用于肾癌诊断或检测的组合物及方法

专利名称：用于肾癌诊断或检测的组合物及方法
技术领域：
本发明涉及一种对肾癌的诊断和检测有用的组合物。本发明还涉及一种使用该组合物检测肾癌的方法。
背景技术：
肾脏是重要的泌尿器官，具有过滤血液生成尿从而将生物体内的废弃物排到体外 的作用。另外，同时也是重要的内分泌器官，可产生控制血压的血管紧张素、作为红细胞造 血因子的促红细胞生成素等激素。肾脏中发生的肿瘤有发生在成人中的肾细胞癌和发生在儿童中的Wilms’肿瘤、 为稀少肿瘤的肉瘤，以下将发生率最高的恶性肿瘤即肾细胞癌称为肾癌。肾癌的发生率为 每10万人中有约2.5人，男女比例为2 3 1，男性具有多发倾向。在泌尿系统的恶性肿 瘤中，是继前列腺癌、膀胱癌之后发生率最高的肿瘤。作为肾癌的危险因素，已知有遗传学因素，但一般可以举出吸烟、脂肪摄取量等。 另外，已知长期接受透析的患者中该肿瘤的发生率高。肾癌患者在肿瘤最大直径为5cm以下时，几乎没有任何自觉症状，多在检诊时通 过CT扫描等被发现。尺寸大的肿瘤，可见血尿、腹部肿痛、疼痛等症状。另外，作为全身症 状，有时引起发热、体重减少、贫血等，偶尔因内分泌因子引起红细胞增多症或高血压、高钙 血症等。另一方面，有时因肾癌扩散至后腔静脉内，引起腹部体表的静脉曲张或睾丸静脉 瘤。大约20%的肾癌在肺或骨转移后被发现。肾癌在静脉中具有较强的肿瘤扩散倾向，易 向其它脏器转移。作为肾癌的检查法，有超声波检查、CT检查、血管造影检查等方法，由于特异性生 化学标记物尚属未知，故必须利用机器进行检查。另外，肾癌还可以按病理学分成几类，已知其中占90%的透明细胞型肾癌的发生 原因在于作为癌抑制基因的VHUvon-Hippel-Lindau)基因的缺陷(非专利文献1)。已知 VHL基因缺陷通过阻断HIF- α /VHF聚集，导致低氧诱导基因组转录活化(非专利文献2)， 引起VEGF、TGFi3等基因表达增强。肾癌治疗主要采用外科疗法。无论病期如何，在能够切除时将肾脏全部或部分切 除为最常用的方法，即使发生转移，也可考虑采用外科方法将肾脏切除。作为外科疗法之外 的方法，有肾动脉的动脉栓塞术，该方法在不能进行肾脏切除时或在切除较大肿瘤时于手 术前实施。肾癌在较早期被发现的时候，预后比较好，初期癌的治疗中90%以上治愈。但是， 5cm以上的较大肿瘤或发生转移的肿瘤的治疗效果差(全部肾细胞癌患者的5年生存率约 50-60% )，人们已经认识到早期发现的重要性。对发现早期的小尺寸肾癌，图像诊断技术是有效的方法，但是例如在健康检查等 以众多受试者作为对象的情况下，效率不是很好，而且诊断所需的费用比较高。因此，强烈 期望开发对肾癌具有特异性并且灵敏性高的血中标记物。一般认为通过利用血中标记物可以比较便宜地进行高通量筛选的检查以及诊断。专利文献1中 公开了利用基因表达的差异检测或诊断人肾癌的方法。另外，作为 已知在人肾癌中增加的蛋白质，有通过分解细胞外基质使癌细胞的运动性增加的MMP2(非 专利文献3)、已知在肾功能障碍中表达增加的TNFRSF7 (非专利文献4)，除此之外，还有 PDE8B (专利文献2)、FLOTl (专利文献3)、⑶5 (非专利文献5)、ECMl (专利文献4)等，然 而，相对而言其特异性并不高，仅通过其表达量获得的高灵敏性的肾癌检查方法尚未用于 临床。专利文献1 国际公开第2005/024603号说明书专利文献2 国际公开第2004/042077号说明书专利文献3 国际公开第2004/048933号说明书专利文献4 美国专利第6303765号说明书非专利文献1 Latif, F.等，Science, 1993 年，第 260 卷，p. 1317-1320非专利文献2 =Maxwell, P.等，Nature, 1999 年，第 399 卷，p. 271-275非专利文献3:Lein，M.等，International Journal of Cancer，2000年，第 85卷， p.801-804非专利文献 4 :Nakatsuji，Τ· Clinical and Experimental Medicine，2003 年，第 2 卷，p. 192-196非专利文献5 =Nagase, Y.等，日本泌尿器科学会杂志，1991年，第82卷， p.1781-1789

发明内容
然而，上述现有的标记物以及候补标记物缺乏特异性及/或灵敏性、或尚未确立 从生物试样中有效地检测方法，所以一般情况下不用于临床，人们迫切期望开发出特异性 及灵敏性更高的肾癌标记物。本发明的目的在于提供一种对肾癌诊断有用的组合物，以及利用该组合物检测肾 癌的方法。作为标记物的寻找方法，可以举出下述方法，S卩，通过某种手段对肾癌细胞与非癌 细胞中基因表述或蛋白质表达、或细胞代谢产物等的量方法进行比较的方法；或对肾癌患 者或非癌患者的体液中所含的基因、蛋白质、代谢产物等的量进行测定的方法。为了解决上述课题，本发明人等此次发现了一种蛋白质标记物组，对于肾癌患者 及健康人的血浆，只在肾癌患者血浆中能够被特异性地检测到或者只在健康人血浆中能够 被特异性地检测到。本发明具有以下特征。(1) 一种体外检测肾癌的方法，所述方法包括测定来自受试者的生物试样中的序 列号1 7表示的多肽或其片段中的任一个或多个。(2)如上述⑴所述的方法，其中，所述片段为多肽片段，所述多肽片段在序列号 1 7中的任一个表示的多肽的氨基酸序列中分别含有序列号8 16中的任一个表示的氨 基酸序列。(3)如上述⑴或⑵所述的方法，其中，测定所述多肽或其片段的量或测定所述多肽或其片段是否存在。(4)如上述⑴ ⑶中任一项所述的方法，其中，以所述多肽或其片段的量与所 述多肽或其片段在对照试样中的量相比显著地增大或显著地减小作为指标。(5)如上述(1) (4)中任一项所述的方法，其中，所述多肽或其片段采用免疫学 方法测定(6)如上述⑴ (5)中任一项所述的方法，其中，所述测定使用与所述多肽或其 片段可结合的物质进行。(7)如上述(6)所述的方法，其中，所述可结合的物质为抗体或其片段。(8)如上述(7)所述的方法，其中，所述抗体被标记。(9)如上述⑴ ⑶中任一项所述的方法，包括使用与所述多肽或其片段特异性 结合的抗体或其片段，采用免疫学方法测定所述样品中的该多肽或其片段中的一个或多个 的量或测定所述多肽或其片段是否存在，以该多肽或其片段的量与所述多肽或其片段在对 照试样中的量相比增大或减少作为指标，或以该多肽或其片段只存在于所述样品或对照试 样中的任一方作为指标，来检测肾癌。(10)如上述⑴ (9)中任一项所述的方法，其中，所述试样为血液、血浆、血清或尿。(11)如上述⑴ (9)中任一项所述的方法，其中，所述试样来自于肾的组织或细 胞。(12)如上述(7) (9)中任一所述的方法，其中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆 抗体。