新的转移性人类肿瘤相关分子、检测激活的基因和蛋白的方法以及干扰基因表达的方法

文档序号:5863750阅读:999来源:国知局
专利名称:新的转移性人类肿瘤相关分子、检测激活的基因和蛋白的方法以及干扰基因表达的方法
技术领域
本发明大体上涉及癌症研究领域,更具体地,涉及鉴定新的与肿瘤发生和转移 相关的蛋白和基因。本发明涉及恶性的新型标志物。本发明还涉及基因治疗领域。
背景技术
在2005年,全世界58,000,000死亡人数中有7,600,000人死于癌症。据预测, 癌症死亡将持续增加,估计在2015年会有9,000,000人死于癌症,2030年会有11,400,000
人死于癌症(WHO数据)。癌症治疗可能包括手术、放疗、化疗、激素治疗或这些治疗 的一些组合,但是目前对于多数癌症患者而言,生存率是极低的。根据世界卫生组织, 如果发现得早且治疗充分的话,三分之一的癌症负担是可以治愈的。病理学研究提供了 建立多数实体瘤诊断的方法。虽然根据目前的病理学标准可以可靠地将很多病例进行分 类,但是存在重要的病例亚型,其中即使在病理学专家中也未能达到一致意见。诊断上 的含糊对于患者具有严重的有害结果。将肿瘤错误地分类为良性可能是致命的,将良性 病变诊断为恶性则可能引起高发病率。目前没有方法可以确切地解决这些含糊。因此, 显然需要一种能够降低这些不确定性的治疗性检测。吞噬是细胞将大颗粒(通常直径为0.1mm)例如细菌或细胞碎片内化的过程。可 以尝试性地将吞噬的早期阶段分成不同的步骤细胞膜结合颗粒、吞噬体形成和吞噬体 内化。已经有人提出在吞噬体形成和内化的过程中,肌动蛋白细胞骨架驱动这些步骤以 允许吞噬。早在一个世纪之前即已在恶性肿瘤中鉴定了吞噬细胞,更近一些时候,在不同 组织学的肿瘤中检测到了具有吞噬行为(也定义为同类相食行为(cannibalisticbehavior)的 细胞,所述肿瘤为例如肺的燕麦细胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、成神经管细胞瘤、胃腺癌、 皮肤的黑素瘤和鳞片细胞癌。我们最近观察到吞噬是转移性的黑素瘤细胞的特征,这些细胞能够吞噬凋亡细 胞、塑料珠染色的酵母以及显示出负责巨噬细胞样活性的有效吞噬机制的活的淋巴细 胞,而源自初级病变的黑素瘤细胞不显示任何同类相食或吞噬活性。此外,在100%的转 移性黑素瘤病变中均可检测到同类相食细胞(cannibal cell) (Lugini等人,2004; Lugini等 人,2006)。同类相食细胞的主要特征之一是溶酶体样小泡的酸性增加和组织蛋白酶B的过 表达,组织蛋白酶B是被报道参与肿瘤侵袭和转移的蛋白水解酶(Sloane等人,1981)。 与专职的吞噬细胞样巨噬细胞不同,同类相食肿瘤细胞不利用皱状结构或任何伪足运 动。相反,触碰肿瘤细胞的外膜的活的或死的材料立即被内吞并通过一种流沙机制被消 化,该机制似乎不涉及任何特异性受体。这些发明指引我们推测同类相食细胞以其它细胞进行饲养,其中可能不存在 源自血液的营养物供给的特定需要,还推测肿瘤细胞对淋巴细胞的同类相食可能代表了肿瘤免疫逃逸的根本机理。此外,这些发现指引我们获得了新型的、革命性的解释癌 细胞在其使用其它细胞进行饲养的行为中可能表现为单细胞真核细胞的行为,其唯一目 的是在与其它细胞和不利环境持续抗争的过程中存活下来。该理论进一步指引我们推 测变形虫和转移性的细胞可能具有含有相同调控元件的相同框架,所述调控元件允许 它们在不利的微环境条件下存活下来。但是,目前为止,尚未发现与癌细胞的同类相食 行为特异相关的基因。细胞粘霉菌盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)以前曾被用作研究吞噬的模
式生物。盘基网柄菌细胞的吞噬中涉及的机制与哺乳动物的吞噬细胞使用的机制非常相 似,包括肌动蛋白细胞骨架和RacFl,RacFl是GTP结合蛋白的Rho家族的成员。但 是,在哺乳动物中尚未鉴定出与吞噬相关的特异性蛋白。最近发现在变形虫盘基网柄菌中,在细胞粘附和吞噬中牵涉到PHG1A基因编 码的蛋白。该蛋白属于TM9超家族,可以在真核细胞基因组中明确地鉴定出编码TM9蛋 白的基因。该家族在生物(从酵母到植物和人类)中包括很多成员。仅举一些例子在 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、变形虫盘基网柄菌和果蝇中有该家族的3个成员, 在人类和小鼠中有4个。它们全都显示出相似的总体结构,具有高度可变的潜在的腔结 构域,后跟更保守的膜结构域和9个或10个推定的跨膜结构域。发明概述基于我们的理论癌细胞使用其它细胞进行饲养,其行为表现为单细胞真核细 胞,并且可能与变形虫具有含有相同调控元件的相同框架,我们比较了 PHG1A基因和人 类基因组。在人类中phgl的三个同源物已经被完全测序(TM9SF4、U81006和U94831), 我们发现人类中与盘基网柄菌的phgl最近的同源物是tm9sf4(其它别名KIAA0255、 dJ836N17.2),其位于染色体20qll.21上。虽然该基因已经被完全测序,但是其功能或表 达产物从未被描述过。因此,我们更详细地研究了 tm9sf4编码的蛋白的功能和表达。在本公开中,我 们显示了该蛋白的功能并提供了很多应用。本公开显示该蛋白在恶性细胞中是高度表达的。在源自患者的几种黑素瘤细 胞系中的观察显示TM9SF4是恶性的标志物,因为该蛋白在源自初级病变的细胞系中 是检测不到的。此外,在转移性的黑素瘤细胞的吞噬行为中也涉及该蛋白,因为使编码 该蛋白的基因发生沉默会强烈抑制转移性细胞的吞噬行为。基于这些发现,我们将此蛋 白命名为TUCAP-1 (肿瘤相关的同类相食蛋白1, Tumor associated cannibal protein丄)。 相应地,编码该蛋白的基因在本文中被称为tucap-1基因。本发明满足了用于检测恶性细胞和诊断黑素瘤及其它肿瘤的快速测试的要求。 因此,本公开提供了可用于进行TUCAP-1检测、分析和潜在的治疗效应的抗体、引物、 寡核苷酸和多肽。本发明提供了对应于或互补于tucap-1基因的全部或一部分的多核苷酸,以及与 tucap-1基因、mRNA或编码TUCAP-1的多核苷酸杂交的多核苷酸或寡核苷酸。提供了 含有TUCAP-1多核苷酸的重组DNA分子、经这样的分子转化或转导的细胞,以及用于 表达tucap-1基因产物的宿主-载体系统。本公开还提供了 TUCAP-1蛋白及其多肽片 段。
