基于多糖的芯片及其应用的制作方法

专利名称：基于多糖的芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明公开的内容主要涉及生物学、医学和流行病学领域，具体地，本发明涉 及一种或多种用于诊断、预防和/或治疗人类、动物、植物和其它生物的感染性疾病、 癌症、自身免疫性疾病、过敏症、毒性、肥胖症和/或其它病症的方法。更具体地， 本发明的公开内容涉及用于对上述病症的治疗性靶点进行鉴定的方法，及由此产生的应用。
背景技术：
糖类是生命体的重要组成成分，可作为结构成分和能量储存成分，还可作为稳 定因子(stabilization agent) > i只另ll因子(recognition agent) > 信号因子(signaling agent)禾口 通信因子(communication agent)。近来发现，细胞表面的糖类主要涉及粘附作用及由此 涉及的细胞间相互作用，因而对糖生物学的兴趣日益增加。分子生物学在这一领域中的 应用，使科学家们能够操作糖类的表达并研究糖蛋白的功能。糖结构研究中的困难糖结构的可变性，部分是由于单糖单位以许多不同的方式相互结合，这与蛋白 质的氨基酸或DNA的核苷酸通常以标准方式结合在一起是相反的。糖结构研究的复杂 性，还在于缺乏其生物合成的直接模板，这与蛋白质的氨基酸序列由与它们相应的基因 来决定的情况相反。糖类也是二级基因产物，它们是通过细胞的亚细胞区中的许多酶协同作用而产 生的。因此，糖类的结构可能依赖于不同的生物合成酶的表达、活性和易接近性。这意 味着不可能与蛋白质研究中所广泛使用的一样，利用重组DNA技术来产生大量的糖，以 用于结构和功能研究。

发明内容
本发明的公开部分基于以下概念细胞表面的多糖或糖类主要涉及细胞间的相 互作用；至少某些形式的多糖或糖类是某些或所有生物在生命起始和进化过程中所共有 的；以及糖类在不同的生理状态下会发生改变。由此，本发明的公开内容说明了一种简 单有效的基于多糖或基于糖类的方法，以用于快速鉴定生物标记和治疗性靶点，尤其是 涉及人类、动物、植物和其它生物的传染性疾病、癌症、自身免疫性疾病、过敏症、炎 症、毒性、肥胖症和/或其它病症的多糖相关靶点。根据本发明公开内容的一个实施方 式中的方法的特征在于以下操作
1)将生物体的健康和疾病细胞和/或组织、病原体、多糖、凝集素、多糖识别 系统、抗体和/或血清、草药、小分子和毒素(所有这些在下文称为靶候选物)，附着和 /或固定在用于芯片(arry)或微芯片的至少一种固体载体上(下文称为芯片载体)；2)使抗体或血清、病原体、多糖、凝集素、多糖识别系统、草药、小分子或毒 素(所有这些在下文称为“检测候选物”)结合在一种或多种芯片载体上；3)对检测候选物与位于所述一种或多种芯片载体上的所述靶候选物的结合进行 检测；4)在动物实验中和/或细胞或组织培养系统中，对与附着在所述一种或多种芯 片载体上的至少一种靶候选物具有阳性结合的检测候选物的生物学功能、致病机理、药 理学、毒性进行检测；5)将步骤4)中确定的涉及传染性疾病、自身免疫性疾病、过敏症、癌症、肥胖 症和其它病症的检测候选物，用于以下应用中诊断、预防和治疗这些病症；药物的开 发和递送；疫苗研制以及流行病学和生物学(尤其是发育和进化生物学)领域；6)对与至少一种检测候选物结合的生物体的健康和/或疾病组织和细胞的治疗 性靶点或标记(附着在所述一种或多种芯片载体)进行鉴定；7)将步骤6)中鉴定的所述治疗性靶点或标记、它们的衍生物(包括但不限于 类似物、促进物、拮抗物、变体(variants)、突变体(mutants)、片段、合成肽、重组抗 原)和任意其它形式的治疗性靶点，用于以下应用中即，与至少一种病因学和/或致病 机理已知或未知的所述治疗性靶点相关的传染性疾病、自身免疫性疾病、过敏、癌症、 肥胖症和其它病症的诊断、预防、治疗和药物递送中的应用。相应地，在本发明公开内容的一个实施方式中，提供了以下方法用于快速鉴 定治疗性靶点的简单和有效的方法；用于药物开发和药物递送系统的简单和有效的方 法；用于致病机理的研究以及人类、动物、植物和其它生物的传染性疾病、自身免疫 性疾病、过敏症、毒性、癌症、炎症、肥胖症和其它病症的病因筛选的简单和有效的方 法；用于开发高质量新型疫苗的简单和有效的方法；用于有效控制大流行性疾病的简单 和有效的方法；用于凝集素、草药、毒素和小分子的功能、毒性、药理学和制药研究的 简单和有效的方法；用于开发自身免疫性疾病、过敏症、毒性、癌症、肥胖症和其它病 症的动物模型的简单和有效的方法；以及用于研究流行病学和生物学(尤其是进化生物 学)的简单和有效的方法。通过具体的实施方式，能够更清楚地了解本发明的多种其它 目的、特征和有益效果。