(13) 一种用于肾癌的诊断或检测的组合物，含有与序列号1 7表示的多肽或其 片段中的至少一个特异性结合的抗体或其片段或所述抗体或其片段的化学修饰衍生物中 的一个或多个。(14)如上述(13)所述的组合物，其中，所述多肽片段为在以序列号1 7中的任 一个表示的多肽的氨基酸序列中分别含有序列号8 16中的任一个表示的氨基酸序列的 多肽片段。(15)如上述(13)或(14)所述的组合物，其中，所述多肽片段含有由至少7个氨基 酸构成的表位。(16)如上述(13) (15)中任一项所述的组合物，其中，所述组合物为试剂盒的形式。(17)上述(13) (16)中任一项所述的组合物在受试者的肾癌体外检测中的应用。本说明书中使用的用语具有以下定义。本说明书中“化学修饰衍生物”，是指通过酶、荧光团、放射性同位素等标记产生的 标记化衍生物，或含有乙酰化、糖基化、磷酸化、硫酸化等化学修饰的衍生物。本说明书中，所谓“用于诊断或检测的组合物”，是指为了诊断或检测是否罹患肾 癌、罹患程度、或有无改善或改善的程度，或者为了筛选对肾癌的预防、改善或治疗有用的 候选物质，可以直接或间接使用的物质。本说明书中，作为检测或诊断对象的“生物试样”，是指由生物体采集的试样，所述试样含有或被怀疑含有随着肾癌的发生表达量增加或减少的靶多肽。在本说明书中，“特异性结合”是指抗体或其片段只与本发明中作为肾癌标记物的靶多肽、其变异体或其片段形成抗原_抗体复合物，而与其他肽性或多肽性物质实质上不 形成该复合体。此处，“实质上”是指虽然程度小，但能引起非特异性复合物的形成。在本说明书中，“表位”是指在本发明的靶多肽、其变异体或其片段中，具有抗原性 或免疫原性的部分氨基酸领域(即，抗原决定簇)。表位通常由至少5个氨基酸、优选至少 7个氨基酸或至少8个氨基酸、更优选至少10个氨基酸构成。本发明中的肾癌标记物，能出现在肾癌患者的血液等生物试样中但在健康人中几 乎或完全没有，或者相反地只出现在健康人的生物试样中但在肾癌患者中几乎或完全没 有，因此具有下述特别的作用效果，即，只需以该标记物的存在或量为指标，例如利用血液 即可容易地检测肾癌。


[图1]表示本发明中序列号8表示的多肽的MS峰强度。[图2]表示本发明中序列号9 12表示的多肽的MS峰强度。[图3]表示本发明中序列号13 16表示的多肽的MS峰强度。[图4]表示4名肾癌患者在切除手术前后血浆中的ARHGAP25肽的浓度。
具体实施例方式以下更加具体地说明本发明。<肾癌标记物>使用本发明的用于肾癌诊断或检测的组合物，用于体外检测肾癌的肾癌标记物为 序列号1 7表示的多肽或其片段。将本发明的序列号1 7的多肽、其基因名(GenBank登录名)及蛋白质序号 (Swissprot登录序号)及其特性一同表示在下述表1中。上述多肽中，序列号1表示的多 肽能够在肾癌患者血浆中特异性地被检测到，在健康者的血浆中检测不出或与肾癌患者血 浆相比检测量显著地减少。另外，序列号2 7表示的多肽能够在健康者血浆中特异地被检 测到，在肾癌患者的血浆中检测不出或与健康人血浆相比检测量显著地减少。需要说明的 是，所述多肽及/或基因(cDNA)的氨基酸序列或核苷酸(或者碱基)序列，通过访问NCBI、 GenBank, Swissprot等数据库可以得到。[表 1]i列号 基因名 蛋白质序号特性
1 ARHGAP25 P42331Rho GTPase - activating protein 25_
~ 2ZYXQl5942 — Zyxin (Zyxin - 2)
_Vasodilator - stimulated phosphoprotein
“3_______(VASP)_
4__RBP4__P02753Plasma retinol - binding protein_
5SERP INF2 P08697Alpha - 2 - antiplasmin
cA TT广nc。c Rho GDP - dissociation inhibitor 2 (Rho GDI
6ARHGDIB P52566 ，、T, 、，T _、 ____2) (Rho - GDI beta) (Ly - GDI)_
—7NUCBlQ02818 | Niicleobindin - 1另外，本发明的上述多肽片段，含有该多肽的氨基酸序列的至少7个、至少8个、至 少10个、至少15个，优选至少20个、至少25个、更优选至少30个、至少40个、至少50个、 至少100个、至少200个的连续氨基酸残基，持有一个或多个表位。所述片段能够免疫特异 性地与本发明的抗体或其片段结合。假设所述多肽存在于例如血液中时，在存在于血液中 的蛋白酶或肽酶等酶的作用下被切断而形成片段，以片段形式存在。另外，如下述实施例1所示，在本发明中序列号8表示的多肽与健康者相比在肾癌 患者的生物试样中以特别高的水平被检测出。另外，相反地，序列号9 16表示的多肽与 肾癌患者相比在健康者的生物试样中以特别高的水平被检测出。上述多肽为序列号1、2、 5 7表示的多肽的片段，因此，上述序列号8 16表示的多肽以及内部具有该多肽的片 段，较优选用作肾癌标记物。下述表2中，一并给出了序列号8 16的多肽相当于序列号 1、2、5 7表示的多肽的哪个部分。另外，序列号14、15的氨基酸序列在序列号6的氨基酸序列中连续地出现。因此， 将序列号14、15的氨基酸序列连结的序列、即从序列号6的第5个丙氨酸到第30个赖氨酸 为止的序列表示的多肽，以及内部具有该多肽的片段，也较优选用作肾癌标记物。[表 2]
序列号序列号1 7表示的多肽中的部位 ~~8从序列号1的第1个蛋氨酸至第15个精氨酸
~9从序列号2的第36个缬氨酸至第54个精氨酸
~ θ从序列号2的第185个丝氨酸至第201个赖氨酸~
"Tl从序列号2的第254个甘氨酸至第265个赖氨酸~
~T2从序列号2的第344个丝氨酸至第354个赖氨酸~
~Τ3从序列号5的第476个亮氨酸至第491个赖氨酸~
~14从序列号6的第5个丙氨酸至第21个赖氨酸"15从序列号6的第22个亮氨酸至第30个赖氨酸
" θ从序列号7的第452个亮氨酸至第461个亮氨酸~
