用于感测化学品的方法

专利名称：用于感测化学品的方法
技术领域：
本发明涉及用于感测化学品的方法，尤其涉及利用包含压电/热电换能器的化学 感测设备进行免疫测定。
背景技术：
免疫测定是测量生物流体中被分析物存在与否，或者更通常地测量被分析物浓度 的测试。它通常涉及抗原对抗体的特异性结合。抗体可以是多株或者单株的，单株抗体具 有许多益处，包括生产可再现性以及对被分析物一个表位结合的抑制。为了提供被分析物 浓度的可量化测度，将应答与已知浓度的标准样品相比较。抗体或抗原的浓度可由多种方 法确定，虽然最常用的一种方法是标记抗原或抗体并且检测标记的存在。免疫测定可以是竞争性或者非竞争性的。在竞争性免疫测定中，未知样品中的抗 原与被标记抗原(报告物)竞争以与存在的抗体相结合。随后测量结合至抗体位点处的被 标记抗原的量。显然应答将与未知样品中抗体的浓度成反比。在非竞争性免疫测定(也被 称为免疫分析测定)中，未知样品中的抗原在存在过量的被标记抗体时与捕获抗体结合， 由此形成“三明治”并且测量该“三明治”中被结合抗原的量。与竞争性方法不同，非竞争 性方法的结果将与抗原浓度直接成比例。在典型的竞争性免疫测定中，所关注抗原特异性的抗体固定至(即，附着)在聚合 物支持物上，诸如聚苯乙烯的薄片上。待测试一滴样品(例如，细胞提取物或者血清或尿的 样品)置于该薄片上。此外，已知量的报告物(即，被标记)抗原也被添加至该样品。然 后，被标记和未被标记的抗原竞争以与固定聚合物支持物的抗体结合。在形成抗体-抗原 复合物之后清洗该聚合物支持物。确定结合至该薄片的报告物抗原的浓度。来自报告物抗 原的信号于是与样品内的抗原数量成反比。这种测定以及这种类型测定的其他变化众所周 知，参见例如"The Immunoassay Handbook, 2nd Ed. ” David Wild, Ed. ，Nature Publishing Group,2001o这种免疫测定的一个变体是所谓的“置换免疫测定”。在此类测定中，报告物抗原 被预附至存在于聚合物支持物上的抗体。随后将未知抗原添加至系统并且该抗原从所述支 持物表面置换所述报告物抗原。报告物抗原的损失被确定并且等于样品中未知抗原的浓 度。然而，报告物抗原置换测量太不直接。例如，Giese等人(US 4, 801,726)描述了一种类似的操作。在一种所谓的“打了 就跑(hit-and-run) ”免疫测定中，预结合至一固定抗原体积的荧光标记抗体在一等分样品 被添加到流经该体积的含水流时被置换。如果该等分样品包含被分析物，那么报告物抗体 的一小部分被置换并在下游流出物中被荧光测得。这被设计为“重复”免疫测定，重复使用 同一体积多次。这一概念已针对连续筛查和极不稳定的爆炸检测而有所发展。Ligler等人 (US 5，183，740)描述了一种极为类似的用于TNT的基于荧光检测体积的系统。同一组人对 其进行了进一步的研究，至基于膜的系统(US 6, 750,031以及Rabbany等人Biosensors & Bioelectronics 1998，13,939-944)。在所有这些实例中，在体积或膜内发生免疫置换并且
4在下游仪器内进行检测。Herron等人(US 6，979，567)描述了在竞争性免疫测定中使用全内反射荧光检测 器，包括检测从浸透表面置换被分析物。V. I.Chegel等人Sensors Actuators B 1998,48, 456-460 和 P. T. Charles 等人 Anal. Chim. Acta 2004，525，199-204 描述了使用荧光 / 化学 发光方法检测报告物种类的置换测定。然而，本领域仍然需要一种更为直接的检测方法。

发明内容
