专利名称：测定和表征人体液中微泡的新方法
技术领域：
本发明大体上涉及癌症诊断领域。更具体地，本发明涉及定量和定性人体液中外来体(exosomes)的方法。
背景技术：
外来体是大小介于30-120nm之间的微泡，其通过通常用于受体释放和细胞间相互通信的胞吐途径活跃地分泌。在多步超速离心后，可以在细胞培养上清液和一些体液中检测到外来体。除了主要组织相容性复合体蛋白(MHC I、MHC II)以及参与抗原呈递的蛋白之外，外来体可能携带参与多种细胞功能的膜蛋白和胞质蛋白。在特定生理条件下，从不同细胞类型分泌外来体，所述细胞类型如树突状细胞(DC)、淋巴细胞、肥大细胞和上皮细胞。该过程导致形成了篮样细胞贮器，其含有也称为多泡体(MVB)的这些多融合源微泡。已通过超结构观察分辨了该过程，特别是在正常细胞中。但是，通过外来体制备物的免疫电子显微镜和蛋白质印迹分析已表明这些微泡共表达了不同胞内液泡的标志物，如早期内涵体 (例如，Rab5)、溶酶体(例如CD63、CD81、LAMP-1)和晚期吞噬体(Rab7)，以及其它一些细胞特异性更强的蛋白(例如MHC III类抗原)。从肿瘤细胞释放的外来体明显多于从正常细胞释放的外来体，并且它通常与免疫抑制作用有关。除了一些肿瘤标记物(如，结肠癌的CEA、黑素瘤的MART-I或gp-100)的表达外，肿瘤来源的外来体在多个方面与正常细胞的外来体可比较。此外，似乎肿瘤外来体的来源在多个方面是与正常外来体不相似的。这可能是由于恶性细胞从细胞质到胞外环境的囊泡运输更有活力所造成的，反之亦然。肿瘤外来体在癌症发展中的作用是最近出现的研究领域。初始数据表明这些细胞器起到DC介导的T细胞交叉激活的肿瘤抗原性材料载体的作用。这些结果支持了使用肿瘤外来体作为抗癌疫苗的临床尝试。越来越多的有关这些微泡对免疫系统不同组件所施加的一大批抑制作用的证据明确支持肿瘤外来体参与了疾病发展。特别地，最近表明由各种来源的人肿瘤细胞分泌的外来体能够通过死亡配体(例如i^asL、TRAIL)的表达在激活的T 细胞中引起细胞凋亡，并且能够抑制NK功能和促使从正常单核细胞生成骨髓源抑制细胞。 这些数据连同肿瘤可能来源的外来体可以在癌症患者的血浆和肿瘤渗漏中大量存在这一可复现证据支持了肿瘤外来体在影响宿主微环境以允许肿瘤细胞生长和发展中的作用。考虑到对外来体在癌症发展中的作用理解的深入以及对发现新治疗、改善对肿瘤恶性程度以及生长的诊断和随访的需求不断提高的这一事实，因此需要检测和测定人体液中外来体的方法和工具。然而，事实上目前用于检测外来体的方法不是非定量的(TEM)，就是定量性较差(WB)。尽管流式细胞术已用于定量外来体，但该方法不能进行研究人员需要的精确测定。事实上，虽然FACS (荧光激活细胞分选法)分析是定量细胞(即使是小尺寸细胞)的合适方法，但是它不适合于对这些小囊泡(即50-100nm)的量进行定量。此外，总平均荧光的粗略测定不能对给定样品中存在的微泡数量进行精确定量。此外，FACS分析不允许同时分析不同的样品。因此，需要对来自少量体液的外来体进行检测和定量的方法。此外，考虑到癌症早期诊断对疾病治疗至关重要这一事实，需要潜在的肿瘤标志物和预后因子。发明简述获得有关外来体的有用体内数据的主要问题为从人体液(特别是从血浆)获得外来体以对其进行定量和表征的目前可用方法的效率水平较低。所述体液也可以是腹水、脑脊液、骨髓、尿液、粪便或支气管肺泡洗液。为了提供目前所面临的这些问题的解决方案，本发明公开提供了对来自体液(特别是来自人血浆)的外来体进行检测和定量的简单可靠的方法。根据本发明公开，基于ELISA的检测(称为hoTest)允许对来自健康供体和肿瘤患者人血浆的外来体进行定量和表征。通过该测试，有可能对来自移入人黑素瘤或结肠癌细胞的SCID小鼠以及肿瘤患者的血浆的外来体样微泡进行表征。本发明公开显示血浆外来体水平与肿瘤大小直接相关，并且仅在从肿瘤患者血浆纯化的外来体中可检测到窖蛋白-1。根据本发明公开，人患者血浆中肿瘤外来体的检测在人恶性肿瘤的诊断和随访中是有用的。本文公开的技术允许进行在肿瘤诊断、随访和筛选的临床实践中有用的非侵入性测试。根据本发明公开所述的技术还在肿瘤的临床研究中有用。