本发明中，用于肾癌检测的上述靶多肽均被赋予下述特征在肾癌患者中，血液等 生物试样中的该多肽水平，与健康人相比在罹患肾癌的受试者中显著地或特别地高或低。本发明中的多肽，可以根据例如作为本领域中常规技术的固相合成等化学合成法 或DNA重组技术制备。从流程或纯化简便方面考虑，优选使用DNA重组技术。首先，使用DNA自动合成装置化学合成编码本发明多肽的部分序列的多核苷酸序 列。该合成一般使用亚磷酰胺法，利用该方法能够自动合成至多约100个碱基的单链DNA。 DNA自动合成装置可以从例如Polygen公司和ABI公司等购买。使用所得的多核苷酸作为探针或引物，根据公知的cDNA克隆法制备cDNA克隆，具 体而言可以从表达作为靶标的上述基因的肾组织等生物组织中提取总RNA，将该总RNA用 寡聚dT纤维素柱处理得到聚A (+) RNA,通过RT-PCR法由该聚A (+) RNA制备cDNA文库，通过 杂交筛选、表达筛选、抗体筛选等进行筛选，从该cDNA文库得到目标cDNA克隆。可以根据 需要，利用PCR法扩增cDNA克隆。由此能够得到与目标基因对应的cDNA。可以基于序列号1 7表示的多肽序列从15 100个连续碱基序列中选择并合成 探针或引物。另外，例如在Sambrook，J.及Russel，D.著，Molecular Cloning,A LABORATORY MANUAL, Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001 年 1 月 15 日发行的第 1 卷 7. 42 7. 45，第2卷8. 9 8. 17中记载了 cDNA克隆技术。然后，将如上所述得到的cDNA克隆整合到表达载体中，通过培养由该载体转化或 转染的原核或真核宿主细胞，从该细胞或培养上清液中得到目标多肽。此时，在编码目标成 熟多肽的DNA的5’末端，侧翼分布编码分泌信号序列的核苷酸序列，由此能够向细胞外分 泌成熟多肽。载体以及表达系统可以从Novagen公司、宝酒造、第一化学药品、Qiagen公司、 Stratagene 公司、Promega 公司、Roche Diagnositics 公司、Invitrogen 公司、Genetics Institute公司、Amersham Bioscience公司等获得。作为宿主细胞，能够使用细菌等原核 细胞(例如大肠杆菌、枯草杆菌)、酵母(例如酿酒酵母)、昆虫细胞(例如Sf细胞)、哺乳 动物细胞(例如COS、CH0、BHK、NIH3T3等)等。载体中除含有编码该多肽的DNA外，还可 以含有调节元件，例如启动子(例如Iac启动子、trp启动子、P^启动子、？1；启动子、SV40病 毒启动子、3-磷酸甘油酸激酶启动子、糖酵解酶启动子等)、增强子、多腺苷酸化信号、核糖 体结合部位、复制起点、终止子、选择标记物(例如氨苄青霉素耐药基因、四环素耐药基因 等的药剂耐药基因；LEU2、URA3等营养缺陷型标记物等)等。另外，为了容易进行多肽的纯化，可以以在多肽的C末端或N末端结合了标记肽的 融合多肽的形式生成表达产物。代表的标记肽中，可以举出6 10个残基的组氨酸重复序 列(His标签)、FLAG、myc肽、GST多肽、GFP多肽等，但标记肽不限定于此。在不结合标记肽的状态下生产本发明的多肽时，可以利用其物理或化学性质，根 据本领域技术人员公知的方法纯化、分离该多肽。作为所述纯化方法，例如可以举出离子交 换色谱法、凝胶过滤色谱法、正相色谱法、反相色谱法、疏水作用色谱法、等电点色谱法、高 效液相色谱法(HPLC)、电泳、硫酸铵分级分离、盐析、盐溶、超滤、透析等方法中的一个或多个方法的组合。另一方面，在该多肽上结合组氨酸重复序列、FLAG、myc, GST、GFP之类的标 记肽时，可以举出适合通常使用的各种标记肽的亲和色谱法。此时，可以构建易于分离、纯 化的表达载体。特别是构建能以多肽和标记肽的融合多肽的形式进行表达的表达载体，利 用基因工程技术制备该多肽时，也可容易地进行分离及纯化本发明中所述多肽中还包含其变异体。所谓“变异体”，是在序列号1 7表示的 氨基酸序列或其部分序列中，缺失、置换、添加或者插入1个以上、优选1个或数个氨基酸的 变异体，或者与该氨基酸序列或其部分序列具有约80%以上、约85%以上、优选约90%以 上、更优选约95%以上、约97%以上、约98%以上、约99%以上的同源性百分比的变异体。 上述变异体中例如包括不同于人的哺乳动物种的同源物、以同种哺乳动物(例如人种)间 的多态性变异为基础的变异体等天然变异体。此处，“数个”是指10、9、8、7、6、5、4、3或2的整数。另外，“同源性百分比”可以通过采用例如BLAST或FASTA等蛋白质或核酸的同 源检索系统，导入空位或不导入空位而进行确定(Karlin，S.等，1993年，Proceedings of the National Academic Sciences U. S. A.,第 90 卷，p. 5873-5877 ；Altschul, S. F.等， 1990 年，Journal of Molecular Biology，第 215 卷，P. 403-410 ;Pearson，W. R.等，1988 年， Proceedings of the National Academic Sciences U. S. A.,第 85 卷，p. 2444-2448 ；高木 利久·金久实编，基因组网络的数据库使用方法(第2版)1998年，共立出版社，东京，日 本)。<用于肾癌诊断或检测的组合物>本发明提供一种用于肾癌的诊断或检测的组合物，含有与序列号1 7表示的多 肽或其片段特异性结合的抗体或其片段或所述抗体或其片段的化学修饰衍生物中的一个 或多个。另外，较优选本发明中用于肾癌诊断或检测的组合物含有可与下述多肽片段特异 性结合的抗体或其片段或所述抗体或其片段的化学修饰衍生物中的一个或多个，所述多肽 片段为序列号1 7表示的多肽的片段且分别含有序列号8 16中的任一个表示的氨基 酸序列。识别作为肾癌标记物的多肽的抗体，能够通过抗体的抗原结合部位与该多肽特异 性结合。本发明可以使用的抗体可以如下制备使用含有序列号1 7的氨基酸序列的多 肽或其片段或其融合多肽作为一个或多个免疫原，采用惯用的技术进行制备。作为免疫原 使用的所述多肽、片段、变异体或融合多肽，在序列号1 7表示的各多肽的氨基酸序列中， 含有至少7个、至少8个、至少10个、至少15个、优选至少20个、至少25个、至少30个、至 少40个、至少50个、至少100个、至少200个的连续氨基酸残基，或含有序列号1 7表示 的各多肽全长。另外，更优选为分别含有序列号8 16中任一个表示的氨基酸序列的多肽 片段。上述多肽、或其片段、变异体或融合多肽，含有促使抗体形成的表位，该表位可以 为直链的表位，或者也可以为不连续的表位(高级结构)。需要说明的是，该表位可以通过 该技术领域已知的所有表位解析法，例如噬菌体展示(Phage display)法、反向免疫遗传学 技术等鉴定。作为本发明的抗体，可以举出抗血清、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、人类抗体等，但不限于此。本发明中可以 使用的抗体还包含任何类型、纲、亚纲。上述抗体中，包含例如IgG、 IgE、IgM、IgD、IgA、IgY、IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAU IgA2 等。另外，通过本发明的多肽可以诱导所有形式的抗体。如果分离该多肽的全部或一 部分或表位，那么多克隆抗体及单克隆抗体均可采用常规技术制备。例如包括如下方法 Kennet等(主编)，Monoclonal Antibodies,Hybridomas :A New Dimension in Biological Analyses, Ple num Press, New York, 1980 中列举的方法。