因此，本发明提供一种用于检测样品中的被分析物的方法，包括以下步骤提供包含热电或压电元件和电极的换能器、固定在换能器上的第一试剂、以及可 释放地结合第一试剂并且具有附至其上的标记的第二试剂，其中所述换能器能够将能量变 化转换成电信号，所述标记能够吸收电磁辐射以生成非辐射衰减的能量，并且其中第一试 剂或者第二试剂具有允许彼此结合并且能够优先结合被分析物或被分析物衍生物的结合 位点；将换能器暴露于样品，由此允许被分析物或被分析物衍生物与所述结合位点结合 并且置换所述第二试剂；用电磁辐射照射样品；将所生成的能量转换为电信号；以及检测所述电信号。本发明还提供用于检测样品内被分析物的设备，包括具有热电或压电元件和电极并且能够将能量变化转换成电信号的换能器；固定在换能器上的第一试剂；可释放地结合第一试剂并且具有附至其上的标记的第二试剂，其中所述标记能够 吸收电磁辐射以生成非辐射衰减的能量，并且其中第一试剂或者第二试剂具有允许彼此结 合并且能够优先结合被分析物或被分析物衍生物的结合位点；电磁辐射源；以及用于检测电信号的检测器。本发明还提供具有热电或压电元件和电极的换能器的用途，用于监测置换免疫测 定中被标记的试剂。


现在将参考附图描述本发明，其中图1示出了根据W0 2004/090512的设备；图2-4示出了本发明的方法的图形表达；图5示出了根据本发明的设备；以及图6和图7示出了使用本发明方法的针对两种测定的计数相对时间的图。
具体实施例方式本发明的方法提供用于检测样品中的被分析物。作为第一步骤，本发明包括提供具有热电或压电元件和电极的换能器，所述换能器能够将能量变化转换成电信号并将样品 暴露于换能器。这类换能器是本领域内周知的，参见例如W0 90/13017和W0 2004/090512。 在此方面，图1示出了适于在本发明中使用的化学感测设备1的原理。设备1依靠用电磁 辐射照射物质2时物质2中的发热。设备1包括热电或压电换能器3，它具有电极涂层4、 5。优选情况下，换能器3是极化聚偏氟乙烯膜。电极涂层4、5优选地由厚度大约35nm的 氧化铟锡形成的，尽管从lnm的下限至lOOnm的上限中的任何厚度都是可接受的，但是低于 下限时电导率太低，而高于上限时透光率太低(应当不低于95% T)。使用任何适宜的技术 使物质2保持在换能器3上或者接近换能器3，此处示出为固定在上电极涂层4上。所述 试剂可以是任何适宜的形式，并且可以淀积多种试剂。优选情况下，物质2被吸附在上电极 上，例如经由分子间力(比如离子键、氢键结合或范德瓦尔斯力)的共价耦合或结合。这种 设备的关键特征在于，在受到电磁辐射源6(比如光，优选情况下是可见光)的照射时物质 2发热。光源可以是例如LED。光源6用适当波长(如补色)的光照亮物质2。尽管不奢 望成为理论上的结合，但是据信物质2吸收光以产生激发态，然后经历非辐射衰减从而产 生能量，由图1中的曲线所示。这种能量的主要形式为热(即环境中的热运动)，尽管也可 能产生其他形式的能量，如冲击波。无论如何，此能量由换能器检测并转换为电信号。对本 发明的设备由测定的具体试剂标定，因此并不需要确定由非辐射衰减所产生能量的确切形 式。除非另外指明，否则本文所用的术语“热”意味着由非辐射衰减所产生的能量。光源6 被定为以照亮物质2。优选情况下，光源6定位成与换能器3和电极4、5基本垂直，并透过 换能器3和电极4、5照亮物质2。光源可以是换能器内的内光源，其中光源是导波系统。波 导可以是换能器本身，也可以是固定在换能器上的附加层。优选地，使用525nm波长，虽然 可以连同描述的有利属性(例如在W0 2007/107716中)使用其他合适的波长。物质2所产生的能量由换能器3检测并转换为电信号。电信号由检测器7检测。 光源6和检测器7都在控制器8的控制下。在一个实施例中，光源6产生一系列光脉冲(除非说明特定波长，否则本文所用的 术语“光”意味着任何形式的电磁辐射)，术语为“断续光(chopped light)”。在原理上， 单个闪光，即电磁辐射的一个脉冲，便足以从换能器3产生信号。不过，为了获得可再现的 信号会使用多次闪光，因此实际上需要断续光。施加电磁辐射脉冲的频率可以变化。在下 限处，脉冲之间的时延必须足以确定每个脉冲和电信号生成之间的时延。在上限处，每个 脉冲之间的时延必须不会大到使得记录所述数据所花时间变得不合情理地延长。优选情 况下，脉冲频率从2至50Hz，更优选情况下，5至15Hz，最优选情况下，10Hz。这分别对应于 20-500mS、66-200mS和100ms的脉冲间时延。此外，所谓的“脉冲间隔”比，即通信号与断信 号的比值，优选情况下是1，尽管可以使用其他比值而无有害后果。以不同调制频率或不同 脉冲间隔比产生调制光的电磁辐射源是本领域内公知的。检测器7确定光源6的每个光脉 冲与检测器7检测的来自换能器3的对应电信号之间的时延(或者说“相关延迟”)。申请 人已经发现，这种时延是距离d的函数。