此外，正如已知可以在细胞释放的外来体内或在血浆中检测到一些病毒(例如，HIV和HCV)以及朊病毒，本发明公开所述的技术还可以用于表征和研究其它疾病，如病毒、传播性和自身免疫性疾病。此外， 基于在外来体上表达的蛋白(例如，肿瘤标志物、病毒蛋白、朊病毒蛋白)，本发明提供了改善现有临床测试的工具。本发明的原理基于两个要点1.先前技术中没有使得能够对外来体进行定量和表征的方法，特别是对通常在人血浆样品中获得的少量外来体。2.在多种人类疾病状况(特别是癌症)中对非侵入性诊断和/或预后测试尚未满足的需求。因此，本发明的目标是提供定量和表征外来体的方法，特别是定量和表征少量(in small volumes)夕卜来体的方法。本发明的另一个目标是提供定量和表征血浆样品中外来体的方法。本发明的另一个目标是提供测定少于2ml的体液中外来体水平以及对外来体的蛋白组成进行基本完全表征的方法。此外，本发明的目标是提供同时定量几个样品中外来体的方法。另外，根据本发明公开所述的测试表明血浆中外来体的数量与肿瘤大小有关。因此，本发明的另一个目标是提供随访以及提供癌症患者预后的方法。此外，本发明的目标是提供测试以建立血浆外来体的细胞来源并评价其中是否存在一些传染性(HIV、HCV)和/或传播性(transmissible)试剂(例如，朊病毒蛋白)。
图1.从人黑素瘤细胞培养物上清液中纯化的外来体的检测。A.用于外来体检测和定量的Ex0Test(ELISA)装置示意图。B.通过ExoTest对纯化的⑶63+外来体进行剂量递增分析。初始浓度相当于50 μ g外来体，并且将外来体以2倍稀加入。C.在从人黑素瘤细胞(Me501)培养上清液纯化的不同量的外来体中的⑶63、 Rab5b和Lamp-I表达的蛋白质印迹分析。D.在从Me501细胞上清液纯化并涂覆至乳胶珠的黑素瘤来源的外来体中的Ral^b 和⑶63表达的FACS分析。图2.移入人黑素瘤的SCID小鼠的血浆外来体的检测。A.通过ExoTest对从移入人黑素瘤细胞的SCID小鼠的血浆中纯化的肿瘤外来体进行的剂量递增分析。B.在从移入人黑素瘤细胞(Me501)的SCID小鼠血浆纯化的外来体中进行的 Rab-5b和CD63表达的FACS分析。C.在肿瘤生长的不同时间分析的移入Me501的SCID小鼠中的血浆外来体水平与肿瘤大小的相关性。每个时间点用5只动物表示小鼠组。外来体水平表示为0D450X1000。图3.外来体中窖蛋白-1 (Cav-I)表达的表征A.人黑素瘤细胞和巨噬细胞的细胞提取物和外来体中Cav-I的蛋白质印迹分析。B.从Me501细胞、移入Me501的SCID小鼠血浆以及肿瘤阴性SCID小鼠血浆纯化的外来体中⑶64、Rab-5b和Cav-I的蛋白质印迹分析。C.从移入了 Me501的SCID小鼠血浆纯化的外来体中Cav-Ι表达的FACS分析。D.来自携带黑素瘤并在移入后5周处死的SCID小鼠的⑶63+和Cavl+外来体的血浆水平。图4.来自黑素瘤患者的血浆中的外来体的定量。使用⑶63 (A)或窖蛋白-1⑶作为检测抗原，通过ExoTest对从健康供体和黑素瘤患者的血浆纯化的外来体进行定量。用箱线图示表示数据每个箱中的水平线和垂直线分别表示中位数和第一四分位数-第三四分位数。黑点表示离群值。外来体水平表示为 0D450X 10000。通过曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)评价了组间差异。图 5.未分离(unfractioned)样品的 ExoiTest (Elisa)测试A.与人巨噬细胞、黑素瘤细胞的未分离培养上清液(50ml)以及黑素瘤患者的血浆相比，测定了纯化的外来体(50yg蛋白)中可检测外来体的量。数据表示为平均值 +/-SD。B.在患者(ri = 9，实心菱形)和健康供体(ri = 4，空心菱形)的纯化的或未分离的血浆样品中测定的CD63+外来体的血浆水平的回归分析。外来体水平表示为0D450X 1000。图6.黑素瘤患者血浆中外来体的定量使用CD63或如gplOO和MART-I的典型黑素瘤蛋白作为检测抗原，通过ExoTest 对从黑素瘤患者(MEL)和健康供体(HD)血浆纯化的外来体进行定量。数据表示为平均值士 SD。外来体水平表示为0D450X1000。