多克隆抗体可以通过用本发明的多肽免疫禽类(例如鸡等)、哺乳动物(例如家 兔、山羊、马、绵羊、小鼠等)等动物进行制备。可以适当组合硫酸铵分级分离、离子交换色 谱法、亲和色谱等方法，从被免疫动物的血液中纯化目标抗体。单克隆抗体可以通过包括利用常规技术在小鼠中生产杂交瘤细胞株的方法得到， 所述杂交瘤细胞株产生对各多肽特异的单克隆抗体。用于生产上述杂交瘤细胞株的一种方 法如下所述用本发明的多肽免疫动物，从被免疫的动物中采集脾细胞，将该脾细胞与骨髓 瘤细胞株融合，由此制备杂交瘤细胞，然后鉴定生产与该多肽结合的单克隆抗体的杂交瘤 细胞株。单克隆抗体可以通过常规技术回收。以下详细地说明单克隆及多克隆抗体的制备。A.单克隆抗体的制备(1)免疫及抗体产生细胞的采集对哺乳动物例如大鼠、小鼠(例如近交系小鼠Balb/c)、兔子等给予按上述方法得 到的免疫原。免疫原1次的给药量可以根据免疫动物的种类、给药途径等适当确定，每1只 动物给药约50 200 μ g。主要通过在皮下、腹腔内注射免疫原进行免疫。另外，免疫的间 隔没有特殊的限定，初次免疫后，间隔数日至数周，优选间隔1 4周，进行2 10次，优选 3 4次加强免疫。初次免疫后，利用ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)法等 反复测定免疫动物血清中的抗体值，当抗体值达到平台时，向静脉内或腹腔内注射免疫原， 进行最终免疫。然后，从最终免疫日起2 5日后，优选3日后，采集抗体产生细胞。作为抗 体产生细胞，可以举出脾细胞、淋巴结细胞、外周血细胞等，优选脾细胞或局部淋巴结细胞。(2)细胞融合制备产生对各蛋白质特异的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤可以通过常规 技术生产并鉴定。用于生产该杂交瘤细胞株的方法之一是用本发明的多肽免疫动物，从被 免疫的动物中采集脾细胞，使脾细胞与骨髓瘤细胞株融合，由此生成杂交瘤细胞，鉴定产生 与该酶结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。作为能与抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞株， 可以使用通常能购买到的小鼠等动物的细胞株。作为使用的细胞株，优选具有下述性质的 细胞株，即具有药剂选择性，并具有在未融合状态下在HAT选择培养基(含有次黄嘌呤、氨 基蝶呤、胸腺嘧啶)中不能存活，只有在与抗体产生细胞融合的状态下才能存活的性质。另 夕卜，细胞株优选来自与免疫动物同种系的动物的细胞。作为骨髓瘤细胞株的具体例，可以举 出来自于BALB/c小鼠的次黄嘌呤·鸟嘌呤·磷酸核糖基·转移酶(HGPRT)缺陷细胞株的 P3X63-Ag. 8 株(ATCC TIB9)等。接着，使上述骨髓瘤细胞株与抗体产生细胞进行细胞融合。细胞融合如下进行在 不含血清的DMEM、RPMI-1640培养基等动物细胞培养用培养基中，以约1 1 20 1的比例混合抗体生成细胞与骨髓瘤细胞株，在细胞融合促进剂的存在下进行融合反应。作为 细胞融合促进剂，可以使用浓度约为10 80%、平均分子量1500 4000道尔顿的聚乙二 醇等。另外，视情况的不同，为了提高融合效率，可以同时使用二甲基亚砜等辅助剂。还可 以使用利用电刺激(例如电穿孔)的市售的细胞融合装置使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞株融合。
(3)杂交瘤的筛选及克隆从细胞融合处理后的细胞中筛选目标杂交瘤。作为筛选方法，使用例如含有胎牛 血清的RPMI-1640培养基等适当稀释细胞悬浮液后，以约200万个细胞/孔接种到微孔板 上，向各孔中加入选择培养基，并在以后适当更换选择培养基，进行培养。培养温度为20 400C，优选为约37°C。骨髓瘤细胞是HGPRT缺陷株或胸腺嘧啶激酶缺陷株时，可以通过使用 含有次黄嘌呤·氨基蝶呤·胸腺嘧啶核苷的选择培养基(HAT培养基)，仅选择性培养、增 殖具有抗体产生能力的细胞与骨髓瘤细胞株的杂交瘤。结果在用选择培养基开始培养开始 后，生长约14天左右的细胞可以作为杂交瘤被得到。接着，对进行了增殖的杂交瘤的培养上清液中是否存在目标抗体进行筛选。杂交 瘤的筛选可以按照常规的方法，没有特别限定。例如，采集作为杂交瘤培养的包含在孔中的 培养上清液的一部分，通过酶免疫测定法(EIA =Enzyme Immuno Assay、及ELISA)、放射性免 疫测定法(RIA =Radio Immuno Assay)等进行筛选。融合细胞的克隆通过极限稀释法进行， 从而最终确立产生单克隆抗体的细胞即杂交瘤。杂交瘤在RPMI-1640、DMEM等基本培养基 中的培养稳定，并能产生、分泌与本发明的多肽性癌标记物特异性反应的单克隆抗体。(4)抗体的回收单克隆抗体可以利用常规技术进行回收。即，作为从确立的杂交瘤中采集单克隆 抗体的方法，可以采用通常的细胞培养法或腹水形成法等。采用细胞培养法时，在通常的培 养条件(例如37°C、5% CO2浓度)下，在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基、MEM培 养基或无血清培养基等动物细胞培养基中培养杂交瘤2 10日，从该培养上清液中获得抗 体。采用腹水形成法的情况下，向与提供骨髓瘤细胞的哺乳动物同种系的动物的腹腔内给 予约1000万个杂交瘤，使杂交瘤大量地增殖。并在1 2周后采集腹水或血清。对于上述抗体的采集方法，在需要纯化抗体的情况下，可以通过适当选择硫酸铵 盐析法、离子交换色谱法、亲和色谱法、凝胶过滤色谱等公知的方法，或组合使用上述方法， 得到纯化的本发明的单克隆抗体。B.多克隆抗体的制备制备多克隆抗体时，与上述相同地免疫动物，从最终的免疫日起6 60天后，利用 酶免疫测定法(EIA及ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)等测定抗体值，在显示最大抗体值 当天采血，得到抗血清。然后，利用ELISA法等测定抗血清中的多克隆抗体的反应性。另外，本发明中，也可以使用上述抗体的抗原结合片段。利用常规技术可以产生的 抗原结合片段的例子包含Fab及Fab，、F(ab，)2、Fv, scFv、dsFv等的片段，但不限定于此。 也包含利用基因工程技术产生的抗体片段及衍生物。该抗体中，包含例如合成抗体、重组抗 体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、单链抗体等。本发明的抗体在体外及体内均可以用于测定本发明中用于检测多肽或其(多)肽 片段的存在。为了能够在测定中特异性地检测出，优选使用单克隆抗体，但即使是多克隆抗体，也可以通过所谓的吸收法得到特异性抗体，所述吸收法包括将抗体结合在结合有纯化 多肽的亲和色谱柱上。 