确定每个光脉冲与对应电信号之间的时延的任何方法只要提供可再现结果就都 可以使用。优选情况下，测量从每个光脉冲的起点到检测器7检测到与热吸收对应的电信 号的最大值点间的时延。因此，物质2可以与换能器表面分离并仍然能够检测到信号。另外，不但所述信号经过能够向换能器3传送能量的中间介质可检测，而且可以区分不同距离d(这已被称为术 语“深度剖析”)，所收到信号的强度与相距换能器3表面具体距离d处物质2的浓度成比 例。图2示出了在根据本发明的置换免疫测定中的图1设备1。在此实施例中，第一试 剂是抗体而第二试剂是被标记的被分析物。图2中示出了竖直排列的换能器3。如下将更 为详细地讨论这一排列的好处。换能器3涂有图2所示的第一试剂，作为抗体9 (被固定的 捕获抗体)。已产生抗被分析物10的抗体9 (参见图2b)，并且所述抗体9在样品被引入时 选择性地结合至被分析物10。换能器还具有被标记的被分析物11 (对应于图1中的物质 2)。被标记的被分析物11包括标记12，所述标记12则具有(可任选的经由连接体14)附 至其上的多个被分析物半分体13。用过量的被标记的被分析物11预培育抗体9。具有抗 体9层的换能器3随后典型地由保存剂层(未示出)覆盖并干燥。在此状态中，换能器可 被存储延长的时间段。使用中，如图2b所示，换能器被暴露于含有未知浓度的被分析物10的样品。被分 析物10迅速扩散至换能器表面并且从抗体9置换被标记的被分析物11，参见图2c。置换 通常会发生，这是因为被分析物具有比被标记的被分析物(第二试剂)更高的结合常数，即 被分析物具有相比于被标记的被分析物(第二试剂)的“附着(on)”反应速率更快的“附 着”速率，或者相比于被标记的被分析物的“脱落(off)，，反应速率更慢的“脱落”速率，或 者以上两者。所述反应使用换能器3以参考图1所述的方式实时监测。因为该测定可以在 除了在测定开始时存在于换能器表面上的试剂之外无需任何试剂的情况下执行，所以该测 定也被称为术语“无试剂的”。优选地，第一试剂和第二试剂是单独存在的试剂。图2c中示 出的测定是样品中存在高浓度被分析物时置换被标记被分析物的图示。图2d和2e分别示 出了被分析物浓度较低时的置换。这使得较少的被标记的被分析物11从换能器3的表面 释放。从表面释放的第二试剂自由扩散远离所述表面。虽然从表面移除第二试剂是容易的 (例如，在重力/浮力的作用下)，但是优选地允许第二试剂仅通过扩散与表面分离。本发明的方法允许在无需分离和清洗步骤的情况下实时检测被分析物10的结合 (尽管是间接通过检测被标记的被分析物11的置换)。这是本领域内的一大进步。于是， 在优选实施例中，所述测定在测定期间的任何时刻都无需从换能器3中移除样品的情况下 执行。此外，在将换能器暴露于样品和照射样品的步骤之间也不需要其他介入(例如，将结 合的与未结合的第二试剂分离)。图3示出了其中第一试剂是被固定的被分析物而第二试剂是被标记的抗体的实 施例。图3a中示出了竖直排列的换能器3。图3a中的第一试剂是被固定的被分析物15。 第二试剂是被标记的抗体16 (报告物抗体)，对应于图1中的物质2。被标记的抗体16包 括具有附至其上的多个抗体17的标记12。已产生抗被分析物10的抗体17，并且所述抗体 17在样品被引入时选择性地结合至被分析物10。使用中，如图3b所示，换能器被暴露于含有未知浓度的被分析物10的样品。被分 析物10快速扩散至换能器表面，这是因为被分析物10具有更高的结合常数或者相比于第 二试剂的“脱落”反应速率更高的“脱落”速率，以从抗体17置换被固定的被分析物15，参 见图3c。所述反应使用换能器3以参考图1所述的方式实时监测。已经参考图2和图3示出了在添加样品之间，固定在换能器上的第一试剂和第二
7试剂可释放地彼此结合。该结合将典型地通过非共价分子间力，例如抗体和抗原之间的结 合或者互补核酸之间的结合。结合是可释放的，使得该结合可由被分析物或其衍生物打破 从而导致从第一试剂置换第二试剂。允许第一试剂与第二试剂结合的结合位点存在于第一 试剂、第二试剂或者这两种试剂上，并且能够优先结合被分析物或者被分析物衍生物。结合 具有优先性使得被分析物的存在导致第一试剂和第二试剂之间的结合被打破，并且具有针 对被分析物或其衍生物的结合位点的第二试剂和第一试剂变得与被分析物或其衍生物结