发明详述外来体是大小介于30-120nm之间的微泡，通过正常细胞以及肿瘤细胞将其活跃地分泌到胞外环境中。考虑到对外来体在癌症发展中的作用理解的深入以及对发现新治疗、改善对肿瘤恶性程度以及生长的诊断和随访的需求不断提高的这一事实，因此需要检测和测定人体液中外来体的方法和工具。由于通过一系列对肿瘤微环境有害的作用外来体潜地参与了疾病发展的促进，因此通过灵敏、特异并且可行的测定对人血浆或血清中外来体进行定量的可能性成为关键问题。如果这种测定可用，则它将成为评价这些微泡在癌症预后中潜在作用的基础工具以及作为检测或监测肿瘤性疾病的新型预后因子或标志物。但是，目前使用的方法(例如TEM和WB)不能定量或者定量性较差，借此明确地需要定量检测和测定人体液中外来体的方法。因此，本发明公开的目标是为临床肿瘤学家提供诊断癌症患者并对其进行随访研究的新型工具。此外，本发明公开的目标是提供用于诊断其它人类疾病的新方法，如病毒或朊病毒疾病，其中颗粒在微泡中传播。本文公开的新型定量测试是基于ELISA介导的外来体检测，并且它是第一个简单、灵敏并且可靠的外来体定量测试。通过本方法检测的蛋白不是外来体特异性的，而是仅由如内涵体和溶酶体的胞质细胞器共有的，这些细胞器的膜不会作为质膜结构回收利用。 该特征排除了检测坏死肿瘤细胞来源的碎片上的这些蛋白或它们的溶解形式的可能性。本发明公开的测定优选地包括通用肿瘤标志物(窖蛋白1)，其允许优先检测肿瘤分泌的外来体。通过以下实施例中所述的不同比较性方法(蛋白质印迹(Western blotting)和流式细胞术)以及不同实验条件进行的一系列综合研究，证明了本发明公开的新型测试的可靠性。本发明公开的新型方法是基于我们称为ExoTest的夹心ELISA测试，其基于持家蛋白(CD63和Rab-5)以及肿瘤相关标志物窖蛋白_1的表达对血浆外来体进行捕获和定量。ExoTest使用抗-Ral^抗体捕获纯化的外来体制备物中存在的外来体。作为检测抗体，ExoTest使用识别外来体抗原(CD63)或由外来体的细胞来源表达的其它抗原如窖蛋白-1 (与肿瘤转移行为有关的蛋白)的抗体。在第一组实验中，我们使用了来自人肿瘤细胞系培养基的外来体制备物，并且将ExoTest的结果与通过蛋白质印迹和FACS获得的那些结果进行比较。结果表明使用所有三种方法时，外来体制备物中的典型外来体抗原均为可检测的。然而，与FACS或WB(蛋白质印迹)分析相比，ExoTest允许对具有更少量起始材料的相同制备物中的外来体和更广泛的蛋白组进行定量分析。当对血浆样品进行分析时，该技术特征极其重要。实际上，使用WB时，对移入人黑素瘤或结肠癌细胞的SCID小鼠的血浆混合物的分析经常是不可重复的或者至少是很难重复的，但是ExoTest允许对人肿瘤-SCID 小鼠血浆中的外来体水平进行定量分析。新颖且重要的发现是，基于ExoTest结果，血浆中的外来体水平与肿瘤大小显著相关并且在移入后随时间增加。此外，循环的外来体连同典型的蛋白呈现出由在小鼠中生长的人肿瘤表达的肿瘤标志物(未显示)。因此，使用CD63作为检测抗原的ExoTest能够对黑素瘤患者和健康受试者的血浆中的外来体进行定量。由于肿瘤细胞分泌大量外来体，因此未发现黑素瘤患者和健康对照人的血浆中CD63阳性外来体水平之间的差异的确令我们感到吃惊。为了鉴别可能的肿瘤特异性外来体，我们使用窖蛋白-1作为检测抗原进行了 ExoTest。最近的出版物已报道了循环的窖蛋白-1的血浆水平与转移性前列腺腺癌显著相关。有趣的是，窖蛋白-1已经参与了致癌细胞转化的病理发生、肿瘤发生和转移。首先，我们通过FACS和WB证明窖蛋白-1存在于从移入肿瘤的SCID 小鼠和肿瘤患者的血浆纯化的人肿瘤来源的外来体中。然后，通过使用ExoTest，我们能够观察到与健康个体的血浆相比，肿瘤患者中窖蛋白-1阳性外来体的血浆水平显著提高，这表明窖蛋白-1可能代表了特异性肿瘤标志物，并且ExoTest是定量这种提高的成功测试。总之，结果表明检测外来体的ExoTest能够发挥作用并且对人循环外来体的检测和定量可用。此外，该测试提供了检测血浆外来体制备物中不同蛋白的可能性，其对于特定类型的肿瘤患者具有潜在的应用。本发明公开还提供了基于血浆外来体定量和表征的用于肿瘤患者的新型预后/诊断工具。这与黑素瘤患者特别相关，因为灵敏并且可靠的血清标志物仍然有限并且LDH(乳酸脱氢酶)水平仍然是用于评价疾病过程和预后的唯一预后性血清因子。以下详细说明了本发明。公开了实施例和实验的细节以便为本领域技术人员提供更多的理解和指导。本发明的范围由随附的权利要求确定。