图1为显示芯片实例的图。图2为显示植物凝集素WGA和大豆凝集素(SBA)与成年鼠的组织切片相结合 的图。图3为显示植物凝集素麦胚凝集素(WGA)和荆豆凝集素ICUEA I)与健康的新 生乳鼠和成年鼠的小肠的组织切片相结合的图。图4为显示植物凝集素WGA与感染和未感染恒河猴轮状病毒(rhesus rotavirus (RRV))的乳鼠的组织切片相结合的图。
图5为显示抗-RRV多克隆抗体和凝集素WGA与RRV感染和未感染的乳鼠的 组织切片相结合的图。图6为显示以配方药和盐水治疗的RRV感染的乳鼠的图。
具体实施例方式本发明的公开内容易于形成多种不同形式的实施方式，此处，将详细地描述本 发明公开内容的优选实施方式和替换性的实施方式。然而，应当理解的是，本发明的公 开内容可以被认为是本发明原理的范例，而并不用以限制实施方式所说明的本发明和/ 或权利要求的精神和范围。芯片载体和附着或/和固定的材料和化学试剂在本发明的公开内容中，用于芯片或微芯片的固体载体(下文称为芯片载体) 指可以用于附着生物材料和化学材料的物体，包括但不限于载玻片(slide)、平板 (plate)、膜、条(strip)、芯片或颗粒等等不限。生物材料和化学材料可以附着或固定到 至少一种芯片载体上。用于向固体载体上附着和固定生物材料和化学材料的方法，可以 是物理方法、化学方法、生物方法和本领域已知的所有其它方法。用于初步筛选的材料和化学试剂根据公开的内容，所述生物材料和化学材料包括但不限于如下材料。生物体和病原体在本发明的公开内容中，术语“生物体”指独立的生命系统，包括但不限于 动物、植物、昆虫、真菌或微生物。基于细胞类型，生物体可以分为原核组和真核组。 原核生物通常表示为两个不同的范围，称为细菌和古细菌(Archaea)。真核生物包括但 不限于人类、动物、植物、真菌、粘菌(slime mould)、藻类、细胞器、线粒体和(植 物中的)色素体(plastids)、病毒性真核生物起源(viral eukaryogenesis)等等。最近， 由Thomas Cavalier-Smith提出了一种Neomura进化枝，将古细菌与真核生物归为一类。 Cavalier-Smith还提出Neomura由细菌进化而来，更确切地是由放线菌进化而来。微生物(microorganism (也可拼写为micro organism)或microbe)是一种用显微镜 可见的生物体(太小以至于通过人的裸眼不能见到)。本发明公开内容的一方面涉及微 生物，包括但不限于有益微生物、古细菌、疾病相关的病原性微生物和/或生命进化 相关的生物体。更具体地，微生物包括但不限于细菌、病毒、真菌、类病毒、朊病毒 (prions)等等。此处所用“病原体”指病原性生物，包括但不限于微生物、寄生虫、昆虫、 植物等等不限。术语“感染性疾病”指外源物种有害地侵殖于宿主生物体。本方法所 用的对感染性疾病具有特异性的病原体包括但不限于病毒、细菌、寄生虫、真菌、类 病毒、朊病毒、原生动物(protozoa)和昆虫。病原体的类型包括但不限于任意类型的病原体，例如，活的或者死的或灭活的 病原体、新鲜的或干燥的病原体、固定的或冷冻的病原体、病原体的全部或部分或片 段、病原体切片、病原体涂片、病原体勻浆、病原体溶解物、以及病原体提取物等等不 限。抗体
此处所用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活 性部分，即含有特异性结合(发生免疫反应)抗原的抗原结合位点的分子。此类抗体包 括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、F.sub.ab、F.sub.ab'和 F(ab' ).sub.2片段和Fab表达文库。通常，获自人类的抗体分子涉及任意类别的IgG、 IgM, IgA、IgE和IgD，这些类别由存在于分子中的重链的性质而彼此有所不同。特定 的类别还有亚类，例如IgG.sub.l、IgG.sub.2等等。此外，在人类中，重链可以是κ链 或λ链。此处涉及的抗体包括所有的人类抗体种的这些类别、亚类、抗体片段和类型。 在脊椎动物的血液或其它体液中，发现天然存在的抗体。适合用于本发明的抗体可以特异性地抗任意生物体、任意病原体、任意感染 剂、任意多糖、任意糖复合物(glycoconjugates)、任意“生物体的自身抗原或任意生物 标记”等等不限。