1=1 o虽然图2和3中通过抗体，即被固定的捕获抗体(图2)或报告物抗体(图3)，来 例示相关试剂，但是本发明不限于此。于是，虽然图2中的第一试剂和图3中的第二试剂优 选地是抗体，但是也可以使用诸如核酸之类的其他试剂。在一个优选实施例中，本发明提供 一种执行(置换)免疫测定以检测样品中的被分析物(半抗原)的方法，包括如下步骤提 供包含热电或压电元件和电极的换能器、固定在换能器上的捕获抗体、以及结合捕获抗体 并且具有附至其上的标记的被标记的被分析物，其中所述换能器能够将能量变化转换成电 信号，所述标记能够吸收电磁辐射以生成非辐射衰减的能量；将换能器暴露于样品，由此允 许被分析物或被分析物衍生物与被固定的捕获抗体结合并且从所述换能器置换所述被标 记的被分析物；用电磁辐射照射样品；将所生成的能量转换为电信号；以及检测所述电信 号。替换地，包括如下步骤提供包含热电或压电元件和电极的换能器、固定在换能器上的 被分析物、以及结合被固定的被分析物并且具有附至其上的标记的被标记的抗体，其中所 述换能器能够将能量变化转换成电信号，所述标记能够吸收电磁辐射以生成非辐射衰减的 能量；将换能器暴露于样品，由此允许被分析物或被分析物衍生物与被标记的抗体结合并 且从所述换能器置换所述被标记的抗体；用电磁辐射照射样品；将所生成的能量转换为电 信号；以及检测所述电信号。图2和图3示出的第一试剂9、15附至换能器3的表面并且优选地被吸收至换 能器上。该表面还可由其他涂层(例如来自SurModics Inc，Eden Prairie, MN, USA的 Stab il coat)覆盖以使得表面稳固。如上参考图2和3讨论的，标记12能够吸收由辐射源生成的电磁辐射以生成非辐 射衰减的能量。于是，为了检测换能器3附近标记12的存在，样品由一系列电磁辐射脉冲 照射。换能器3将生成的能量转换成电信号，并且电信号由检测器7检测。标记12可以是能够与由辐射源生成的电磁辐射相互作用以生成非辐射衰减的能 量的任何材料。优选的，标记包括但不限于碳微粒、有色聚合物微粒(例如，有色橡胶)、 染料分子、酶、荧光分子、金属(例如，金)微粒、血红蛋白分子、磁性微粒、具有非传导核心 材料以及至少一个金属壳层的纳米微粒、红细胞、以及它们的组合。在磁性微粒的情况下，电磁辐射是射频辐射。上述提及的所有其他标记利用包 括IR或UV辐射的光。金微粒市面有售，并且可以使用公知方法制备(参见例如G.Frens， Nature, 241, 20-22 (1973) ) 0对于纳米微粒标记的更详细解释参见US 6，344，272和W0 2007/141581。在一个实施例(扩散受控)中，本发明使用具有20至l，000nm，优选地100至 500nm微粒尺寸的微粒。微粒尺寸是指微粒在其最宽点处的直径。优选地，微粒具有 0. 5-3. Og/mL的密度，更优选地1. 5-2. Og/mL并且最优选地具有1. 8g/mL的密度。在一个尤其优选的实施例中，微粒是具有上述微粒尺寸和密度的碳微粒，虽然也可以使用诸如聚苯 乙烯或乳胶之类的其他材料。在另一实施例(重力辅助)中，本发明使用具有20至l，000nm，优选地100至 500nm微粒尺寸的微粒。优选地，微粒具有1. 5_23g/mL的密度，更优选地15_20g/mL并且 最优选地为19g/mL。在一个尤其优选的实施例中，微粒是具有上述微粒尺寸和密度的金微 粒，虽然也可以使用诸如锇或铱之类的其他材料。标记12在结合事件已发生时接近换能器。也就是说，标记与换能器表面足够接近 使得换能器能够检测在照射样品时由标记生成的能量。尽管如此，标记和换能器表面的实 际距离将取决于多个变量，诸如标记的尺寸和特性、抗体及被分析物的尺寸和特性、样品培 养基的特性、以及电磁辐射的特性和相应的检测器设置。对于电磁辐射的特性，本发明的设 备可以包括适于生成一系列电磁辐射脉冲的辐射源以及适于确定来自辐射源的每个电磁 辐射脉冲与电信号生成之间的时延的检测器，由此允许精确确定标记相对于图1讨论的换 能器的定位。虽然认为未知样品包含被分析物，但是本发明的测定当然可用于确定被分析物的 存在与否。被分析物优选地是小分子，因此所述测定理想地使用这类分子，虽然本发明并不 限于此。本文使用的术语“小分子”是本领域内的术语并且用于与诸如蛋白质和核酸之类 的大分子相区别。