实施例实施例11.外来体的来源A.细胞培养上清液我们使用了两类人肿瘤细胞系，即黑素瘤和结肠癌。Mel 501和Mel BS是通过手术切除(Istituto Nazionale del Tumori，Milan，Italy)从患者黑素瘤损伤部位获得的两种转移性黑素瘤细胞系。我们还使用了两种结直肠癌细胞系Colo206(从结直肠癌患者的肝转移中产生)和 1869 col (由 IstitutoSuperiore di Sanita，的 Maccalli 博士提供)。 所有细胞系均在RPMI 1640培养基上培养，其中添加了 100IU/ml青霉素、ΙΟΟμ g/ml链霉素 (Gibco)、2mM 谷氨酰胺 I (Gibco)和 10% 胎牛血清(FCS) (Invitrogen, Milan, Italy)。使用 CD14 磁珠(Milteny Biotec, Germany)和 GM-CSF(500U/ml)培养 5 天，从健康血液供体的白细胞层获得了人单核细胞源巨噬细胞(MDM)。B.人肿瘤SCID-小鼠血浆使用4-5 周龄的 CB. 17 SCID/SCID 雌性小鼠(Harlan，S. Pietro al Natisone, Italy)并且将其保持在特定的无病原体的条件下。根据MCCR准则执行所有动物程序。将 SCID小鼠饲养在小型隔离笼中，并且所有食物、水和草垫在使用前高压灭菌。在小鼠右侧皮下注射人黑素瘤或结肠癌细胞，每只小鼠注射2. 5 X IO6个细胞。用卡尺测定肿瘤生长并且如前所述(Luciani L等人，J. Natl. Cancer Inst.，2004)根据以下公式估计肿瘤重量肿瘤重量(mg)=长度(mm) X宽度2(mm)/2。使移入的肿瘤生长至500mg重，并且从在肿瘤生长不同时间点处死的不同动物中收集移入肿瘤的小鼠的500 μ 1血浆。C.人供体和肿瘤患者的血浆从来自患有原发性或转移性黑素瘤的患者以及年龄和性别相当的健康供体并经过EDTA处理的全血中收集人血浆样品。将样品储存于-70°C直至分析。2.体外和体内外来体的制备从T-175烧瓶中7 汇合的细胞培养物中收集人黑素瘤和结肠癌细胞系的上清液，并且按照先前的说明(Andreola等人，J.Exp. Med. 2002)稍加修改进行微泡分离。简而言之，在300Xg离心10分钟使细胞成颗粒之后，将上清液在1200Xg离心20分钟，接着在 IOOOOXg 离心 30 分钟。使用 0. 22 μ m 滤器(Stericup , Millipore Corp.，Bedford, Massachusetts,USA)过滤该上清液，然后在Beckman超速离心机(Beckman Coulter)中以 IOOOOOXg离心1小时从而使外来体成颗粒。用大量磷酸盐缓冲液(PBQ清洗一次后，将外来体悬浮于少量PBS中或悬浮于适当的裂解缓冲液中，并将其储存于-80°C直至进一步实验分析。为了从血浆样品中获得外来体，将来自移入人肿瘤的SCID小鼠或来自肿瘤患者和健康供体的肝素化血液在400Xg离心20分钟。然后收集血浆、将其分成等份并储存于_70°C直至分析。使用对小体积进行超速离心的Beckman TL100对血浆样品进行如上所述的相同离心程序以分离外来体。3.外来体的流式细胞术分析在结合于乳胶珠的纯化外来体上通过流式细胞术分析确定了外来体上的抗原表达。将外来体制备物(5-10 μ g)与5μ 1直径4μπι的醛/硫酸盐乳胶珠(Interfacial Dynamics, Portland, OR) —同培育，并重悬浮于含有2 % FCS的400 μ 1 PBS中。将外来体涂覆的珠(20 μ 1)在4 °C与下列抗体培育30分钟抗_Rab5 (Santa Cruz)、 抗-CD63-FITC (Pharmigen)、抗-CD81-PE (Pharmingen)、抗窖蛋白 _1 (N-20 克隆，Santa Cruz)，然后，如果需要，与PE-或FITC-偶联的二抗一同培育并在FACSCalibur流式细胞仪 (BDBiosciences)上进行分析。