本发明还提供了与TUCAP-1蛋白及其多肽片段结合的抗体,包括多克隆抗体和 单克隆抗体、鼠和其它哺乳动物抗体、嵌合抗体、人源化和完全的人类抗体,以及经可 检测标记物标记的抗体,和与放射性核苷酸、毒素或其它治疗性组合物偶联的抗体。本 发明还提供了用于检测在各种生物样品中是否存在TUCAP-1多核苷酸和蛋白的方法,以 及用于鉴定表达TUCAP-1的细胞的方法。


图1.TM9SF4/TUCAP-1蛋白的分子结构(A)TUCAP-l蛋白序列的水性分布图。疏水性区域在横线以上以正数表示。在 横坐标中标明了氨基酸编号。N末端区域中的亲水性区段之后是9个疏水性区域。使用 TopPred预测程序根据Claros和von Heijneb进行分析。(B)根据TopPred预测服务器的TUCAP-1 二级结构的图像代表。图2.TM9SF4/TUCAP-1转录本的检测和TUCAP-1抗体的表征(A)在最近在体外从转移性病变建立的5种转移性(MM1-5)和5种初级黑素瘤 (PM1-5)细胞系以及来自2个不同供体的外周血细胞(PBL1-2)中进行的TUCAP-1 (上 面的图板)和GAPDH (下面的图板)的RT-PCR分析;M:大小标志物。(B)用于免疫小鼠的6-组氨酸标记的TUCAP-1肽和未经诱导的细菌裂解物中 的6-组氨酸或TUCAP-1的Western印迹。将等量的纯化的蛋白和细菌裂解液装入还原 性凝胶中并以6-His-抗体或TUCAP-1小鼠抗血清进行印迹。使用HPR偶联的二抗显示 蛋白并以ECL系统(Pierce)显示。(C)在 GFP-TUCAP-1 (GFP-Tuc)转染的 MM1 细胞的 Triton 可溶性(泳道 1) 和Triton不可溶性(泳道2)组分,以及未经转染的MM1细胞的Triton可溶性和不可溶 性组分(泳道3-4)中进行的GFP-TUCAP-1和GAPDH的Western印迹。M 大小标志 物。使用HPR偶联的二抗显示蛋白并以ECL(Pierce)显示。作为分子量标志物,使用 了 RainbowTM (Amersham UK)预染的标准物。图 3.TUCAP-1 的 Western 印迹分析为了检测TUCAP-1,在GFP-Tuc转染的MM2细胞、4种转移性的黑素瘤细胞系 (MM2-5)和CCD-1064SK人类皮肤成纤维细胞(HSC)中进行的Western印迹。通过肌 动蛋白的免疫检测控制上样量。使用HPR偶联的二抗和DAB系统(DAKO,Denmark) 作为色原体(cromogen)来显示蛋白。使用RainbowTM (Amersham UK)预染的标准物作
为分子量标志物。图4.TUCAP-1的免疫细胞化学和免疫组织化学分析。图4A与图4相同,不过 图4A是黑白图。(A)MM2细胞;(B)外周血淋巴细胞;(C)体外分化的巨噬细胞的小鼠免疫前
血清免疫细胞化学分析。(D)M2细胞;(E)外周血细胞;(F)巨噬细胞的TUCAP-1免疫细胞化学分析。以(G)免疫前小鼠血清;(H) TUCAP-1免疫血清和⑴抗-GP100染色的恶性黑 素瘤组织的免疫组织化学分析。以⑴免疫前小鼠血清;(K)TUCAP-l免疫血清和(L)抗-ezrin抗体染色的健康皮肤的免疫组织化学分析。放大倍数为10倍。图5.TUCAP-1/-I的亚细胞定位。图5A与图5相同,不过图5A是黑白图。(A)来自MM2总裂解物的TUCAP-1免疫沉淀物的亚细胞组分的Western印迹分 析。M:大小标志物,TE:总提取物。(B) TUCAP-1 (绿色)和Rab5 (红色)的免疫荧光(IF)双染色分析。(C) TUCAP-1 (绿色)和Lamp-1 (红色)的IF双染色分析。(D) TUCAP-1 (绿色)禾P Mitotracker染色的线粒体(红色)的IF双染色分析。 黄色/橙色区域表示共定位。细胞核以H0eChst 33258染色。放大倍数为100倍。图6.TUCAP-1/-II的亚细胞定位。图6A与图6相同,不过图6A是黑白图在MM2细胞中TUCAP-1 (绿色)和EEA1 (红色)的免疫荧光(IF)双染色分 析。黄色/橙色区域表示共定位。细胞核以H0eChst33258染色。放大倍数为100倍。图7.同类相食细胞中的TUCAP-1检测。图7A与图7相同,不过图7A是黑白 图(A)与活的淋巴细胞共培养的转移性的黑素瘤MM1细胞中TUCAP-1的检测 和定位。TUCAP-1 (绿色)的IVM分析。图像着重显示仅在黑素瘤细胞中可以检测到 TUCAP-1。(B)与活的淋巴细胞共培养的转移性的黑素瘤MM1细胞中TUCAP-1 (绿色)和 EEA1 (红色)的双荧光分析。黄色/橙色区域表示共定位。细胞核以Hoechst 33258染色。图 8.TUCAP-1 表达的 FACS 分析在未经转染的MM2细胞、打舌L 的(Scrambled) siRNA和 TUCAP-lsiRNA(TM9SF4siRNA)转染的MM2细胞中在转染之后48小时进行TUCAP-1 表达的Facs分析。图9.TM9SF4/TUCAP-1 的功能分析(A)打乱的 siRNA(SC-siRNA)或 TUCAP-lsiRNA(TM9SF4siRNA)转染的 MM2 细胞的吞噬活性的FACS分析。灰色未染色的对照细胞;红色阴性对照,打乱的 siRNA转染的细胞;绿色TM9SF4siRNA转染的细胞。(B) SC-siRNA或TM9SF4siRNA转染的MM2细胞与DHR123染色的淋巴细胞孵