小分子在免疫测定领域内通常被称为“半抗原”，一种当附至大载体分子 (诸如蛋白质)时能够引起免疫应答的小分子，并且包括诸如激素及合成药物的分子。这类 小分子通常具有2，000或以下的分子量，经常具有1，000或以下甚至500或以下的分子量。 第一试剂可适于结合至被分析物本身，虽然被分析物在与第一试剂结合之前可以经历化学 反应或者初始络合事件。例如，被分析物可以在测定的PH条件下质子化/去质子化。于是， 与第一试剂结合的被分析物可以是被分析物本身或者被分析物的衍生物；这两者都位于本 发明的范围内。包含或者不包含所关注被分析物的样品一般将会是流体样品并且通常是生物样 品，诸如像是血液、血浆、唾液、血清或尿的体液。样品可以包含悬浮颗粒，甚至可以是全血。 本发明的方法的一个优点在于可以对包含悬浮颗粒的样品执行测定而不会不恰当地影响 测定结果。样本典型地具有微升量级(例如，1-100 iiL，优选地1-10 iiL)。为了保持流体样 品，换能器优选地位于具有两个侧壁、一个上表面和一个下表面并且优选地是凹槽(well) 的样品室内。在一个优选实施例中，换能器集成到室内，即，形成限定室的侧壁、或者上或下 表面之一。试剂9和被标记的被分析物11显然将位于室的内表面以允许与样品接触。样 品可以简单地由表面张力保持，例如在毛细管道内。在本发明的一个实施例中，重力可用于辅助从换能器的表面置换被标记的被分析 物11。也就是说，换能器形成室的上表面并且所述被标记的被分析物比所述样品的介质更 为稠密，或者所述换能器形成样品室的下表面并且所述标记比所述样品的介质更不稠密。 当所述被标记的被分析物比所述样品的液体介质更为稠密时，被标记的被分析物在重力的 影响下朝样品室的下表面(基底)沉积。替换地，被标记的被分析物比所述样品的液体介 质更不稠密，是的被标记的被分析物在浮力的作用下朝样品室的上表面(盖)浮起。换句 话说，通过重力/浮力下的沉积或浮起来帮助对被标记的被分析物的置换。这在参考图4 详细地示出。
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图4a_4e示出了其中换能器形成样品室的上表面的本发明的测定。在图4a中，换 能器3包含被固定的抗体9的层和被标记的被分析物11的层。如图4b所示，样本被添加 并且被分析物10朝换能器扩散。被标记的被分析物11的置换如图4c-4e分别针对低、中、 高被分析物浓度示出。被标记的被分析物具有比样本介质更大的密度并因此趋向于在重力 影响下沉积。本发明还提供用于执行本文描述的测定的设备。在一个优选实施例中，设备实质 上由上述特征组成。“实质上”意味着无需其他特征就能执行该测定。该设备可以采用手持 便携读取器和包含换能器的一次性设备的形式。在实质上封闭的系统内收集样品，与第二 试剂混合，并且置于读取器内，后者会执行样品照射并且检测得到的电信号。本发明还提供 具有热电或压电元件和电极的换能器的用途，用于上述的监测置换免疫测定中被标记的试 剂。示例例 1活性压电/热膜生物传感器的制备在如下示例中用作感测设备的涂覆氧化铟锡的极化聚偏二氟乙烯(PVDF)双晶压 电膜在低湿环境中在聚苯乙烯溶液(1%甲苯)中浸涂以在氧化铟锡之上提供聚苯乙烯层。 该双晶压电膜随后在室温下整夜培育以在聚抗生蛋白链菌素溶液(PBS中200y g/mL，其中 PBS 是包含 2. 7mmol/L KC1、137mmol/L NaCl 和 0. 05% 吐温的 pH 7. 510mmol/L 磷酸盐缓冲 液)中浸涂。聚抗生蛋白链菌素的制备由Tischer等人(US 5,061,640)描述。为了制备“捕获”表面，聚抗生蛋白链菌素表面用生物素标记的抗睾酮培育以提 供涂覆抗体的表面(C1)，或者用生物素标记的睾酮培育以提供涂覆抗原的表面(C2)。对 于C1，在室温下在PBS中整夜培育10ug/mL的生物素标记的抗睾酮(HyTest Ltd, Turku, Finland, Cat # 2T2_biotin, or Accurate Chemical Co, ffestbury, New York, USA, Cat # BHS113)并在随后用过量PBS冲洗并在40°C下干燥之前用Stabilcoat(SurModics Inc， Eden Prairie,MN, USA)涂覆。