的驴抗小鼠IgG(以1 4K稀释于酪蛋白/ PBS中)孵育；以及第四板使用100 μ L的OPD底物孵育，使OPD底物在25°C下显色30分 钟。第一、第二和第三板孵育步骤为37°C下振摇15-20分钟；每一个步骤之间清洗板6次。 第4次孵育后加入25 μ L的终止液并记录492nm处的OD值。
ELISA结果在表5中示出。
表5sFlt与重组PIGF (改变的和未改变的)的结合涂布的重组PlGFsFlt与涂布的PIGF形成复合物(0. 5 μ g/mL)孵育时sFl t的浪度(ng/mL)180060020066. 67BSA (对照)0. 0090. 0080. 0050. 003Pl26 (DE)>31. 8330. 8330. 347P126(AA)0. 2100. 1820. 1150. 143Pl26 (GAA)0. 1500. 1010. 0950. 088*用小鼠抗sFU和HRP标记的抗小鼠缀合物检测结合的sFU: PIGF复合物
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·结论sFlt与涂布的P126 (DE)形成受体配体复合物。然而，使用P126 (AA)突 变体和P126(GAA)突变体时，这种复合物的形成极大地减少，指示出序列标识号1的第70、 72和73位氨基酸对于sFlt-Ι结合和复合物的形成是十分重要的。(4) ELISA 分析 3 用0. 5 μ g/mL的重组sFlt涂布高结合微孔板并用BSA/PBS封闭·标准ELISA步骤由以下组成第一板使用以不同的浓度稀释于酪蛋白/PBS的 P126 (DE)或 P126 (AA)或 P126 (GAA)孵育；第二板使用 0. 1 μ g/mL 的抗 PIGF Rat-4 单克隆 抗体溶液孵育；第三板使用HRP标记的驴抗大鼠IgG(以1 4K稀释于酪蛋白/PBS中)孵 育；以及第四板使用100 μ L OPD底物孵育，使OPD底物在25°C下显色30分钟。第一、 第二和第三板孵育步骤为37°C下振摇15-20分钟；每一个步骤之间清洗板6次。第4次孵 育后加入25 μ L的终止液并记录492nm处的OD值。· ELISA结果在表6中示出。
结论未改变的P1GF、P126(DE)与涂布的sFlt形成配体受体复合物。然而，改 变的PlGF (P126 (AA)和P126(GAA))未能形成此类复合物，指示出序列标识号1的第70、72 和73位氨基酸对于sFlt结合和复合物的形成是十分重要的。本发明具体实施例的描述出于示例性的目的。本发明并非意图进行穷举性的说明 或将本发明的范围限制为本文所述的具体形式。本领域的普通技术人员将理解，如权利要 求书中所述，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可进行各种修改。本文引用的所有专利、专利申请和出版物据此以引用方式并入。
权利要求
一种用于分析第一蛋白质或第二蛋白质或第一蛋白质和第二蛋白质两者的参照物、校准物或对照物组合物，其中所述第一蛋白质或所述第二蛋白质或所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的一个或更多个氨基酸或一个或更多个非氨基酸基团已被删除、修饰或被不同的氨基酸或非氨基酸基团置换，从而减弱或基本消除了所述第一蛋白质和所述第二蛋白质的相互结合。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一蛋白质为受体酪氨酸激酶并且所述第 二蛋白质为血管内皮生长因子。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述血管内皮生长因子为P1GF。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述血管内皮生长因子为P1GF-1。
5.根据权利要求2所述的组合物，其中所述受体酪氨酸激酶为sFlt-1。
6.根据权利要求2所述的组合物，其中所述受体酪氨酸激酶为sFlt-1并且所述血管内 皮生长因子为P1GF。
7.根据权利要求2所述的组合物，其中所述受体酪氨酸激酶为sFlt-Ι并且所述血管内 皮生长因子为PlGF-I。
8.根据权利要求4或权利要求7所述的组合物，其中所述PlGF-I包含取代以下物质的丙氨酸a)序列标识号1的第25位脯氨酸，或b)序列标识号1的第27位谷氨酰胺，或c)序列标识号1的第60位半胱氨酸，或d)序列标识号1的第72位天冬氨酸，或e)序列标识号1的第73位谷氨酸，或f)序列标识号1的第84位天冬酰胺，或g)序列标识号1的第98位脯氨酸，或h)序列标识号1的第100位酪氨酸，或改变的PlGF-I具有取代序列标识号1的第70 位半胱氨酸的甘氨酸、或在a)到h)中所述丙氨酸置换和所述甘氨酸置换的任何组合。