育18小时后的同类相食活性的FACS分析。灰色未染色的对照细胞;红色SC-siRNA 转染的细胞;绿色TM9SF4siRNA转染的。为了排除未被黑素瘤细胞摄取的DHR123 染色的淋巴细胞,评价了专有性的黑素瘤细胞荧光发射。(C) LysoTracker DND-26 染色的 SC-siRNA 或 TM9SF4siRNA 转染的 MM2 细胞的FACS分析。灰色未染色的对照细胞;红色SC-siRNA转染的;绿色 TM9SF4siRNA 转染的。图10.通过Matrigel证明TUCAP-1的过表达增强细胞侵袭。图10A与图10相 同,不过图10A是黑白图侵袭性WM743黑素瘤细胞相对于GFP-标记的全长TUCAP-1 WM743黑素瘤细 胞(TWM)的相显微镜图像。将侵袭性细胞固定于福尔马林中并以结晶紫染色。图像清 晰地显示TWM的侵袭性细胞的数目显著较高,对于未转染的TWM是平均25个细胞,对于TUCAP-I转染的TWM是平均132个细胞。发明描述TUCAP-1/TM9SF4(HUGO命名法官方委员会官方全名跨膜9超家族蛋白成 员4)属于跨膜9超家族(TM9SF),其为高度保守的蛋白家族,其特征在于存在大的可变 的细胞外N末端结构域和9至10个推定的跨膜结构域。但是,在人类细胞中从未描述过 TM9SF4的功能和定位。在本公开中,我们对该蛋白的表达进行了定位并提供了该蛋白 的有用的和新的应用。本公开鉴定出该蛋白为新的癌蛋白并且显示该蛋白在恶性肿瘤细 胞中表达,而在众多健康细胞和组织中是检测不到的。本公开还显示了该蛋白的结构, 并通过与其它蛋白类比显示了该蛋白可能参与细胞内小泡的pH调节。贯穿本公开,我们 将该蛋白称为TUCAP-I,相应地将编码该蛋白的基因称为tucap-Ι。下表1显示了 TUCAP-I蛋白的理化参数
理化参数的Tupac-I ProtParam计算氣基酸个数625分子量72541.3理论pi:6.22消光系数132880 Abs 0.1 % (=1 g/1) 1.832,假设所有的半胱 氨酸残基作为一半的胱氨酸出现132130 Abs 0.1 % (=1 g/1) 1.821,假设没有任何半 胱氨酸残基作为一半的胱氨酸出现估计半衰期30小时(哺乳动物)通过TopPred预测服务器对TUCAP-I进行的水性分析显示出多数为亲水性的、 延伸至氨基酸262的氨基末端部分,而该蛋白的剩余部分是极度疏水性的并含有9个潜 在的跨膜结构域(图1A)。基于这种预测的结构,可以非常合理的假设TUCAP-I是 整合的膜蛋白,如图IB所示。我们的发现“TUCAP-I和PHGl之间有相当高的同源性 (45%,如果考虑到NCBI Blast蛋白程序阳性比对则上升到63% )”引领我们得到如下新 的假设TUCAP-I可能在人类转移性黑素瘤细胞的同类相食活性中发挥作用。根据本发明的一个优选的实施方式是,对应于或互补于tucap-Ι基因的全部或 一部分、mRNA和/或编码序列的多核苷酸,优选为分离的形式,包括编码TUCAP-I 蛋白及其片段的多核苷酸、DNA、RNA、DNA/RNA杂合体,以及相关分子,互补于 tucap-Ι基因或其mRNA序列或部分的寡核苷酸,以及与TUCAP-I基因、mRNA或编码 TUCAP-I的多核苷酸杂交的多核苷酸或寡核苷酸。
根据本发明的另一个优选实施方式是“抗体”,其为识别(或可结合)TUCAP-I 蛋白的“特定序列”(即其抗原)的完整抗体分子或其片段。抗体可以是多克隆抗体或 单克隆抗体。在这个实施方式中,TUCAP-I蛋白是具有如SEQ ID NO: 1所示氨基酸序 列的多肽,特定序列是多肽或其片段,所述多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1的氨 基酸序列相比含有一个或多个氨基酸的删除、替代或添加。本发明的抗体包括抗体突变 体。“抗体突变体”是这样的突变体抗体中的一个或多个氨基酸残基经过了相对于原 始状态的修饰。根据另一个实施方式是TUCAP-I抑制剂。这样的抑制剂分子可以是与SEQ ID NO 2的序列基本上互补的多核苷酸序列或其部分,以及与SEQ IDNO : 2的片段基本上 互补的寡核苷酸序列。根据本发明的另一个实施方式是治疗人类患者中的癌症的方法,包括以下步 骤给予所述患者治疗有效量的组合物,所述组合物包含与化疗药物偶联的TUCAP-I结 合试剂。与TUCAP-I蛋白特异性结合的抗体和片段可用于治疗癌症。本发明包括使用 与对于癌症可具有细胞毒性效应的其它部分融合的抗体和抗体片段。本发明的另一个优选的实施方式是产生针对TUCAP-I蛋白或其片段的单克隆抗 体的细胞系。根据另一个优选的实施方式是含有全长野生型或突变的TUCAP-I序列或 TUCAP-I的删除突变体的重组DNA或RNA分子,包括但不限于噬菌体、质粒、噬菌 粒、粘粒、YAC、BAC以及各种本领域熟知的病毒和非病毒表达载体,和经过这样的重 组DNA或RNA分子转化或转染的细胞。使用这些表达载体,TUCAP-I可以在几种恶性 肿瘤细胞系中优选表达。优选的实施方式包括宿主-载体系统,其可用于产生TUCAP-I 蛋白或其片段。这样的宿主-载体系统可用于i)研究TUCAP-I和TUCAP-I突变的功 能特性;ii)作为模型来开发基于使用TUCAP-I沉默载体和表达TUCAP-I突变体的载体 的基因治疗方案。因此,本发明提供了测定、研究和检测TUCAP-I (作为很多类型的癌症的恶 性的标志物)的独特工具。此外,本发明介绍了用于临床肿瘤学家管理和跟进(follow up)癌症患者的新的工具。此外,作为抗肿瘤化合物,能够干扰TUCAP-I表达或作为 TUCAP-I阻断试剂的其它分子的肽落在本发明的范围内。本发明的另一个优选的实施方式是用于检测来自肿瘤患者的组织样品和体液的 TUCAP-I的试剂盒,其作为诊断和或预后工具,例如作为检测试剂盒。这样的试剂盒包 括a)抗TUCAP-I抗体;b)由纯化的TUCAP-I蛋白组成的阳性对照,和必要的缓冲 剂。现在通过实施例的方式描述本发明,这些实施例不是为了限制本发明的范围。 本发明的范围由随附的权利要求书确定。
实施例实施例1在人类恶性黑素瘤细胞中可以检测到Tucap-I转录本和TUCAP-I蛋白,但是在 初级黑素瘤细胞、外周血单核细胞或健康皮肤细胞中检测不到