4.外来体的蛋白质印迹分析在含有Triton X_100、0. 1 % SDS、0. IM Tris HCl (pH 7)和蛋白酶抑制剂 (10 μ g/ml抑肽酶、10 μ g/ml亮肽素和2mM苯甲磺酰氟)(Sigma)的裂解缓冲液中裂解纯化的外来体。通过Bradford微测定方法(Bio-RadLaboratories,Hercules, CA)确定外来体蛋白的浓度。将总计50 μ g的蛋白重悬浮于SDS样品缓冲液并煮沸5分钟，在10 %的SDS-PAGE 凝胶上分离并在硝酸纤维素上进行电转染(Protran BA85, Schleicher and Schuell)。将膜与⑶63 (1 50稀释)和Rab-恥(1 50稀释)的抗体进行印迹反应，用适当的HRP偶联二抗(Amersham Pharmacia)培育并通过增强化学发光法显像(ECL，Pierce)。5.开发用于外来体的ELISA测试(ExoTest)根据本发明公开的新型ELISA测试(ExoTest)是基于外来体中存在的特异性蛋白。如内涵体和溶酶体的胞质细胞器共有这些蛋白(分别为Rab-5和CD63)，所述细胞器的膜不像质膜结构一样会脱落或重利用，因此排除了存在来源于膜破裂的结构的可能性。将96 孔板(Nunc, Milan, Italy)用多克隆抗 _Rab_5b 抗体(A-20 克隆，Santa Cruz)包被，每孔加入100 μ 1 WpH 9. 6的碳酸盐缓冲液，其中所述抗体的最终浓度为 4yg/ml，将该孔板在4°C培育过夜。用PBS清洗3次后，每孔加入100 μ 1的封闭溶液(含有0. 5% BSA的PBS)并在室温下保持1小时。用PBS清洗3次后，加入50 μ g纯化的外来体(最终体积为100 μ 1/孔)并在37°C培育过夜。用PBS清洗3次后，用封闭溶液将适当的检测抗体(抗-CD63单抗(H5C6克隆，Pharmingen)或抗窖蛋白_1单抗(2297克隆， Pharmingen))稀释为4 μ g/ml，每孔为100 μ 1，并将其在37°C培育1小时。用PBS清洗3 次后，在室温下将该板与用封闭溶液1 50000稀释的ΙΟΟμΙ HRP-偶联抗-小鼠过氧化物酶二抗(Pierce,Milan, Italy) 一同培育1小时。用PBS清洗最后3次后，用POD (Roche Applied Science, Milan, Italy)使反应显色，并用IN的H2SO4封闭，使用450nm的滤光器 (Biorad)通过ELISA读数仪记录光密度。实施例2ExoTest提供了对细胞培养制备物中所存在外来体的定量并且与蛋白质印迹分析相比，它具有更高的外来体蛋白检测灵敏度。
根据标准程序处理黑素瘤和结肠癌细胞系的培养上清液以获得如上所述的纯化外来体。对通过差速离心从细胞培养上清液中获得的外来体制备物进行建立以检测外来体的夹心ELISA (ExoTest，见图1A)。ExoTest能够提供对细胞培养上清液中所存在外来体的定量，从而使CD63+外来体以剂量依赖的方式可检测(图1B)。以来源于IOOOOg离心后所获得颗粒的部分、仅从细胞培养基纯化的外来体以及仅以二抗为代表的阴性对照产生了几乎不可检测的光密度(0D = 0. 07+/-0. 01)。对在三个不同平板上进行的相同制备物的6个重复计算了检验内和检验间差异，并且分别为30%和35%。相同的纯化外来体制备物的蛋白质印迹和FACS分析确认了通过ExoTest获得的定性数据。事实上，通过外来体裂解物中的WB，Rab-5b、Lamp-I以及在较少程度上的⑶63 蛋白均在多种外来体制备物中是可检测的(图1C)而通过对结合于乳胶珠上的外来体进行的FACS, Rab-5b和CD63是可检测的(图1D)。但是，相对于WB分析，通过ExoTest进行的外来体检测和定量对CD63蛋白的检测表现出更高灵敏度(图1C)。确实，通过WB正确检测 ⑶63或Rab-恥需要至少12. 5μ g外来体蛋白，而ExoTest能够以最少3μ g的纯化外来体制备物的量明确地检测外来体。