因此，本发明的组合物至少含有一种可与序列号1 7的多肽、其变异体或其片段 特异性结合的抗体或其片段，优选含有多种、更优选含有全部种类的上述抗体或其片段。另 夕卜，更理想的情况为本发明的组合物至少含有一种可与下述多肽片段特异性结合的抗体 或其片段，所述多肽片段为序列号1 7表示的多肽的片段、分别含有序列号8 16中的 任一个表示的氨基酸序列，优选含有多种、更优选含有全部种类的上述抗体或其片段。本发明的组合物中，上述与各多肽特异性结合的抗体或其片段，可以分别单独地、 或适当混合以混合物的形式装入单独容器(例如安瓿)中进行包装。抗体或其片段可以与 固相载体结合或者也可以以游离的形式存在，与固相载体结合时可以将抗体或其片段附着 或结合在固相载体上，所述固相载体例如为由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、 聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、聚偏1，1-二氟 乙烯、乳胶、琼脂糖、纤维素、琼脂糖凝胶、玻璃、金属、陶瓷、磁性体等材料形成的多孔板、微 珠、试管、棒、试验片等形状。以游离形式存在时，为冻干固体等固体或溶液等液体。根据需要也可以将标记物例如荧光团、酶、放射性同位素等结合在本发明使用的 抗体或其片段上，或者也可以将所述标记物结合在二抗上。荧光团包括例如荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、单磺酰氯及其衍生物、伞 形酮。酶包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、葡 糖氧化酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶等。放射性同位素包括例如碘(1311、1251、1231、1211)、磷(32P)、硫(35S)、金属类(例如 m54Mru9H133Xe 等)、氚等。其它的标记物包括例如NADH-、FMNH2-、吖啶鐺酯、氨基苯二酰胼等发光材料，荧光 素酶、荧光素等生物发光物质等。另外，根据需要可以利用抗生物素-生物素系统或链霉抗生物素-生物素系统，此 时，例如生物素也可以与本发明的抗体或其片段结合。本发明的组合物也可以采取试剂盒的形式。用于检测肾癌标记物的上述抗体类可 以单独包装，或者适当混合，装入单个的容器(例如安瓿等)中进行包装。并且，如上所述 上述抗体可以与固相载体结合或者也可以以游离的形式存在。本发明的试剂盒可以含有标 记二抗、载体、洗涤缓冲液、试样稀释液、酶底物、反应停止液、作为纯化的标准物质的标记 物多肽、使用说明书等。〈肾癌的检测〉依据本发明，通过下述方法检测肾癌，所述方法包括针对来自受试者的生物试样 中的序列号1 7表示的多肽或其片段，优选针对其中的一种或多种，使用与上述肾癌标记 物可结合的物质，测量所述多肽或其片段的量或检测所述多肽或其片段是否存在。依据本 发明的方法，为下述情况时能够诊断受试者已罹患肾癌受试者生物试样中检测出序列号 1表示的多肽、其变异体或其片段，或判定所述多肽、其变异体或其片段的表达量显著高于 对照的情况；或者未检测出序列号2 7表示的多肽、其变异体或其片段，或判定所述多肽、 其变异体或其片段的表达量显著低于对照的情况。
另外，较优选通过下述方法检测肾癌，所述方法包括测定下述多肽片段中的任一 个或多个的量或检测其是否存在，所述多肽片段为序列号1 7表示的多肽的片段、分别含 有序列号8 16中的任一个表示的氨基酸序列。依据本发明的方法，为下述情况时能够诊 断受试者已罹患肾癌在受试者生物试样中检测出含有序列号8表示的氨基酸序列的多肽 片段，或判定所述多肽、其变异体或其片段的表达量显著高于对照的情况；或者未检测出含 有序列号9 16表示的氨基酸序列的多肽片段，或判定所述多肽、其变异体或其片段的表 达量显著低于对照的情况。本发明的方法中，上述肾癌标记物的检测可以针对单一标记物， 但优选针对多个 标记物，例如采用2个以上、3个以上、4个以上或5个以上至14、15或16个以下的标记物 进行。这是因此，针对多个标记物进行检测能够避免检测到预料之外的非特异性复合体，换 言之即能够避免误诊。另外，本发明中的肾癌标记物也可以与本领域技术人员已知的其他 癌的诊断标记物组合使用。本发明的组合物用于肾癌的诊断、判定或检测，即针对诊断是否罹患或罹患的程 度是有用的。在肾癌的诊断中与正常组织(或细胞)、非癌组织(或细胞)、正常体液等对 照进行比较，检测受试者生物试样中的上述肾癌标记物的存在或量，如果其存在或量的差 别显著，则怀疑受试者罹患肾癌。作为本发明方法中采用的检体试样，例如为肾组织、其周边组织、肾细胞、或体液 例如血液、血清、血浆、肾液、尿等。受试者的生物组织可以通过活体解剖等采集，或者采用 手术得到。本发明中受试者为包括人在内的哺乳动物，优选人。与上述肾癌标记物可结合的物质，例如包括上述抗体或其片段、适配体、 AfTibody (AfTibody公司商标)、各肾癌标记物的受体、各肾癌标记物的特异作用抑制物 质，各肾癌标记物的特异作用活化物质等，优选抗体或其片段、或所述抗体或其片段的化学 修饰衍生物。在本发明的实施方案中，测定可以包括下述步骤使根据需要用常用的酶或荧光 团进行了标记的抗体或片段，与组织切片或经勻浆的组织或体液接触的工序；定性或定量 地测定抗原-抗体复合物的工序。检测可以根据下述方法进行例如采用免疫电镜测定靶 多肽的存在及水平的方法；通过酶抗体法(例如ELISA)、荧光抗体法、放射性免疫测定法、 均质法、非均质法、固相法、夹心法等常用方法测定靶多肽的存在或水平的方法等。此外，在 本发明中为了更容易地检测本发明的抗体与试样中的靶多肽的反应，可以通过标记本发明 的抗体直接检测该反应，或通过采用标记二抗间接地检测。对于本发明的检测方法，考虑到 灵敏度，优选利用后者即间接地检测。根据上述肾癌标记物的种类为下述情况时可以确定为肾癌在从受试者得到的体 液或肾癌组织或细胞中，优选在血液中，靶多肽存在或消失的情况，或者与对照比较靶多肽 的水平显著地增大或减小的情况。此处，所谓“显著地”表示统计学中有显著性差异，这种 情况下显著性水平低于0. 05。作为替代免疫学方法的测定方法，包括采用质谱法的方法。具体而言可以采用实 施例中记载的方法进行。即，将生物试样例如血清或血浆用过滤器过滤除去杂质，用缓冲液 (例如PH约8)稀释，调节浓度在约10mg/ml 约15mg/ml范围内，之后使其通过可除去分子量5万以上的蛋白质的中空纤维过滤器(下述参考例(1))或离心平膜过滤器，进行分子 量截留，级分用蛋白酶(例如胰蛋白酶)处理进行肽化，产物通过质谱(利用基质辅助激光 解吸电离法或电喷雾法的类型)，基于来自目标多肽的特定峰值的质荷比和强度，可以测定 肾癌切除手术前的患者与健康人之间样品中多肽的存在量的差异。