细胞培养.人类初级和转移性的黑素瘤细胞系分别源自在IstitutoNazionale dei
Tumori, Milan, Italy进行手术切除的患者的初级或转移性的肿瘤损伤。本研究中使 用的所有细胞被称为PM(初级黑素瘤)或MM(转移性的黑素瘤),后跟累进数字。 通过Ficoll-Hypaque(Pharmacia)密度梯度从健康供体的黄层纯化人类外周血单核细胞 (PBMC)。根据生产商的指示,使用CD 14标记的Miltenyi微珠从PBMC分离单核细胞, 并于37°C置于RPMI 1640+15% FCS中使其分化2周。在CD14珠子介导的单核细胞消 除之后获取剩余的外周血淋巴细胞(PBL)。在37°C在5% CO2环境中将所有的细胞培植 于补充了 100IU/mL青霉素、100Ag/mL链霉素、10% FCS的RPMI 1640中(所有的试剂 购自 Cambrex)。PCR 分析.通过 rt-PCR 分析在 Instituto Nazionale Tumori,Milan 通过手术切除的
患者的黑素瘤获得的几种初级和转移性黑素瘤细胞系中Tucap-I转录本的表达,将其与外 周血淋巴细胞(PBL)进行比较。通过RNAzol (Invitrogen)方法从细胞获取总RNA,RNA 模板用于RT-PCR扩增。用于TUCAP-I检测的引物是tgtgtgaaacaagcgccttc (SEQ ID NO 3)禾口atgaggtggacgtagtagt (SEQ ID NO 4)。这些引物扩增349个碱基对的片段。用于指导TUCAP-IHis-标记的N末端结构域合成的引物是gaattcatgtgtgaaacaagcgcctt (SEQ ID NO 5)禾口gtcgacagaaaaccagtggatctg (SEQ ID NO 6) 用于检测GAPDH的引物是ccatggagaaggctgggg (SEQ ID NO 7)禾口caaagttgtcatggatgacc (SEQ ID NO 8)。人类黑素瘤细胞中TUCAP 1的克隆和TUCAP 1融合蛋白的表达将PCR产物 克隆进入pTopo载体(Invitrogen),然后以合适的限制性酶对(EcoRI、Sail)切割以获得单 一片段,然后将该单一片段连接进入pTrcHis2载体(Invitrogen)。按照生产商的指示,使 用Ni NTA琼脂糖树脂(Qiagen)纯化表达的重组蛋白并用于免疫小鼠。用于指导GFP-标记的全长TUCAP-I的引物是gaattcatgtgtgaaacaagcg (SEQ ID NO 9),禾口gtcgatgtctatcttcacagcata (SEQ ID NO 10)。将PCR产物克隆进入pTopo载体(Invitrogen),然后以合适的限制性酶对 (EcoRI-SalI)切割并连接以获得单一片段,然后在EcoRI和SalI位点将该单一片段连接进 入pEGFPNl载体(Clontech)以产生GFP_TUCAP_1融合蛋白。按照生产商的指示,使 用Lipofectamine 2000转染试剂盒(Invitrogen)将编码GFP_TUCAP_1融合蛋白的质粒转 染进入MMl和MM2细胞,从而获得GFP-TUCAP-1 (GFP-Tuc) MMl或MM2细胞。通 过荧光活化细胞分选分析来评价转染的细胞的百分率。Western印迹和免疫沉淀将细菌裂解物、黑素瘤细胞全裂解物和CCD-1064SK健康皮肤成纤维细胞 (SantaCruz)重悬于SDS样品缓冲液,通过煮沸变性,通过SDS-PAGE分离,并通过 Western印迹分析。分别以抗6His单抗(Sigma)、抗GFP (克隆1E4MBL)、抗TUCAP-1小鼠血清和抗GAPDH (SantaCraz)检测6xHis标记的蛋白、GFP、TUCAP-I和GAPDH。 在4°C在存在蛋白A+G-Sepharose珠子(Pierce)的情况下,通过使用兔子抗TUCAP-I多
克隆抗体从预清除的细胞裂解物中免疫沉淀TUCAP-I蛋白。兔子免疫前血清用作阴性对 照。以抗肌动蛋白单抗(Sigma)检测肌动蛋白。为了表征tucap-Ι的基因产物,将源自MMl细胞的cDNA克隆进入细菌表达载 体以获得融合至6-组氨酸N末端标签的TUCAP-I的前265个氨基酸(6H_Nt_TUCAP 1) (SEQ ID NO 11)。纯化的重组蛋白的Western印迹分析得到大约30kDa的翻译产物,在 对照的细菌全裂解物(阴性对照)中不存在此产物。因此,His-标记的TUCAP-I重组肽 用作免疫原以在小鼠中产生抗TUCAP-I抗体。通过纯化的6H-Nt-TUCAP_1与抗6His和 TUCAP-I小鼠抗血清的免疫印迹反应的Western印迹分析确定TUCAP-I抗血清的特异性 (图2B)。通过Western印迹在经过GFP-标记的全长TUCAP-I (GFP-TUCAP-1)转染的或 未经转染的MMl细胞的Triton可溶性和Triton不可溶性组分中进一步分析TUCAP-I小鼠 抗血清。抗-GFP抗体显示出IOOkDa范围内的单一的特异性翻译产物,而抗-TUCAP-I 抗体同时识别GFP标记的和内源性的TUCAP-1,其对应于在两种细胞系中均可检测到的 70kDa的蛋白(图2C)。有趣的是,在Triton不可溶性组分(GAPDH阴性,富含细胞骨 架蛋白的组分)中代表了更多的TUCAP-1,因此支持“提出TUCAP-I是跨膜蛋白”的 临时模型。为了进一步支持PCR结果,在4种转移性黑素瘤细胞(MM2-MM5)的细胞 提取物中进行抗-TUCAP-I抗体的印迹反应,以前分析过所述这些细胞与作为对照的健 康皮肤成纤维细胞(HSC)和GFP-TUCAP-1转染的MM2细胞相比的同类相食行为。仅 在黑素瘤细胞中检测到了 TUCAP-I,而在皮肤细胞中检测不到(图3)。实施例2免疫化学显示TUCAP-I仅存在于黑素瘤细胞中免疫细胞化学和免疫组织化学.为了进行免疫细胞化学,将培养于腔室玻璃片 (Falcon)上的黑素瘤细胞和巨噬细胞和离心涂片于玻璃片上的PBL于4°C在80%的甲醇 中固定10分钟,并以TUCAP-1、TUCAP-I小鼠血清或免疫前对照血清染色。