对于C2，在室温下在PBS中整夜培育30nmol/L的7 a-C6_生 物素标记的睾酮(其制备如Luppa et al. Clin. Chem. 1997，43，2345中所述)并在随后用 过量 PBS 冲洗并在 40°C下干燥之前用 Stabilcoat(SurModics Inc, Eden Prairie,MN, USA) 涂覆。M 2碳标记的报告物结合物的制备碳标记的报告物结合物实质上按照Van Doom等人的描述制备(US 5，641，689)。 为了制备涂覆抗体的报告物结合物(R1)，室温下用200i!g/mL聚抗生蛋白链菌素溶液在 5mmol/L磷酸盐缓冲液pH 6. 2中摇动培育lmL的Special Black-4 RCC标称150nm碳微粒 (Degussa, Essen, Germany)整夜，得到涂覆抗生蛋白链菌素的表面(A1)。得到的碳结合物 被清洗(通过离心、粒化和再悬浮)。随后用1ml的这一涂覆抗生蛋白链菌素的碳微粒悬浮 液整夜摇动培育PBS中10ug/mL的生物素标记的抗睾酮(HyTest Ltd, Turku,Finland, Cat # 2T2-biotin，或者 Accurate Chemical Co,ffestbury, New York, USA, Cat # BHS113)。用 pH 8. 5的0. 05mol/L硼酸盐缓冲液清洗得到的碳结合物3次(通过离心、粒化和再悬浮) 并在4°C下暗处存储。为了制备涂覆抗原的报告物(R2)，在5mmol/L磷酸盐缓冲液pH 6.2中用30nmol/L的7 a -C6-生物素标记的睾酮(其制备如Luppa et al. Clin. Chem. 1997， 43，2345中所述)整夜摇动培育1ml的涂覆抗生蛋白链菌素的碳微粒(A1)。用上述pH 8. 5 的0. 05mol/L硼酸盐缓冲液清洗得到的碳结合物3次并在4°C下暗处存储在此缓冲液中。例 3金标记的报告物结合物的制备金标记的报告物结合物的制备实质上如Frens G. Nature 1973，241，20-22或者 Roth J所述。胶质金标志物系统针对光和电子显微镜细胞化学领域。可参见Bullock GR， Petrusz P, eds. Techniques in immunocytochemistry, Vol 2. New York, NY, Academic Press，1983，216-284。为了制备涂覆抗体的报告物结合物(R3)，室温下用200 y g/mL聚链 霉抗生物素蛋白溶液在5mmol/L磷酸盐缓冲液pH 6. 2中摇动培育lmL单分散的标称150nm 金微粒(BBI International,Cardiff,UK)整夜，得到涂覆链霉抗生物素蛋白的表面(A2)。 得到的金结合物被清洗(通过离心、粒化和再悬浮)。随后用1ml的这一涂覆抗生蛋白链 菌素的金微粒悬浮液整夜摇动培育PBS中10ug/mL的生物素标记的抗睾酮(HyTest Ltd, Turku, Finland, Cat # 2T2_biotin,或者 Accurate Chemical Co, ffestbury, New York, USA, Cat # BHS113)。用pH 8. 5的0. 05mol/L硼酸盐缓冲液清洗得到的金结合物3次(通 过离心、粒化和再悬浮)并在4°C下暗处存储。为了制备涂覆抗原的报告物(R4)，在5mmol/ L磷酸盐缓冲液pH 6. 2中用30nmol/L的7 a -C6-生物素标记的睾酮(其制备如Luppa et al. Clin. Chem. 1997，43，2345中所述)整夜摇动培育1ml的涂覆抗生蛋白链菌素的金微粒 (A2)。用上述pH 8.5的0.05!1101/1硼酸盐缓冲液清洗得到的金结合物3次并在41下暗处 存储在此缓冲液中。例 4涂覆试剂涂覆抗体膜的制备为了制备涂覆试剂涂覆抗体的压电膜表面，在室温下用涂覆抗原的碳(R2)或者 涂覆抗原的金试剂(R4)(如上所述)在PBS中整夜培育一片涂覆抗体的压电膜(如上所述， C1)，随后用过量PBS清洗该压电膜并在40°C干燥前用Stabilcoat(SurModics Inc，Eden Prairie, MN, USA)涂覆，以分别给出涂覆碳试剂(C3)或者涂覆金试剂(C4)的反应表面。