实施例3通过FACS、WB和Exokst获得的移入人肿瘤的SCID小鼠的体内外来体制备物的定性和定量结果的比较为了验证使用ExoTest进行人肿瘤源外来体体内检测的可能性，我们首先进行了向SCID小鼠皮下注射人黑素瘤(Me501)和结肠癌细胞系的实验。在第一个实验中，将从携带移入肿瘤(100-500mg)的SCID小鼠处死时获得的血浆样品进行外来体纯化程序。与从细胞培养上清液纯化的外来体一样，通过ExoTest (图2A)和FACS (图2B)也能够清楚并且特异地检测从小鼠血浆纯化的外来体。从对照SCID小鼠(未移入人肿瘤)的血浆获得的外来体制备物所产生的背景光密度与空白样品相当(0D = 0. 08士0. 03)，因此表明在免疫缓和的动物中不存在外来体，或者小鼠外来体与人CD63和Rab-恥不产生交叉反应。再次， 为了获得与使用WB分析相当的结果，ExoTest所需的外来体制备物的量显著较少。证明可以通过ExoTest回收并检测人外来体后，为了评价人肿瘤-SCID小鼠中血浆外来体的量是否与肿瘤负荷相关，我们进行了时程实验。在这些实验中，使黑素瘤肿瘤在早期移入后生长达5周，从移入后第14天开始并且在随后的3周内，从各个动物的血浆纯化并定量外来体。结果显示ExoTest所检测的人外来体的量随时间平行于肿瘤大小的增加而增加(图2C)；这表明血浆外来体的定量是监测肿瘤生长的重要方法。使用MeBS细胞获得了相似的结果(未显示)。实施例4肿瘤外来体表达窖蛋白-1由于已知外来体代表了细胞间交流的重要并且特异的途径，因此我们推断肿瘤源外来体可能与正常生理条件下的循环外来体不同。最近已报道了从前列腺癌PC-3细胞系分离的前列腺小体(由前列腺癌细胞分泌的膜囊)含有窖蛋白-1蛋白，它是细胞膜穴样内陷的主要成分。另外还已知与健康受试者相比，前列腺癌患者中窖蛋白-1的血清水平升高(Tahir，2003 #21)。但是，现有技术均未表明该蛋白与血液中的膜囊的关系。因此，我们评价了从移入黑素瘤肿瘤的SCID小鼠的血浆中获得的外来体上是否存在窖蛋白-1。如
10图3A上结果所证明的，Cavl在人黑素瘤细胞体外分泌的外来体上强烈表达，而在细胞提取物和来自正常人细胞(如，例如原发性单核细胞源巨噬细胞(MDM))的外来体上检测不到。 这些结果表明以外来体包埋形式分泌的Cal可能是黑素瘤细胞的特异性特征，因此代表了肿瘤源外来体离体分析的潜在标志物。因此，我们研究了从移入黑素瘤肿瘤的SCID小鼠的血浆中获得的外来体上是否存在Cavl。通过蛋白质印迹(图3B)、流式细胞术(图3C) 和ExoTest (图3D)，在来源于移入黑素瘤肿瘤的SCID小鼠血浆的外来体制备物中检测了 Cavl，而在对照动物血浆源外来体中未检测到Cavl (图!3B、3D)。与黑素瘤和结直肠癌(CRC) 患者的结果一致，通过ExoTest可以使用其它肿瘤标志物(如，黑素瘤的MelanA/Mart-Ι和 CRC的CEA)检测带有肿瘤的SCID小鼠中肿瘤外来体的体内释放，其结果与通过Cavl获得的结果相当。但是，由于黑素瘤表达的MelanA/MART-Ι可能是不均勻的或表达量较低(特别是在转移水平时)，并且CEA主要以溶解形式存在于CRC患者的血清中，因此Cavl是更可靠并且可重复的肿瘤标志物。因此，在进一步包括抗-Cavl-特异性抗体的情况下发展了 ExoTest0实施例5通过ExoTest对肿瘤患者血浆的体内外来体制备物进行定量以血浆中外来体的量作为预后工具从人肿瘤-SCID小鼠模型中获得的数据促使我们研究了 ExoTest是否也能够检测和表征从人血浆纯化的外来体。如果有可能进行定量，那么我们的目标是验证肿瘤患者的循环血浆外来体在数量和/或质量上是否不同于健康供体血浆中的那些外来体。从肿瘤患者(n = 62)和健康供体(n = 37)的血浆中纯化了外来体，然后对其进行ExoTest和蛋白质印迹以确定是否存在Rab5和⑶63。表1示出了基于⑶63和Cavl表达通过ExoTest进行的外来体定量。表1.研究群组中血菜外来体和LDH水平。CD63+和Cav Ι+exo为用0D450X 1000 表示的血浆外来体。血浆LDH值表示为IU/L。数据用平均值表示(95% C. I.)