9.根据权利要求4或权利要求7所述的组合物，其中所述PlGF-I包含取代序列标识号 1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代序列标识号1的第73位谷氨酸的丙氨酸。
10.根据权利要求4或权利要求7所述的组合物，其中所述PlGF-I包含取代序列标识 号1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、取代序列标识号1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代 序列标识号1的第73位谷氨酸的丙氨酸。
11.一种用于对样品中受体酪氨酸激酶或血管内皮生长因子的检测进行校准的方法， 所述方法包括以下步骤1)将权利要求2中所述的包含已知量的所述受体酪氨酸激酶和所述血管内皮生长因 子的组合物与受体酪氨酸激酶的特异性受体或血管内皮生长因子的特异性受体接触；以 及，2)将第1)步骤中形成的复合物与受体酪氨酸激酶的特异性标记受体和内皮生长因子 的特异性标记受体接触；以及，3)将结合的受体酪氨酸激酶的特异性标记受体与游离的受体酪氨酸激酶的特异性标 记受体分离，或将结合的内皮生长因子的特异性标记受体与游离的内皮生长因子的特异性标记受体分离；以及，4)检测来自与所述组合物的受体酪氨酸激酶复合的结合的受体酪氨酸激酶的特异性 标记受体的信号、或来自游离的受体酪氨酸激酶的特异性标记受体的信号；或者，5)检测来自与所述组合物的内皮生长因子复合的结合的内皮生长因子的特异性标记 受体的信号、或来自游离的内皮生长因子的特异性标记受体的信号；以及，6)将来自游离的或结合的受体酪氨酸激酶的特异性标记受体的信号、或来自游离的或 结合的内皮生长因子的特异性标记受体的信号与所述组合物中已知量的受体酪氨酸激酶 或内皮生长因子相关。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述内皮生长因子为胎盘生长因子。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述血管内皮生长因子为胎盘生长因子-1。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述受体酪氨酸激酶为sFlt-1。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述受体酪氨酸激酶为sFlt-Ι并且所述血管内 皮生长因子为胎盘生长因子。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述受体酪氨酸激酶为sFlt-Ι并且所述血管内 皮生长因子为胎盘生长因子-1。
17.根据权利要求13或权利要求16所述的方法，其中所述胎盘生长因子-1包含取代 以下物质的丙氨酸a)序列标识号1的第25位脯氨酸，或b)序列标识号1的第27位谷氨酰胺，或c)序列标识号1的第60位半胱氨酸，或d)序列标识号1的第72位天冬氨酸，或e)序列标识号1的第73位谷氨酸，或f)序列标识号1的第84位天冬酰胺，或g)序列标识号1的第98位脯氨酸，或h)序列标识号1的第100位酪氨酸，或改变的PlGF-I具有取代序列标识号1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、或在a)到h)中 所述丙氨酸置换和所述甘氨酸置换的任何组合。
18.根据权利要求13或权利要求16所述的方法，其中所述PlGF-I包含取代序列标识 号1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代序列标识号1的第73位谷氨酸的丙氨酸。
19.根据权利要求13或权利要求16所述的方法，其中所述PlGF-I包含取代序列标识 号1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、取代序列标识号1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代 序列标识号1的第73位谷氨酸的丙氨酸。
20.一种用于确认样品中蛋白质的存在或测定样品中蛋白质含量的方法，包括以下步骤a)将所述蛋白质特异性的固定的受体与所述样品接触，从而形成第一复合物，所述第 一复合物包含固定的受体和所述样品的蛋白质；b)将所述第一复合物与所述蛋白质特异性标记受体接触，从而形成第二复合物，所述 第二复合物包含受体、所述样品的蛋白质和标记受体；c)将在所述第二复合物中结合的标记受体与游离的标记受体分离；d)测定来自在所述第二复合物中结合的标记受体的信号或来自游离的标记受体的信号；e)将所述蛋白质特异性的固定的受体与权利要求1中所述的蛋白质的组合物接触，其 中所述组合物中的所述蛋白质含量为已知的，从而形成第三复合物，所述第三复合物包含 固定的受体和所述组合物的蛋白质；f)将所述第三复合物与所述蛋白质特异性标记受体接触，从而形成受体、所述组合物 的蛋白质和标记受体的第四复合物；g)将在所述第四复合物中结合的标记受体与游离的标记受体分离；h)测定来自在所述第四复合物中结合的标记受体的信号或来自游离的标记受体的信 号；和i)比较d)和h)中测定的所述信号，进而确认所述样品中的所述蛋白质存在或测定所 述样品中的所述蛋白质含量。