实施例通过以下实施例更具体地说明本发明。但是，本发明的范围并不限定于这些实施 例。〈参考例〉
(1)中空纤维过滤器的制备将100根膜表面存在截留分子量约5万的孔径的聚砜中空纤维扎成一束，为了不 阻塞中空纤维的中空部分，用环氧类灌封剂将两末端固定在玻璃管上，制成微型模块。该微 型模块(模块A)用于除去血清或血浆中的高分子量蛋白质，其直径约为7mm，长约17cm。 同样地，用截留分子量约3千的孔径的膜，制作用于浓缩低分子量蛋白质的微型模块(模块 B)。在微型模块的一端有连接中空纤维内腔的入口，相对侧的一端为出口。中空纤维的入 口与出口是由硅胶管形成的封闭循环系统流路，液体被Peristal·泵驱动在所述流路内循 环。另外，中空纤维外侧所套的玻璃管具备将从中空纤维漏出的液体排出的端口，构成了一 个模块装置。采用“T”型连接器将模块连接到流路中，3个模块A与1个模块B串联连接作 为一个中空纤维过滤器。用蒸馏水清洗所述中空纤维过滤器清洗，填充PBS(含有0. 15mM NaCl的磷酸缓冲液，pH7. 4)水溶液。级分原料的血清或血浆从该中空纤维过滤器的流路入 口注入，分离及浓缩后从流路出口排出。注入该中空纤维过滤器的血清或血浆在每个模块A 中经过分子量约5万的分子筛，分子量低于5万的低分子量成分被模块B浓缩，进行制备。〈实施例1>(1)健康人及肾癌患者血浆的蛋白质鉴定在切除手术前及切除手术一个月后由7名50 70岁的肾癌患者获得EDTA血浆， 同时由年龄相似的8名健康人得到EDTA血浆，对各血浆进行测定。用孔径为0. 22 μ m的过 滤器过滤血浆，除去杂质物质，进行调整，使蛋白质浓度为50mg/mL。进一步将该血浆注入到 25mM碳酸氢铵溶液(pH8.0)中进行稀释，使浓度为12. 5mg/mL，用参考例(1)中所示的中空 纤维过滤器根据分子量进行分离。分离后的血浆样品(总量1.8mL，含有最多250yg的蛋 白质)用ProteomeLab (注册商标)PF2DSystem(Beckman Coulter公司)反相色谱分离成7 种级分，各级分冻干后，再溶解于IOOyL的25mM碳酸氢铵溶液中(pH8. 0)。将该样品用总 蛋白质1/50量的胰蛋白酶在37°C下消化2 3小时，进行肽化。再利用离子交换柱(KYA 技术，日本)将各分离的肽分离成4种级分。所述各级分用反相色谱柱(KYA技术，日本) 进一步分离，用在线连接的质谱Q-TOF UltimaWicromass公司)通过分析扫描模式对洗脱 的肽进行测定。本领域中通常在测定时使用标准物质对质荷比进行校正。而在本发明的解析中， 除进行上述校正之外，还进行再校正，即，将通常作为血液蛋白质肯定被检测的白蛋白、 α-血纤蛋白原等几个蛋白质作为内标，使用这些蛋白质的理论质量值，对测量数据进行 再校正，由此实现数据的更精密化。对如上所述进行了精密化的数据，用蛋白质分析软件MASCOT (Matrix Science公司，英国)分析数据。作为鉴定血液蛋白质的标准使用下述标 准，在尽可能排除错误蛋白质鉴定的条件下进行解析，所述标准为(i)在属于上述蛋白质 的肽中，以Mowse分数在34分以上的高可靠性检测到至少一根肽；(ii)肽的MS数据的测 定值及MS/MS数据的测定值，与肽的理论值之间的误差小于0. 03道尔顿。。
(2)在肾癌患者的癌切除手术前的血浆中，与健康人的血浆中相比被检测到的人 数增加或减少的蛋白质在健康人与癌患者之间比较此数据，在鉴定的蛋白质中，在3名以上肾癌患者的 癌切除手术前的血浆中被检测到而在健康人的血浆中完全未检出的蛋白质，作为与健康人 相比其在肾癌切除手术前患者的血浆中的表达显著增强的蛋白质被发现。上述蛋白质为下 表3所示的序列号1表示的多肽。另外，在被鉴定的蛋白质中，在健康人血浆中被检测到的 人数与在手术前肾癌患者血浆中被检测到的人数相比多3人以上的蛋白质，作为与健康人 相比其在肾癌切除前患者的血浆中的表达量显著减少的蛋白质被发现。上述蛋白质为下面 表3所示的序列号2 7表示的多肽。因此，表明上述序列号1 7表示的多肽作为肾癌 标记物在肾癌检测中是有用的。[表 3]
基因名各组的检测人数
^ ] 健康人 肾癌切除手术前的病人
~ 1 —ARHGAP2504
2 一 ZYX7 —1
~ 3VASP6 ~1
4 — RBP450
~ 5SERPINF2 ~ 50
~ 6ARHGDIB51
一 7NUCBl3:|0(3)在肾癌患者的癌切除手术前的血浆中，与健康人的血浆中相比MS峰强度增加 或减少的蛋白质进而，对属于上述(2)中被鉴定蛋白质的肽，解析其检测时的MS峰强度。该MS峰 强度不是严格地定量的指标，而是以某种程度反映蛋白质的存在量的数值，用MS峰强度能 够定量地比较分析，这是本领域技术人员所公知的。在健康人与癌患者之间，比较各肽检出 时的MS峰强度，在被检测到的肽中，发现下述肽在患者肾癌切除手术前的血浆中其存在量 显著增加，所述肽在肾癌患者的癌切除手术前血浆中的峰强度与健康人的相比显著增大、 且肾癌患者的癌切除手术前血浆中的峰强度与癌切除手术一个月后血浆中峰强度相比较 大。上述肽为序列号8表示的多肽，序列号1表示的多肽的片段。另外，同样地在被检测的 肽中，发现下述肽与健康人相比在肾癌切除手术前的患者的血浆中其存在量显著减少，所 述肽在肾癌患者的癌切除前血浆中的峰强度与健康人相比显著地减小、且肾癌患者的癌切 除手术前血浆中的峰强度与癌切除手术一个月后的血浆中的峰强度相比减小。上述肽为序 列号9 16表示的多肽，所述肽为序列号2、5 7表示的多肽中任一个的片段。因此，可 以判明上述序列号8 16表示的多肽及内部含有其片段，作为肾癌标记物在肾癌检测中是有用的。表4给出了上述序列号8 16表示的多肽片段的各个基因名、其是序列号1、2、 5 7表示的序列中的哪个部位的片段、肽链长度、氨基酸序列(单字母表示)。另外，将序 列号8 16表示的多肽片段在健康人、肾癌患者(术前)、肾癌患者(术后)中的MS峰强 度示于图1 3。各序列的肾癌患者及健康人的MS峰强度上的数字表示每人的编号[表 4]
序列号原始序列基因名全长<，，相肽序列(单字母表示)
8— 序列号 1 "XkHGAP25 —第 1 - 15 号- 15 _ MSLGQSACLFLSIAR
9序列号 2 _ ZYX _ 第36-54 号19 VNPFRPGDSEPPPAPGAQR —
10■序列号 2 “ ZYX “第 185 -201 号 17 SSTKPAAGGTAPLPPWK —
11""序列号 2 — ZYX -第 254-265 T 12 — GPPASSPAPAPK
12序列号 2 _ ZYX -第 344 -354 号 11 SPGAPGPLTLK~~
13■序列号 5 _ SERPINF2 ‘第 476 _ 491 号 16 LVPPMEEDYPQFGSPK —
14序列号 6 ARHGDIB 第 5-21 号17 APEPHVEEDDDDELDSK