CD63+Cavl+exoLDH黑素瘤患者(n = 62)478(390 至 566)524(458 至 590)438(321 至 555)健康供体(n = 37)236(188 至 285)213(180 至 246)360(240 至 480)ExoTest测试允许对从黑素瘤患者和健康供体的血浆纯化的外来体中的外来体蛋白进行检测(图4A)，与健康供体相比，黑素瘤患者血浆中的外来体水平高达四倍(ρ < 0. 001)。为了确定基于检测两种外来体蛋白标志物的ExoTest的灵敏度和特异性，我们计算了表达⑶63和Cavl的血浆外来体的截止值(健康供体样品中的平均值+/-2SD)，其分别为526和411 (0D450X 1000)。ExoTest对CD63+外来体的检测表现出低灵敏度(36% ) 和良好的特异性(97. 3% )，而ExoTest对Cavl+外来体的检测具有较高的灵敏度(62% ) 和相似的特异性(97. 3% )。与该观察一致，黑素瘤患者中Cavl+外来体的血浆水平显著高于⑶63+外来体的水平(P = 0. 04)。这些结果表明i)循环Cavl可能与黑素瘤患者中的外来体有关；和ii)可以认为带有Cal的血浆外来体的定量是有用的肿瘤标志物。另外，我们发现血浆LDH即不与⑶63+血浆外来体相关也不与Cavl+血浆外来体相关，而在⑶63+和Cal+血浆外来体之间观察到了显著的相关性(史匹曼系数(Spearman coefficient)为0. 25，P = 0. 04)(图4C)。此外，ExoTest揭示了在癌或黑素瘤患者的血浆中存在肿瘤抗原，如MART-I或CEA (图6)。分析中所包括的多数患者(62位中有57位)受到晚期疾病(III-IV期)的影响。 通过ExoTest检测了所有疾病阶段中血浆外来体水平的广泛分布，其表明不同患者外周循环中存在的外来体量的变化可能反映不同的肿瘤侵袭性水平，并且因此可能成为黑素瘤的新型独立预后因子。美国癌症联合会(AJCC)所指明的其它预后因子包括原发性黑素瘤厚度和溃疡、转移性淋巴结数目以及远处转移的位点和数目，如本发明公开的结果所表明的， 它们也可能与外来体血清含量相关。实施例6全血浆可以用于外来体定量ExoTest用于临床目的的潜在应用促使我们验证了 ExoTest是否可以用于未分离生物液体中外来体的检测，这将允许进行简单并且可重复的分析以避免超速离心步骤。 因此，我们比较了来自未分离样品(人巨噬细胞和黑素瘤细胞的细胞培养上清液以及人血浆)的CD63+外来体以及从相同样品纯化的外来体的检测和定量。为了提高测试的灵敏度，对于这些特定的实验，将HRP-偶联的单抗培育30分钟而不是15分钟。如图5A所示， ExoTest可检测来自未分离的巨噬细胞和黑素瘤培养上清液以及来自9位黑素瘤患者血浆的外来体的存在性。此外，我们对来自4位健康供体的血浆进行了相同的分析，并且所分析的全部样品(9位患者+4位健康供体)的回归分析显示在这两种类型的测定之间存在显著的相关性(图5B)。这些结果表明了 ExoTest在临床环境中的潜在应用，其能够使用全血浆并避免复杂且耗时的外来体纯化程序。参考文献Thery C, Zitvogel L, Amigorena S. Exosomes !composition, biogenesisand function. Nat Rev Immunol. 2002 Aug ；2 (8) :569-79.Stoorvoge 1 W, Kleijmeer MJ, Geuze HJ, Raposo G. The biogenesis andfunctions of exosomes. Traffic. 2002 May ；3 (5) :321-30.Lamparski HG, Metha-Damani A, Yao JY, Patel S, Hsu DH, Ruegg C, LePecq JB. Production and characterization of clinical grade exosomes derivedfrom dendritic cells. J Immunol Methods. 2002 Dec 15 ；270 (2) :211-26.Wubbolts R, Leckie RS, Veenhuizen PT, Schwarzmann G, Mobius W, Hoernschemeyer J, Slot Jff, Geuze HJ, Stoorvogel W. Proteomic andbiochemical analyses of human B cell-derived exosomes. Potential implicationsfor their function and multivesicular body formation. J Biol Chem. 2003 Mar28 ；278(13) 10963-72.Blanchard N,Lankar D,Faure F,Regnault A,Dumont C,Raposo G,HivrozC. TCR activation of human T cells induces the production of exosomes bearingthe TCR/ CD3/zeta complex. J Immunol. 2002 Apr 1 ； 168 (7) :3235-41.