还包括来自诊断为感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏症、毒性、癌 症、肥胖症和其它病症的患者的血清。适合用于本方法的抗病毒的抗体优选包括但不限于抗以下病毒的任意类型的抗 体或抗体片段抗双链DNA病毒、单链DNA病毒、双链RNA病毒、(+)正义链RNA病 毒、(_)反义链RNA病毒、RNA反转录病毒、DNA反转录病毒、卫星病毒(satellites)、 肝炎三角形病毒(hepatitis delta virus)、类病毒，其中，所述双链DNA病毒包括但不限 于腺病毒(adenoviridea)、疱疫病毒(herpesviridea)、乳多孑L病毒(papovaviridea) > 痘 病毒(poxviridea)；所述单链DNA病毒包括但不限于环状病毒(circoviridea)、联体 病毒(geminiviridae)、细小病毒(parvovirinae)；所述双链RNA病毒包括但不限于双 RNA病毒(biraaviridae)、新病毒(reoviridea) ； (+)正义链RNA病毒包括但不限于星 状病毒禾斗(astroviridea)、杯状病毒禾斗(caliciviridea)、冠状病毒禾斗(coronaviridea)、黄病 毒禾斗(flaviviridea)、微小RNA病毒禾斗(picomaviridea)、马铃薯Y病毒禾斗(potyviridea)、 塔巴莫病毒科(tabamoviridea)、烟草花叶病毒科(togaviridea)；所述㈠反义链RNA 病毒包括但不限于丝状病毒(filoviridea)、副粘液病毒(paramyxoviridea)、肺病 毒(pneumovirinae)、弹状病毒(rhabdoviridea)、沙粒状病毒(arenavirus)、布尼亚病 毒(bunyaviridea)、正粘液病毒(orthomyxoviridea)；所述RNA反转录病毒包括但不限 于逆转录病毒(retroviridea)；所述DNA反转录病毒包括但不限于杆状DNA病毒 (badnavirus)、花椰菜花叶病毒(caulimoviridea)、嗜月干 DNA 病毒(hepadnaviridea)所述卫 星病毒包括但不限于烟草坏死病毒卫星病毒；所述类病毒包括但不限于马铃薯纺锤 块莲类病毒(potato spindle tuber viroid)禾口引发海绵状脑病(spongiform encephalopathies) 的病毒。更具体地，抗病毒的抗体包括但不限于抗以下病毒的任意类型的抗体呼肠孤 病毒(reovirus) >轮状病毒(rotavirus) >巨细胞病毒(cytomegalovirus) >流感病毒(包括 禽类A型流感病毒)、EB病毒(Epstein-Barr virus)、肝炎病毒、艾滋病病毒(HIV)、人 类嗜T细胞病毒(HTLV)、乳头瘤病毒(papilloma virus)、脊髓灰质炎病毒(polio virus)、 .1J流感病毒(parainfluenza virus)、麻疫病毒(measles virus)、腿腺炎病毒(mumps virus)、 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、航运热病毒(shipping fever virus)、东方型 脑脊髓炎病毒和西方型脑脊髓炎病毒(Western and Eastern encephalomyelitis virus)、日 本B型脑脊髓炎病毒(Japanese Bencephalomyelitis virus)、俄罗斯春夏型脑脊髓炎病毒 (Russian spring-summerencephalomyelitis virus)、猪癌病毒(hog cholera virus)、痘病毒(pox virus)、狂犬病病毒(rabies virus)、癌热病毒(distemper virus)、口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus)、鼻病毒(rhinovirus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、疫苗病 毒(vaccinia viras) > 以及伪狂犬病病毒(pseudorabies viras)等等不限。适合用于本方法的抗细菌的抗体优选包括但不限于抗以下任意类型细菌的抗体 或抗体片段革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，或杆菌(杆状的)、球菌(球状的)和螺旋 状菌(曲壁状的)以及其它细菌。