以免疫 前血清、抗TUCAP-I小鼠抗血清将来自Biomax阵列玻璃片(Biomax)的恶性黑素瘤和 对应的正常皮肤组织进行免疫染色。另外以抗-gplOO(Immun0tech)将黑素瘤染色,以 抗-eZrin(Sigma)将正常皮肤染色。使用过氧化物酶抗过氧化物酶方法通过单染(Dako) 和Mayer苏木精复染来显示蛋白。图4A-C显示MM2细胞系(A)、外周血淋巴细胞(B)和体外分化的巨噬细胞 (C)对于小鼠免疫前血清是阴性的。与PCR结果一致,恶性黑素瘤培养的细胞显示出对 于TUCAP-I的清晰的阳性染色(图4D)而PBL (图4E)和巨噬细胞(图4F)对于TUCAPl 染色是阴性的。恶性黑素瘤组织相对于健康皮肤的免疫组织化学分析表明仅在黑素瘤 组织中可以检测到TUCAP-I (图H),在健康皮肤中检测不到(图4K)。作为黑素瘤和正 常组织的阳性对照标志物,分别使用了 GPlOO(图41)和ezrin(图4L)。在两种组织中免 疫前小鼠血清染色一直是阴性的(图4G、4J)。这些结果提供了清晰的证据证明了仅在 黑素瘤细胞中可以检测到TUCAP-I,因此,其支持实施例1的结果。实施例3TUCAP-I的亚细胞定位
进行了进一步的实验以分析TUCAP 1的细胞内定位细胞区室分离.按照Qproteome细胞膜试剂盒程序(Quiagen)收集并处理细胞
以获得细胞区室的非变性组分,其对应于纯化的细胞膜和细胞质。然后以丙酮沉淀后一 个组分并重悬于免疫沉淀缓冲液B中(0.1% SDS、1%NP40, 0.5%胆酸钠),以进行以 兔子抗TUCAP-I的免疫沉淀。通过离心将来自细胞区室组分的残余沉淀(其含有完整 细胞和细胞器)中的完整细胞除掉,并进行Triton X-100提取以获得可溶性和不可溶性 组分,对这些组分以兔子抗TUCAP-I进行免疫沉淀。在进行样品的电泳之后,以小鼠 抗-TUCAP-I在硝酸纤维素膜上进行印迹反应。免疫荧光分析.将MM2细胞培植于置于60-mm皮氏培养皿中的盖玻片上。将 细胞固定于2%的多聚甲醛并渗透(Triton X-100 (0.1 %)) 24个小时。为了进行TUCAP 1和Rab5双染色,分别以小鼠抗TUCAP-I血清和兔子抗-Rab5 (SantaCraz)标记细胞, 并以Alexa Fluor 488-偶联的抗小鼠IgG和Alexa Fluor 594-偶联的抗兔子IgG (Molecular Probes)显示。为了进行TUCAP-I和Lamp-I检测,分别以兔子抗TUCAP-I多抗和小 鼠抗Lamp-I单抗(BD Pharmingen)标记细胞,以Alexa Fluor 594-偶联的抗兔子IgG和 Alexa Fluor 488-偶联的抗小鼠IgG染色。TUCAP-I和线粒体的检测这样进行以抗 TUCAP-I小鼠多抗将TUCAP-I染色并以Alexa Fluor 488偶联的抗小鼠IgG进行标记; 以MithotrackerRed(Invitrogen)标记线粒体。洗涤之后,以甘油PBS (2 1)将所有的 样品封片并以LeicaDM 2500荧光显微镜观察。以配备有IAS 8.2图像分析系统的(Delta Sistemi)的 Spot Insight 数码相机(DeltaSistemi)记录图像。以抗TUCAP-I抗体将MM2的全细胞裂解物进行免疫沉淀,分离各个亚细胞 组分并通过Western印迹进行分析。结果显示TUCAP-I的回收主要发生在富含细胞 器的组分中,而在细胞质和细胞膜组分中检测不到(图5A)。为了鉴定TUCAP-I的 亚细胞定位,将MM2细胞进行TUCAP-I和早期内涵体标志物Rab5的双染色,或者 TUCAP-I和晚期内涵体和溶酶体成分Lamp-I的双染色,或者TUCAP-I和线粒体标志物 Mitotracker 的双染色。荧光显微镜分析显示TUCAP-1与Rab5 (图5B)和EEA-1 (图 6和图7B)均发生共定位,而TUCAP-I不与Lamp-I (图5C)、Mitotracker (图5D)或 Hoechst染色的细胞核发生共定位。此外,图7显示了与活的淋巴细胞共培养的相同细胞中进行的双染色荧光。仅 在黑素瘤细胞的表面能够检测到TUCAP-1,而淋巴细胞完全是非染色状态(图7A)。同 样,TUCAP-I与初级内涵体标志物EEA-I共定位(图7B),这确认了该蛋白在早期内涵 体中的表达。实施例4TUCAP-I的功能分析Tucap-I沉默抑制吞噬行为通过Tucap-I沉默来抑制TUCAP-I蛋白的表达,从而评价TUCAP-I蛋白在人
类转移性黑素瘤细胞中的作用。根据生产商的指示,使用下列StealthRRNAi双链(Invitrogen)进行tucap-Ι沉默
并退火gagugacguccagauccacugguuu (SEQ ID NO 13),禾口
aaaccaguggaucuggacgucacuc (SEQ ID NO 14)。作为阴性对照,使用 Stealth RNAi Negative control medium GC duplexes (Invitrogen)。 根据生产商的指示,使用 Lipofectamine RNAiMAX试剂(Invitrogen转染黑素瘤细胞。简而言之,在转染的前一天,