15序列号 6 “ ARHGDIB “笫 22-30 号9 LNYKPPPQK—
16I 序列号 7 I NUCBl I 第 452 -461’号 I 10 LPEVEYPQHL—〈实施例2>(1)人 ARHGAP25 的制备本发明中的肾癌标记物之一为序列号1表示的人ARHGAP25多肽。另外，如实施 例1(3)及图1所示，在该人ARHGAP25多肽中，肾癌患者中更特征性地被检测到的部位为 序列号8表示的人ARHGAP25多肽的从第1氨基酸至第15氨基酸为止的序列(以下称为 ARHGAP25肽)。该ARHGAP25肽是委托Takara Bio公司(日本)通过化学合成得到的。另 夕卜，针对该ARHGAP25肽的家兔多克隆抗体的制备也同样委托Takara Bio公司得到。进而， 作为用于取得ARHGAP25肽检测用小鼠单克隆抗体的免疫原，制备序列号17表示的多肽 (以下称作ARHGAP25(l-97))作为来自大肠杆菌的重组蛋白质，所述序列号17表示的多肽 由序列号1表示的氨基酸序列中含有序列号8表示的氨基酸序列的第1氨基酸至第97氨 基酸的区域组成。ARHGAP25(l-97)的制备过程如下所述。首先，由HEK293 细胞制备人 ARHGAP25mRNA。使用 Qiashredder 及 RNeasy mini kit(Qiagen公司制)，按照附带的操作说明进行详细操作，由此制备mRNA。接着，用逆转录 酶Superscript〗〗 (invitrogen公司制)，以所得的总mRNA为模板合成cDNA，制备人cDNA 文库。逆转录反应按照该酶的附带的操作说明进行。接着，以所得的cDNA文库作为模板， 利用由序列号18及19表示的碱基序列构成的引物装置进行PCR。序列号18表示的碱基序 列含有ARHGAP25基因的一部分及其上游的BamHI识别序列。序列号19表示的碱基序列含 有ARHGAP25基因的一部分及其下游的EcoRI识别序列。利用上述引物使用PCR法进行基 因扩增时，得到编码ARHGAP25 (1-97)的DNA序列作为扩增DNA片段。PCR反应用KOD (东洋 纺公司制，日本)作为DNA聚合酶，按照KOD附带的操作说明进行制备，使其含有cDNA文库 IOng和各引物lOpmol。反应条件为在94°C的温度下加热一分钟后，在94°C下保持30秒、 在55°C下保持30秒、在72°C下保持1分钟，将上述循环重复30次后，最后在72°C下保温4 分钟。扩增的 DNA 片段利用 Quantum prepPCR Kleen Spin Columns (Bio-rad 公司制)纯 化。通过此反应得到全长约300bp的PCR产物。
将所得DNA片段用BamHI及EcoRI切断，同时采用BAP酶进行末端部的脱磷酸化处理，进而利用琼脂糖凝胶萃取法纯化。将所述DNA片段与事先用BamHI及EcoRI切断处 理所得的组氨酸标记融合型表达载体pET30b(NOVagen公司制)混合，进行连接反应。DNA 连接酶使用Ligation High(东洋纺公司制，日本)，反应按照附带的操作说明进行。接着， 用连接反应后的溶液，进行感受态细胞的转化。感受态细胞用大肠杆菌菌株DH5 α (Takara Bio Inc.公司制，日本)具体按照附带的操作说明进行。将转化处理后的菌体涂布在含有 ΙΟΟμ g/mL抗生素氨苄青霉素的LB平板上，在37°C下培养一夜。所得转化体在含有IOOy g/ mL氨苄青霉素的LB液体培养基中在37°C下培养一夜，通过小量制备(mini-pr印)得到目 标 pET30b_ARHGAP25 (1-97)。为了制备重组型ARHGAP25(l-97)，利用pET30b_ARHGAP25 (1_97)向大肠杆菌菌株 R0Setta-Gami2(N0Vagen公司制)转化。所得的转化体用含有氨苄青霉素及氯霉素的LB培 养基3L在37°C下培养3小时，添加终浓度ImM的IPTG在30°C下培养18小时，诱导目标组 氨酸标记融合型重组ARHGAP25 (1-97)表达后，用离心分离回收菌体。所得的菌体用PBS清洗后，用B-PER(PIERCE公司制)以沉淀的形成制备得到不溶 性级分。具体按照附带的操作说明进行。接着将不溶性级分用含有8M Urea的PBS增溶 后，用Ni-NTA agarose resin (QIAGEN公司制)吸附组氨酸标记融合型ARHGAP25。将吸附 了蛋白质的树脂用含有IOmM咪唑的PBS清洗后，用IM咪唑溶液洗脱。接着从所得的洗脱 级分中，进行蛋白质的重折叠。首先，在含有6M盐酸胍的PBS-T溶液中透析一夜后，在含有 0. 4M精氨酸、ImM DTT的PBS-T溶液中透析一夜，对所得的重折叠溶液进行丙烯酰胺凝胶电 泳，利用考马斯亮蓝染色确认ARHGAP25 (1-97)的纯化。(2)针对人ARHGAP25肽的小鼠单克隆抗体的制备将上述(1)中所得的100 μ L的2mg/mL人ARHGAP25 (1-97)溶液与100 μ L的 MPL+TDM Emulsion(Corixa公司制)混合，将其全部腹腔给与7周龄的BALB/c小鼠。2周 后及4周后给予相同量的同样配制的ARHGAP25(l-97)溶液。5周后从小鼠尾部静脉采血 100 μ L，静置一夜后，以5000 Xg离心5分钟回收上清液作为部分血清。用该血清评价针对 ARHGAP25肽的抗体值。对确认产生了针对ARHGAP25肽的抗体的小鼠，6周后腹腔给与与上述同样配制的 ARHGAP25 (1-97)溶液，3日后切除脾。切除的脾用注射器穿孔，注入RPMI1640培养基(GIBC0 公司制)挤压脾细胞，得到脾细胞液。所得脾细胞液在1200rpm下离心7分钟后除去上清 液，用RPMI1640培养基清洗。在RPMI1640培养基中再次混悬，计算细胞数，配制脾细胞数 1/10量的SP2/0骨髓瘤细胞液。将两细胞液混合，在2200rpm下离心10分钟，弃去上清液。 使用穿刺术使细胞松散，添加将PEG (ROCHE公司制)和HBSS (GIBC0公司制)以5 1的比 例混合的溶液ImL并搅拌。以后的操作中，除非另有说明使用的溶液和培养基均在37°C下 保温。向加入PEG与HBSS的细胞溶液中，经5分钟添加9mL RPMI1640培养基，慢慢 地混合后，在2200rpm下离心10分钟，除去上清液。所得沉淀细胞在添加了 15% FCS和 HAT (ROCHE公司制)的RPMI1640培养基中混悬，按照每孔注入200 μ L将其注入96孔细胞 培养板(Greiner公司制)中，在37°C、5% CO2的条件下培养一周。在添加HAT条件下生长的菌落被确定为由脾细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤，并且从中筛选产生针对ARHGAP25肽的抗体的杂交瘤。首先，向96孔肽吸附板(Nunc公司 制)的孔中加入lPg/mL的ARHGAP25肽50yL，固相化一夜。