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30531权利要求
1.定量和定性人细胞源样品中或体液中外来体的方法，所述方法包括以下步骤a)从所述人细胞源样品或体液纯化外来体制备物；b)用一抗捕获所述纯化的外来体制备物中的外来体；c)用检测抗体检测结合的外来体；d)使酶联二抗与所述检测抗体反应；e)加入底物；和f)检测所述反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述体液为人血浆样品、腹水、脑脊液、骨髓、尿液、粪便或支气管肺泡洗液。
3.根据权利要求2所述的方法，其中使用的所述体液的体积为少于^iil。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一抗为抗-Rab恥抗体。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测抗体为抗-CD63或抗窖蛋白-1。
6.监测肿瘤生长的非侵入性方法，所述方法包括下列步骤a)定期获取患者的体液样品；b)从所述样品纯化外来体制备物；c)用一抗捕获所述纯化的外来体制备物中的外来体；d)用检测抗体检测结合的外来体；e)使酶联二抗与所述检测抗体反应；f)加入底物；g)检测所述反应；和h)获得所检测的外来体数量与肿瘤大小之间的相关性。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述一抗为抗-Rab恥抗体，而所述检测抗体为抗-⑶63或抗窖蛋白-1。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述肿瘤为黑素瘤肿瘤。
9.通过使用根据权利要求1所述的方法检测带有窖蛋白-1的外来体以诊断肿瘤的方法，其中所述检测抗体为抗窖蛋白-1。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述肿瘤为黑素瘤肿瘤。
11.用于定量和定性人细胞源样品中或体液中外来体的检测试剂盒，所述试剂盒包括a)从人细胞源样品或从体液纯化外来体制备物的说明书；b)用于捕获所述纯化的外来体制备物中外来体的一抗制备物；c)用于检测结合的外来体的检测抗体制备物；d)用于与所述检测抗体反应的酶联二抗制备物；和e)所述酶的底物。
12.根据权利要求11所述的检测试剂盒，其中所述一抗为抗-Rab恥抗体，而所述检测抗体为抗-⑶63或抗窖蛋白-1。
13.确定循环外来体中是否存在传染性和/或传播性试剂的方法，所述方法包括以下步骤a)从人细胞源样品或从体液纯化外来体制备物；b)用一抗捕获所述纯化的外来体制备物中的外来体；c)用检测抗体检测结合的外来体；d)使酶联二抗与所述检测抗体反应；e)加入底物；和f)检测所述反应。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述传染性试剂为HIV或HCV病毒蛋白。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述传播性试剂为朊病毒蛋白。
全文摘要
本发明公开提供了通过使用夹心ELISA测试捕获、检测、表征和定量少量人体液中人外来体的方法。该方法允许对外来体制备物进行完全表征，因此提供了通过使用非侵入性测定区分疾病相关状况与健康状态的工具。事实上，该方法可用于使用简单血浆样品进行的肿瘤筛选、诊断和预后。同时，循环外来体的测定可以提供有关患者中存在的肿瘤水平的信息。本文提供的方法适合于评价在循环外来体中是否存在一些传染性和/或传播性试剂，如病毒蛋白或朊病毒蛋白。
文档编号G01N33/53GK102317778SQ200980111452
公开日2012年1月11日 申请日期2009年1月26日 优先权日2008年1月25日
发明者M·洛戈齐, S·法伊斯 申请人:汉萨生物医药公司