将黑素瘤细胞培植于6孔板(1X105/孔),24小时后,以30pmol siRNA/孔转染细胞。 转染后48小时,通过FACS分析细胞中TUCAP-I的表达。以针对Tucap-1的小干扰RNA (Tucap-1 siRNA)或以不相关的siRNA寡聚体 (SC-siRNA)转染3种不同的吞噬性的转移细胞系。图8显示了转染48小时后,在未经转 染的MM2细胞和经过打乱的siRNA或TUCAP-1 siRNA转染的MM2细胞中对于TUCAP-1 表达的FACS分析。在打乱的和TUCAP-I沉默的MM3细胞中获得了相似的结果(未显 示)。这确认了 TUCAP-I的有效敲低。为了评价这些细胞的吞噬活性,我们首先测定了未经转染的、经过SC-siRNA 转染的或Tucap-I沉默的黑素瘤细胞系摄取染色的酵母细胞或活的淋巴细胞的能力。 转染后48小时,在37 °C将FITC染色的酿酒酵母FITCd 60)或10 μ Mol 二氢罗 丹明 123(DHR123) (Molecular Probes)染色的活的淋巴细胞(1 10)与 SOsiRNA 或 TUCAP-IsiRNA转染的MM2和MM3黑素瘤细胞一起孵育。4小时后,以PBS洗掉多 余的淋巴细胞或酵母细胞并加入含有胰蛋白酶(1.5g/L)、EDTA(0.44g/L)的PBS溶液, 以此测定吞噬/同类相食。洗涤之后,收集黑素瘤细胞并通过配备了 488-nm氩激光的细 胞计数器进行分析。获取至少10,000个事件并使用CellQuest软件(Becton Dickinson)通 过Macintosh计算机进行分析。显示绿色荧光的黑素瘤细胞被认为是吞噬/同类相食的。 结果显示TUCAP-I敲低显著抑制黑素瘤细胞的吞噬和同类相食活性(图9A、9B、表 1),这证明TUCAP-I在转移性的人类黑素瘤的同类相食行为中发挥重要作用,因此该蛋 白可用作恶性的标志物。表2.TUCAP-1在吞噬/同类相食中的作用打乱的siRNA (SC-siRNA)转染的和 Tucap-1 沉默的(Tucap-1 siRNA) MM2 和
MM3转移性的黑素瘤细胞对于FITC染色的酵母和DHR123染色的活的淋巴细胞的吞噬 /同类相食活性。吞噬活性表达为吞噬细胞的百分数。数字为5次不同实验的平均值 士 s.d·。
酵母活的淋巴细月色SC-siRNATucap-I siRNASC-siRNATucap-I siRNAMM237 土 14 + 245+517±9MM343+ 1414+ 1240+99 + 7实施例5TUCAP-I在调节内涵体小泡的酸性中发挥作用在37°C使用 1 μ M LysoTracker 探针(Molecular Probes)将打乱的 siRNA转染的和 TUCAP-I沉默的MM2和MM3细胞染色30分钟并立即通过细胞计数器分析。使用荧光强度柱状图的中位数通过CellQuest软件进行不同黑素瘤细胞系之间的比较。基于“TUCAP-1定位于具有Rab5的内涵体”的结果(见实施例3),我们测试 了 “TUCAP-1蛋白在调节恶性肿瘤细胞的吞噬/内涵体区室的pH中发挥作用”的假设。 为了验证该假设,以向酸性探针LysoTracker绿将对照SC-RNAi和TUCAP_l_siRNA转染 的细胞染色,并通过流式细胞术分析。相对于SC-RNA转染的对照细胞,Tucap-I基因 的沉默诱导黑素瘤细胞中较少的酸性小泡的出现(图9C)。这些实验支持“TUCAP-1在 调节内部小泡例如早期内涵体的酸性中发挥作用”的假设。实施例6TUCAP-I参与早期转移过程基于使用TUCAP-I过表达细胞的正在进行的实验表明该蛋白在转移过程的 早期参与肿瘤细胞侵袭。通过使用Matrige侵袭室(Becton-Dickenson,Bedford, ΜΑ, USA)分析了这些细胞的细胞侵袭能力。简而言之,将未经转染的WM743或GFP标记 的全长TUCAP-1WM743黑素瘤细胞(TWM)重悬于无血清培养基中并装入顶室,将底室 置于培养基中,培养基中添加10% FCS作为化学吸引剂。在37°C在潮湿的空气中孵育 细胞并允许其通过趋化室迁移48小时。孵育之后,使用棉花载体将保持在上部表面的细 胞完全除掉。使用结晶紫将位于趋化室底部的迁移的细胞染色。通过显微镜(40x)在4 个不同的视野/滤光器中对侵袭细胞进行计数。图10显示了跨孔膜的较低侧,其清晰地 表明对于TWM而言侵袭细胞的数目显著较高,对于未经转染的是平均为25个细胞; 对于TUCAP 1转染的TWM细胞是平均为132个细胞。实施例7TUCAP-I参与黑素瘤细胞对顺钼的抗性几篇发表的文章显示了蛋白在离子运送中的作用和内涵体区室在药物捕获、灭 活和挤出(作为药物抗性)中的作用。早期内涵体中的TUCAP 1的表达及其参与内涵 体小泡中的pH调节(如以上实施例所示)指引我们假设该蛋白在癌细胞对于药物的抗 性中发挥作用。为了证明此假设,以打乱的(SOsiRNA)或Tucap-Isi-RNA将高度表达 TUCAP-I的MM2黑素瘤细胞预处理48小时(如以上实施例所示),转染后,以2μΜ顺 钼处理细胞。在顺钼诱导后48小时,通过FACS分析早期(araiexin-V单一阳性)和晚期 (PI/Annexin V双阳性)细胞凋亡来评价细胞毒性。相对于作为未经转染的对照细胞的打 乱的SiRNA处理的WM743细胞,Tucap-I沉默使顺钼的细胞毒性效应显著升高。在对照 转染的细胞中平均有63%的活细胞;在TUCAP-I沉默的细胞中平均有37%的活细胞。这套实验证明了 TUCAP-I参与过表达TUCAP-I的细胞的药物抗性,tucap_l沉 默是抑制肿瘤细胞吞噬特性的理想方法。基于以上实施例中显示的结果,本公开还提供了高度敏感的和特异性的用于检 测黑素瘤和几种其它的具有所描述的吞噬行为特征的肿瘤(即,乳腺癌、肺癌、膀胱 癌、成神经管细胞瘤和胃腺癌)的方法。此外,通过显示TUCAP-I专有性地在恶性肿瘤 中表达,本公开提供了区分恶性和良性癌症病灶的方法。检测癌症的方法包括评价来自 推定癌症病灶的生物学样品,通常通过原位杂交、rt-PC或免疫酶学方法进行。实施例8TUCAP-I的多克隆和单克隆抗体
基于以上实施例,特异性针对TUCAP-I的多克隆(pAb)和单克隆抗体(mAb) 对于各种目的将是有用的,包括例如用于确定肿瘤的恶性的诊断,和癌症的治疗。为了产生多克隆抗体,将来自MMl细胞的cDNA克隆进入细菌表达载体以获得 与6-组氨酸N末端标签融合的TUCAP-I氨基酸18-282 (SEQ IDNO : 11)。使用纯化的 重组肽在小鼠中产生抗-TUCAP-I抗体。抗-TUCAP-I抗体识别免疫原、作为阳性对照 的GFP-标记的全长蛋白,以及内源性TUCAP-I蛋白。还通过使用具有根据SEQ ID NO 12的氨基酸序列的纯化的肽片段免疫兔子、 山羊和驴产生了多克隆抗体。所产生的抗体能够通过结合至由SEQ IDNO 1的氨基酸 221-235组成的肽片段而识别人类TUCAP-I蛋白。还通过免疫山羊和驴获得了多克隆抗 体。为了产生单克隆抗体,使用具有根据SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12的氨基