特定的细菌包括但不限于霍乱菌(cholera)、梅毒菌 (syphilis)、炭疽菌(anthrax)、麻风(leprosy)和腺鼠疫菌(bubonic plague)、立克次氏体 (rickettsias)、淋病奈瑟菌(neisseriagonorrhoeae)、百日咳杆菌(bordetella pertussis)、大肠 杆菌(escherichia coli)、沙门氏菌(salmonella enterica)、霍舌L弧菌(vibrio cholerae)、绿月农 假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、鼠疫耳口尔森氏菌(yersinia pestis)、土拉弗朗西其jf菌 (francisella tularensis) >、流感B耆血杆菌(haemophilus influenzae) > 紫色硫细菌(purple sulfur bacteria)、幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、炭 疽芽孢杆菌/赌状芽孢杆菌/苏云金芽孢杆菌(bacillus anthrac is/cereus/thuringiensis)、 破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、 葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、月市炎球菌(pneumococci)、月市炎链球菌 (streptococcus pneumoniae) > 支原体(mycoplasmas)、脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)、 结核分支杆菌(mycobacterium tuberculosis)、麻风分支杆菌(mycobacterium leprae)、白喉 棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)、梅毒密螺旋体(treponema pallidum)、博氏疏螺旋 体(borrelia burgdorferi)、沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)、婴鸟鹉热衣原体(chlamydia psittaci)、藻蓝蛋白(phycocyanin)、藻红蛋白(phycoerythrin)、线粒体、叶绿体等等不 限。生物体的细胞、组织和器官此处使用的术语“疾病”指破坏机体功能的生物体异常情况，伴有特异的症状 和征兆。在人类或动物中，“疾病”通常更广泛地用于指能够引起患者的不适、功能障 碍、痛苦、社交问题(social problems)和/或死亡的任意情况，或者接触所述患者的那些 人或动物的类似问题。广义而言，疾病有时包括残疾、失调、综合征、感染性疾病、单 独的症状、异常行为、以及结构性的和功能性的非典型变异，而在其它内容中以及为了 其它目的，这些可以被认为是可区别的范畴。疾病的类型包括但不限于人类的、动物 的、植物的和其它生物的感染性疾病、癌症、自身免疫性疾病、过敏症、毒性、肥胖症 和/或其它病症。根据本发明的公开内容的真核生物的健康或正常以及疾病的细胞、组织和/或 器官的类型可以是任意类型的体外培养细胞，包括但不限于本领域公知的多种细胞 系和原代细胞；任意类型的获自新鲜组织的细胞；任意类型的新鲜的、冷冻的或固定的 组织或器官的片段、切片或涂片；细胞或组织或器官或任意类型的部分器官的提取物或 勻浆或溶解物，或任意其它类型的细胞、组织或器官的提取物或勻浆或溶解物。人类、动物或植物的健康和疾病细胞或组织或器官包括他们的部分或完整的生 命期间，从胚胎、胎儿、新生、幼年直到成年。人类和动物的健康和不健康组织或器 官可以是(但不限于)上皮组织和腺体；结缔组织；肌肉，包括平滑肌、骨骼肌和心 肌；神经组织，包括中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)；软骨、骨和关节；细胞外基质；血液和造血系统；骨髓；心血管系统，包括心脏、动脉、毛细血管和静脉； 呼吸系统，包括肺、支气管树、肺泡小管和肺泡；消化系统，包括口腔、食道、胃、小 肠(十二指肠、空肠和回肠)和大肠(盲肠、结肠、直肠、肛道和阑尾)、唾液腺、胰 腺、肝、胆管和胆囊；泌尿系统，包括肾、输尿管、膀胱和尿道；雌性生殖系统，包括 卵巢、输卵管、子宫和阴道；雄性生殖系统，包括睾丸、生殖管、阴茎、精囊、前列腺 和尿道球腺；淋巴(免疫)系统，包括淋巴结、胸腺和脾；内分泌腺，包括松果体、垂 体、甲状腺、副甲状腺和肾上腺；外皮(integument)，包括皮肤和它的附属物、汗腺、皮 脂腺、毛发和指甲。