弃去孔中的蛋白溶液后，注 入200 μ L稀释4倍的BlockAce溶液(大日本住友制药公司制，日本)，在室温下静置1小 时。之后，用PBS-T清洗，作为ARHGAP25肽固相化板。将菌落生长的孔中的上清液稀释5 倍，将其中的ΙΟΟμ L添加到上述ARHGAP25肽固相化板的孔中，室温静置1小时。之后，弃去 孔中的溶液，用PBS-T清洗后，加入100 μ L HRP标记抗小鼠IgG溶液(Dako公司制)，进一 步在室温下静置1小时。弃去孔中的溶液，用PBS-T清洗后，加入IOOyL TMB溶液反应15 分钟。在450nm吸光度下确认到反应生成的显色，将显色孔作为阳性。将阳性孔的菌群混 悬在含有15% FCS和HT (invitrogen公司制)的RPMI培养基中，利用极限稀释法进行阳性 克隆的 克隆。将克隆结果所得的20种杂交瘤在SFM培养基中驯化，产生抗体。在60mL的 100% SFM培养基中以IX IO5细胞/mL接种杂交瘤，培养10日直到细胞死亡后，将培养液 在3000rpm下离心分离15分钟除去细胞。所得培养上清液用Mab Trap Kit (GEHEALTHCARE BIOSCIENCE公司制，日本)对含有的抗体进行纯化。另外，对20种各抗体用生物素化试剂 Sulfb-NHS-Biotin(PIERCE公司制)进行抗体的生物素化。生物素化按照试剂附带的操作 说明进行。(3)通过使用了所得抗体的夹心ELISA法检测肾癌患者血浆中的人ARHGAP25肽使用上述(2)中所得的纯化抗体及生物素标记的纯化抗体，利用夹心ELISA法进 行关于检测系统构建的研究。将未进行生物素化的纯化抗体用作捕捉用抗体，将经生物素 标记的纯化抗体用作检测用抗体，选定分别由捕捉用抗体、检测用抗体各一种组成的组合， 所述捕捉用抗体、检测用抗体可以最高灵敏地检测人ARHGAP25肽。将上述捕捉用抗体配制 成2yg/mL的PBS溶液后，加入96孔蛋白质吸附板(Nunc)中每孔50 μ L，固相化一夜，第 二天用含有BSA和10%蔗糖的PBS-T溶液在室温封闭2小时。接着，如实施例1及图 1所示，将明显检测到ARHGAP25肽的肾癌切除手术前的患者血浆4个检体与各患者的术后 血浆4个检体共8个检体的血浆，用1 % BSA-PBST稀释2倍，向抗体固相化板的各孔中分 别添加100 μ L各样品，室温反应2小时。反应后，弃去孔内的样品溶液用PBS-T清洗，在用 1 % BSA-PBST稀释的50 μ L 200ng/mL检测用抗体中室温反应1小时。清洗反应后的孔，将 100 μ L avidin-HRP溶液(R&D公司制)在室温反应30分钟。用PBS稀释avidin-HRP。用 PBS-T清洗后，加入100 μ L TMB溶液(PIERCE公司制)反应15分钟后，添加100 μ L IN硫 酸溶液使反应停止，测定450nm的吸光度。结果如图4表示，所有的肾癌患者中，切除手术 前血浆中的ARHGAP25肽浓度与切除手术后的值相比显示了更高的值。另外，4名肾癌患者 中有2名的血浆中切除手术前的ARHGAP25肽浓度与手术后的浓度相比显著地增高。因此， 可以判断实施例1中表示的ARHGAP25肽及含有它的ARHGAP25蛋白质作为判定是否罹患肾 癌的标记物是有用的。产业上的可利用性本发明提供一种特异性及感受性优异的、用于肾癌的诊断或检测的组合物，因此， 在医疗领域特别有用。本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请2008-008411号的说明 书及/或附图中公开的内容。另外，本说明书中引用的全部刊物、专利及专利申请都直接作 为参考引入本发明书中。
权利要求
一种体外检测肾癌的方法，所述方法包括测定来自受试者的生物试样中的序列号1～7表示的多肽或其片段中的任一个或多个。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述片段为多肽片段，所述多肽片段在以序列号 1 7中的任一个表示的多肽的氨基酸序列中分别含有序列号8 16中的任一个表示的氨 基酸序列。
3.如权利要求1所述的方法，其中，测定所述多肽或其片段的量或测定所述多肽或其 片段是否存在。
4.如权利要求3所述的方法，其中，以所述多肽或其片段的量与所述多肽或其片段在 对照试样中的量相比显著地增大或显著地减小作为指标。
5.如权利要求1所述的方法，其中，通过免疫学方法测定所述多肽或其片段。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述测定使用与所述多肽或其片段可结合的物质 进行。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述可结合的物质为抗体或其片段。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述抗体被标记。
9.如权利要求1所述的方法，其中，包括使用与所述多肽或其片段特异性结合的抗体 或其片段，采用免疫学方法测定所述试样中的所述多肽或其片段中的一个或多个的量或测 定所述多肽或其片段是否存在，将所述多肽或其片段的量与所述多肽或其片段在对照试样 中的量相比增大或减少作为指标、或以所述多肽或其片段只存在于所述试样或对照试样中 的任一方作为指标来检测肾癌。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述试样为血液、血浆、血清或尿、或者来自肾的 组织或细胞。
11.如权利要求7所述的方法，其中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
12.一种用于肾癌的诊断或检测的组合物，含有与序列号1 7表示的多肽或其片段中 的至少一个特异性结合的抗体或其片段或所述抗体或其片段的化学修饰衍生物中的一个 或多个。
13.如权利要求12所述的组合物，其中，所述多肽的片段为在序列号1 7中的任一个 表示的多肽的氨基酸序列中分别含有序列号8 16中的任一个表示的氨基酸序列的多肽 片段。
14.如权利要求12所述的组合物，其中，所述多肽的片段含有由至少7个氨基酸构成的 表位。
15.如权利要求12所述的组合物，所述组合物为试剂盒的形式。
16.权利要求12所述的组合物在受试者的肾癌体外检测中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种肾癌的检测方法以及用于诊断或检测肾癌的组合物，所述检测方法包括测定来自受试者的生物试样中的序列号1～7表示的多肽、其变异体或其片段中的任一个或多个。
文档编号G01N33/574GK101960309SQ200980108030
公开日2011年1月26日 申请日期2009年1月16日 优先权日2008年1月17日
发明者中村英二, 友田史绪里, 小川修, 小林道元, 田中祥德, 郑基晚 申请人:东丽株式会社