M 5涂覆试剂涂覆抗原膜的制备为了制备涂覆试剂涂覆抗原的压电膜表面，在室温下用涂覆抗体的碳(R1)或者 涂覆抗体的金试剂(R3)(参见所述)在PBS中整夜培育一片涂覆抗原的压电膜(如上所述， C2)，随后用过量PBS清洗该压电膜并在40°C干燥前用Stabilcoat(SurModics Inc, Eden Prairie, MN, USA)涂覆，以分别给出涂覆碳试剂(C5)或者涂覆金试剂(C6)的反应表面。例 6测定涂覆试剂的压电膜传感器、碳标记、简单“扩散”测定如图5所述，制造传感器1以执行测定。传感器1由一片涂覆抗体的压电膜3(如 上所述，C3或者C5)和一片透明聚碳酸酯盖膜14制成。上述两膜用间隔物18隔开约500 微米的距离，其中该间隔物18由一片涂覆粘合剂的压敏聚酯膜制成并被冲切形成两个尺 寸不等的室19、20 ；大小约为30 x 10 x 0.5mm的一个室用于测定反应而大小为10 x 10 x 0. 5mm的较小的第二室20用于控制反应。提供结构用以允许至压电膜顶表面和底表面的电连接，由此检测生成的电荷。通过用PBS中的睾酮标准品(通过填充孔21)填充较大的室19以给出 0. Ι-lOOnmol/L最终浓度范围来执行测定。控制室20同时填充与测定室相同的反应混合 物，不同之处在于用PBS代替睾酮标准品。入口和出口被密封并将室组件连至测试仪器，使 得压电膜垂直于室的侧面定向。随后顺序用四个LED(波长625nm)以断续LED光照射压电 膜，其中三个LED照射测定室表面的不同区域，一个照射控制室的压电膜表面。对于每个 LED脉冲，使用锁定放大器和模数(ADC)转换器测量跨压电膜的电压。ADC信号随时间的标 绘以及ADC计数/min相对于睾酮浓度的关系在图6中示出。数据已在反应起点被调零，因 此仅例示了信号的变化。例 7测定涂覆试剂的压电膜传感器、金标记、简单“重力协助扩散”测定为了执行该测定，如例6所述制造样品室(如上所述，C4或C6)。以与例6相同的 方式设置测定，不同之处在于压电膜水平于室的上面定向。随后顺序用四个LED(带有使用 检测较大金标记的波长，标称值为625nm，参见WO 2007/107716)以断续LED光照射压电膜， 其中三个LED照射测定室表面的不同区域，一个照射控制室的压电膜表面。对于每个LED 脉冲，使用锁定放大器和模数(ADC)转换器测量跨压电膜的电压。ADC信号随时间的标绘以 及ADC计数/min相对于睾酮浓度的关系在图7中示出。数据已在反应起点被调零，因此仅 例示了信号的变化。
1权利要求
一种用于检测样品中的被分析物的方法，包括以下步骤，提供包含热电或压电元件和电极的换能器、固定在换能器上的第一试剂、以及可释放地结合第一试剂并且具有附至其上的标记的第二试剂，其中所述换能器能够将能量变化转换成电信号，所述标记能够吸收电磁辐射以生成非辐射衰减的能量，并且其中第一或者第二试剂具有允许彼此结合并且能够优先结合被分析物或被分析物衍生物的结合位点；将换能器暴露于样品，由此允许被分析物或被分析物衍生物与所述结合位点结合并且置换所述第二试剂；用电磁辐射照射样品；将所生成的能量转换为电信号；以及检测所述电信号。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述换能器位于具有两个侧壁、一个上表面和一个 下表面的样品室内。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述换能器形成样品室的一个侧壁。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述换能器形成样品室的上表面并且所述第二 试剂比所述样品的介质更为稠密。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述换能器形成样品室的下表面并且所述第二 试剂比所述样品的介质更不稠密。
6.如前述任一权利要求所述的方法，其中所述第一试剂是被固定的抗体并且所述第二 试剂是被标记的被分析物。
7.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第一试剂是被固定的被分析物并 且所述第二试剂是被标记的抗体。