酸序列或其片段的肽片段免疫小鼠。或者,使用具有根据SEQ IDNO : 15的氨基酸序列 的肽片段免疫小鼠。通过使用选择的小鼠的脾细胞产生选择的杂交瘤克隆。简而言之, 使来自免疫小鼠的脾脏的B细胞与专门选择用于产生杂交瘤的骨髓瘤肿瘤细胞系融合。 所产生的融合(杂合)细胞能够在培养中无限生长并随之产生大量的需要的抗体。根据标 准程序进行杂交瘤生产。筛选所选择的杂交瘤之后,将杂交瘤克隆并使其大规模生长以 产生抗体。对于不同的用途选择不同的阳性杂交瘤,例如a)实验室实验用途(Western 印迹、免疫沉淀、FACS分析、免疫荧光和免疫组化和免疫细胞化学分析人类组织和培养 的细胞);b)临床前和临床研究;c)肿瘤诊断和预后工具,例如检测试剂盒。所产生的 单克隆抗体与SEQ ID NO 1的TUCAP-I蛋白氨基酸18-282的构象型或线性表位结合, 或者与由SEQ IDNO 1的氨基酸221-235组成或由SEQ ID NO 1的氨基酸303-352组 成的肽片段结合。抗体还与小鼠、大鼠、猫、狗和绵羊来源的TUCAP-I蛋白结合。以上实施例详细公开了本发明的特定实施方式。但是,这是通过举例的方式进 行的并且仅仅是为了解释的目的。实施例不是为了限制随附的权利要求的范围,随附的 权利要求确定本发明。参考文献Bukrinskaya A, Brichacek B, MannA, Stevenson M.Establishment of afunctional human immunodeficiency virus type 1 (HIV-I) reverse transcriptioncomplex involves the cytoskeleton.JExpMed.1998 ; 188 2113-2125.Caraso RA, Muda AO, Bersiga A, Rigoli L, Inferrera C.Morphological evidence of neutrophil-tumor cell phagocytosis (cannibalism) in human gastricadenocarcinomas.Ultrastruct Pathol 2002 ; 26: 315-21.Chou, K.C. (2005). " Using amphiphilic pseudo amino acid composition topredict enzyme subfamily classes" .Bioinformatics,21, 10-19.DeS imone PA, East R, Powell RD.Phagocytic tumor cell activity in oatcell carcinoma of the 6y7y-j---ol 1980 ; 11 535—9.Fujii Μ, Ishii Y, Wakabayashi Τ,等人 Cytologic diagnosis of male breastcancer with nipple discharge.A case report.Acta Cytol 1986 ; 30: 2Gasteiger E., Gattiker Α., Hoogland C.,Ivanyi I., Appel R.D., BairochA.ExPASy the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysisNucleic Acids Res.31 3784-3788(2003).Kojima S,Sekine H,Fukui I,Ohshima H.Clinical significance of “cannibalism” in urinary cytology of bladder cancer.Acta Cytol 1998 ; 42 1365-9.Kumar PV, Hosseinzadeh M,Bedayat GR.Cytologic findings ofmedulloblastoma in crash smears.Acta Cytol 2001 ; 45: 542—6.Lugini L,Lozupone F,Matarrese P,Funaro C,Luciani F,Malorni W,Rivoltini L,Castelli C,Tinari A,Piris A,Parmiani G,Fais S.Potent phagocyticactivity discriminates metastatic and primary human malignant melanomas akey role of ezrin.Lab Invest.2003Nov ;
83(11) 1555-67.Lugini L,Matarrese P,Tinari A,Lozupone F,Federici C,Iessi E,GentileM, Luciani F, Parmiani G, Rivoltini L, Malorni W, Fais S.Cannibalism of livelymphocytes by human metastatic but not primary melanoma cells.Cancer Res.2006Aprl ; 66(7) 3629-38.B Rost,G Yachdav and J Liu (2004) Server.Nucleic Acids Research32 (Web Server issue) W321-W326B Rost (1996) Methods in Enzymology,266 525-539Shen, H.B.and Chou, K.C(2007) “ Hum-mPLoc an ensemble classifierfor large-scale human protein subcellular location prediction by incorporatingsamples with multiplesites,f, Biochemical and Biophysical ResearchCommunications.355 (4) 1006—11.Sloane BF,Dunn JR, Honn KV.Lysosomal cathepsin B correlation withmetastatic potential.Science 1981 ; 212 1151—3.Steinhaus J.Ueber carcinoma-einschlusse.Virchows Arch 1891 ; 126 533-5.Stroebe H.Zur Kenntniss verschiedener cellularer Vorgange undErscheinungen in Geschwulsten.Beitrage Patholl892 ; 11 1.Shen, H.B.and Chou K.C. (2006). “ Ensemble classifier for proteinfolding pattern recognition" .Bioinformatics,Jul 15 ; 22(14) 1717-22.
权利要求
1.一种肿瘤恶性的新型标志物,所述标志物包含根据SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。
2.权利要求1的标志物,其中所述氨基酸序列由SEQID NO 1的氨基酸18至282 组成,其为根据SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
3.权利要求1的标志物,其中所述氨基酸序列是根据SEQID NO: 12的氨基酸序列。
4.在恶性肿瘤细胞中专有表达的新型癌基因,其具有根据SEQID NO: 2的多核苷酸 序列或其部分。
5.分离的抗体,所述抗体通过用具有选自SEQID NO : 11、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 15的氨基酸序列的肽片段免疫小鼠、兔子、山羊或驴而产生,其中所述抗体能 够通过与选自SEQ ID NO 1的氨基酸18-282、221-235和303-352的肽片段结合而识别 人类TUCAP-I蛋白。
6.权利要求5的抗体或其片段,其中所述抗体是单克隆抗体并且属于IgG同种型 IgG2A,或 IgG 同种型 IgGl。
7.针对人类TUCAP-I蛋白的单克隆抗体,所述抗体具有阻断肿瘤生长的活性或阻断 转移的活性,所述抗体通过用选自SEQIDNO 11、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO: 15 的肽片段免疫小鼠而产生,并且所述抗体通过与位于SEQ ID NO 1的氨基酸18-282、 或221-235、或303-352之间的构象型或线性表位结合而识别人类TUCAP-I蛋白。
8.选择的杂交瘤,所述杂交瘤用经选择的小鼠的脾细胞获得,所述小鼠经过具有选 自SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的肽片段免疫,并 且所述选择的杂交瘤产生能够结合至人类TUCAP-I的构象型或线性表位的单克隆抗体、 或这样的单克隆抗体的片段或人源化形式、或所述片段的单链形式,所述表位位于SEQ ID NO 1 的氨基酸 18-282、或 221-235、或 303-352 之间。
9.用于抗原-抗体反应的试剂盒,所述试剂盒包含权利要求7的抗体和滴定的阳性对 照,所述阳性对照包含具有选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12禾口 SEQ ID NO 15的氨基酸序列的肽片段,其中所述抗体用于检测癌基因蛋白,所述蛋白 包含SEQ ID NO: 1,其来自具有肿瘤的患者的组织和体液。
10.一种诊断恶性肿瘤的方法,所述方法包括确定肿瘤细胞中存在或不存在SEQ ID NO 1的表达的步骤。
11.权利要求10的方法,其中通过RT-PCR、免疫酶学方法或原位杂交来确定存在或 不存在SEQ ID NO 1的表达。
12.—种跟进肿瘤的恶性的发展的方法,所述方法包括确定肿瘤细胞中存在或不存在 SEQ IDNO 1的表达的步骤。
13.—种抑制肿瘤细胞的吞噬特性的方法,所述方法包括抑制SEQIDNO : 1的表达 的步骤。
14.权利要求13的方法,其中通过使Tucap-I基因的表达沉默来抑制所述表达。
15.权利要求14的方法,其中以包含分离的核酸序列的表达载体转染肿瘤细胞, 所述分离的核酸序列与SEQ ID NO 2或其部分基本上互补,或与TUCAP-ImRNA或 TUCAP-I特异性调控因子互补。一种抑制肿瘤细胞的吞噬特性的方法,所述方法包括抑 制SEQ ID NO 1的表达的步骤。
16. —种治疗癌症的方法,所述方法包括以下步骤给予患者治疗有效量的组合物, 所述组合物包含与化疗药物偶联的TUCAP结合试剂。
全文摘要
本发明描述了tm9sf4编码的人类蛋白的功能和表达。该蛋白在恶性肿瘤细胞中高度表达,因此是恶性的新型标志物。此外,该蛋白参与肿瘤细胞的吞噬特性。本发明提供了诊断和跟进肿瘤的恶性的方法和工具。此外,提供了抑制肿瘤细胞的吞噬特性的方法以及治疗癌症的方法。
文档编号G01N33/574GK102016587SQ200980111385
公开日2011年4月13日 申请日期2009年1月26日 优先权日2008年1月25日
发明者F·洛祖波内, S·法伊斯 申请人:汉萨生物医药公司
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