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述蛋白质为血管内皮生长因子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述血管内皮生长因子为P1GF。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述血管内皮生长因子为P1GF-1。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述蛋白质为血管内皮生长因子并且所述组合 物包含受体酪氨酸激酶和所述血管内皮生长因子。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述血管内皮生长因子为PlGF并且所述组合物 包含受体酪氨酸激酶和P1GF。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述血管内皮生长因子为PlGF-I并且所述组合 物包含受体酪氨酸激酶和PlGF-I。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述受体酪氨酸激酶为sFlt-1。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述组合物中的所述PlGF-I包含取代以下物质 的丙氨酸a)序列标识号1的第25位脯氨酸，或b)序列标识号1的第27位谷氨酰胺，或c)序列标识号1的第60位半胱氨酸，或d)序列标识号1的第72位天冬氨酸，或e)序列标识号1的第73位谷氨酸，或f)序列标识号1的第84位天冬酰胺，或g)序列标识号1的第98位脯氨酸，或h)序列标识号1的第100位酪氨酸，或改变的PlGF-I具有取代序列标识号1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、或在a)到h)中 所述丙氨酸置换和所述甘氨酸置换的任何组合。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述PlGF-I包含取代序列标识号1的第72位 天冬氨酸的丙氨酸和取代序列标识号1的第73位谷氨酸的丙氨酸。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述PlGF-I包含取代序列标识号1的第70位 半胱氨酸的甘氨酸、取代序列标识号1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代序列标识号1的 第73位谷氨酸的丙氨酸。
31.一种对样品中蛋白质的检测进行校准的方法，包括以下步骤1)将权利要求1中所述的包含已知量的所述蛋白质的组合物与所述蛋白质特异性的 受体接触；2)将第1)步骤中形成的复合物与所述蛋白质特异性标记受体接触；3)将结合的标记受体与游离的标记受体分离；4)检测来自结合的标记受体的信号或来自游离的标记受体的信号；和5)将来自游离的或结合的标记受体的信号与所述组合物中所述已知量的所述蛋白质 相关。
32.—种对样品中蛋白质的检测进行校准的方法，包括以下步骤1)将权利要求1中所述的含有已知量的所述蛋白质的组合物与所述蛋白质特异性 固定的受体接触，从而形成复合物，所述复合物包含固定的受体和所述组合物的所述蛋白 质；2)将第1)步骤中形成的所述复合物与所述蛋白质特异性标记受体接触，从而形成复 合物，所述复合物包含固定的受体、所述组合物的蛋白质和标记受体；3)将结合的标记受体与游离的标记受体分离；4)检测来自结合的标记受体的信号或来自游离的标记受体的信号；和5)将来自游离的或结合的标记受体的所述信号与所述组合物中所述已知量的所述蛋 白质相关。
全文摘要
本发明公开了组合物和方法，该组合物和方法包括两种或更多种蛋白质，其中蛋白质中的至少一种已被改变以减弱其相互识别和结合。此类组合物在方法和分析中可用作参照物、校准物或对照物，该方法和分析用于测定可能存在于所关注的样品中的蛋白质中的一种或多种的量、或确认该样品中的该蛋白质中的一种或多种的存在。更具体地讲，本发明涉及组合物和方法，该组合物和方法包括改变的胎盘生长因子-1(P1GF-1)和可溶性fms样酪氨酸激酶(sFlt-1)，以及用于测定所关注的样品中的sFlt-1和/或P1GF-1的量或确认所关注的样品中的sFlt-1和/或P1GF-1的存在的方法。
文档编号G01N33/53GK101918834SQ200980101750
公开日2010年12月15日 申请日期2009年1月7日 优先权日2008年1月7日
发明者G·巴什里安斯, J·W·贝库斯, J·郑 申请人:奥索临床诊断有限公司