8.如前述任一权利要求所述的方法，其中所述换能器还包括涂覆在换能器、第一试剂 和第二试剂之上的保存涂层。
9.如在前任一权利要求所述的方法，其中标记选自碳微粒、有色聚合物微粒、染料分 子、酶、荧光分子、金属(例如，金)微粒、血红蛋白分子、磁性微粒、具有非传导核材料以及 至少一个金属壳层的纳米微粒、红细胞、以及它们的组合。
10.如在前任一权利要求所述的方法，其中所述第一试剂吸附在所述换能器上。
11.如在前任一权利要求所述的方法，其中所述样品包括悬浮颗粒。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述样品是全血。
13.如在前任一权利要求所述的方法，其中所述辐射源适于生成一系列电磁辐射脉冲， 以及所述检测器适于确定来自辐射源的每个电磁辐射脉冲与电信号生成之间的时延。
14.如在前任一权利要求所述的方法，其中所述方法在将样品暴露于换能器和照射样 品的步骤之间无需从换能器移除样品的情况下进行。
15.如前述任一权利要求所述的方法，其中所述第一和第二试剂是唯一存在的试剂。
16.用于检测样品中的被分析物的设备，包括具有热电或压电元件和电极并且能够将能量变化转换成电信号的换能器；固定在换能器上的第一试剂；可释放地结合第一试剂并且具有附至其上的标记的第二试剂，其中所述标记能够吸收 电磁辐射以生成非辐射衰减的能量，并且其中第一或第二试剂具有允许彼此结合并且能够优先结合被分析物或被分析物衍生物的结合位点；电磁辐射源；以及用于检测电信号的检测器。
17.如权利要求16所述的设备，还包括具有两个侧壁、一个上表面和一个下表面的样 品室并且其中所述换能器位于所述样品室内。
18.如权利要求16或17所述的设备，其中所述换能器形成样品室的一个侧壁。
19.如权利要求16或17所述的设备，其中所述换能器形成样品室的上表面并且所述第 二试剂比所述样品的介质更为稠密。
20.如权利要求16或17所述的设备，其中所述换能器形成样品室的下表面并且所述第 二试剂比所述样品的介质更不稠密。
21.如权利要求16至20中任一项所述的设备，其中所述第一试剂是被固定的抗体并且 所述第二试剂是被标记的被分析物。
22.如权利要求16至21中任一项所述的设备，其中所述第一试剂是被固定的被分析物 并且所述第二试剂是被标记的抗体。
23.如权利要求16至22中任一项所述的设备，还包括涂覆在换能器、第一试剂和第二 试剂之上的保存涂层。
24.如权利要求16至23中任一项所述的设备，其中标记选自碳微粒、有色聚合物微 粒、染料分子、酶、荧光分子、金属(例如，金)微粒、血红蛋白分子、磁性微粒、具有非传导核 材料以及至少一个金属壳层的纳米微粒、红细胞、以及它们的组合。
25.如权利要求16至24中任一项所述的设备，其中所述第一试剂吸附在所述换能器上。
26.如权利要求16至25中任一项所述的设备，其中所述辐射源适于生成一系列电磁辐 射脉冲，以及所述检测器适于确定来自辐射源的每个电磁辐射脉冲与电信号生成之间的时 延。
27.如权利要求16至26中任一项所述的设备，其中第一和第二试剂是所述设备中唯一 存在的试剂。
28.具有热电或压电元件和电极的换能器的用途，用于监测置换免疫测定中被标记的 试齐11°
全文摘要
本发明涉及一种用于检测样品中的被分析物(10)的方法，包括以下步骤提供包含热电或压电元件和电极的换能器、固定在换能器上的第一试剂、以及可释放地结合第一试剂并且具有附至其上的标记的第二试剂(11)，其中所述换能器能够将能量变化转换成电信号，所述标记能够吸收电磁辐射以生成非辐射衰减的能量，并且其中第一或者第二试剂具有允许彼此结合并且能够优先结合被分析物或被分析物衍生物的结合位点；将换能器暴露于样品，由此允许被分析物或被分析物衍生物与所述结合位点结合并且置换所述第二试剂；用电磁辐射照射样品；将所生成的能量转换为电信号；以及检测所述电信号。本发明还提供了用于执行所述方法的设备。
文档编号G01N33/543GK101981448SQ200980111668
公开日2011年2月23日 申请日期2009年3月31日 优先权日2008年4月2日
发明者S·A·罗斯, T·J·N·卡特 申请人:维瓦克塔有限公司