多糖和糖复合物术语“多糖”指聚糖或寡糖。寡糖是含有小数目(典型地3-10个)糖组分(单 糖)的糖类聚合物。多糖通常由单糖通过ο-或N-糖苷键与合适的蛋白质中的氨基酸侧 链或脂部分的连接而组成。存在两种类型的糖基化连接于天冬酰胺侧链的酰胺氮上的 N-连接的糖基化，以及连接于丝氨酸和苏氨酸侧链的羟基氧上的O-连接的糖基化。其 它的多糖包括但不限于O-GlcNAc、GAG链、糖胺多糖(glycosaminoglycan)、鞘糖脂 (glycosphinglipid)。单糖包括但不限于果糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、半乳 糖、乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸。O-连接的多糖和N-连接的 多糖在真核生物中常见，尽管在原核生物中不常见，但也可以找到。可以发现多糖附着 于蛋白质，成为糖蛋白(glycoproteins)或蛋白多糖(proteoglycans)。它们通常位于细胞 的外表面。唾液酸是描述9个碳原子的单糖神经氨酸(neuraminic acid)的N_取代或0_取
代的衍生物的通用术语。这个组中的最常见成员的名称为N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac或 NANA)和2-酮代-3-脱氧辛酸(Kdn)。唾液酸的其它成员包括但不限于N-乙酰葡萄 糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和N-羟乙酰 神经氨酸(Neu5Gc)。唾液酸广泛分布在动物组织和细菌中，尤其是在糖蛋白和神经节苷 脂中。氨基基团含有乙酰基或羟乙酰基基团。羟基取代基可以很大程度地变换已发现 的有乙酰基、乳酰基、甲基、硫酸基团和磷酸基团。在人类和其它生物中，富含唾液酸 的糖蛋白可以结合选择蛋白(C型凝集素)。糖复合物在本发明的公开内容中，术语“多糖”还指糖复合物的糖类部分，所述糖复合 物包括但不限于糖蛋白、糖脂、蛋白多糖和糖磷酸鞘脂(glycophosphosphingolipids)， 或其它已知或未知的糖复合物。糖复合物主要在外部细胞壁和分泌液中发现。除了糖复 合物本身，由于在细胞表面存在多种多糖结合的受体，因而糖复合物对于细胞间的相互 作用很重要。http://en.wikipedia.org/wiki/Glvcobiology—note—Ma 2004术语“蛋白多糖”表示特定类别的高度糖基化的糖蛋白。它们包括核心蛋白和 一个或多个共价结合的糖胺多糖(GAG)链。这些糖胺多糖链是长的线性糖类聚合物， 由于存在硫酸和糖醛酸基团，它们在生理条件下带有负电荷。蛋白多糖可以通过它们的 糖胺多糖链来分类。这些链包括但不限于硫酸软骨素(chondroitin sulfate)和硫酸皮肤 素(dermatan sulfate)；肝素和硫酸乙酰肝素；硫酸角质素。蛋白多糖也可以通过大小来分类。大的蛋白多糖的实例为聚集蛋白多糖(aggrecan)和多功能蛋白多糖(versican)，聚集蛋白多糖为软骨中的主要蛋白多糖，多功能蛋白多糖存在于许多成年组织中，这些成 年组织包括但不限于血管和皮肤。小的富含亮氨酸重复的蛋白多糖(SLRPs)包括但不限 于核心蛋白多糖(decorin)、二多糖(biglycan)、纤维调节素(fibromodulin)和内腔蛋白 (Iumican)。

术语“糖脂”指结合糖类的脂类。在糖链与细胞膜的外质表面上的磷脂相结合 时产生糖脂。它们从磷脂双层扩展到细胞外的含水环境中，可以作为特异化合物的识别 位点，并帮助维持膜的稳定性，同时使细胞彼此附着以形成组织。糖脂包括但不限于 半乳糖脂、硫脂(SQDG)、糖鞘脂(glycosphingolipids)、脑苷脂(cerebrosides)、半乳糖 脑苷脂(galactocerebrosides)、葡萄糖脑苷脂(glucocerebrosides)、葡糖苷(脂)酰鞘氨醇 (glucobicaranateoets)、神经节苷脂(gangliosides)、红细胞糖苷脂(globosides)、硫苷脂 (sulfatide)、糖磷酸鞘脂(glycophosphosphingolipids)或任意其它已知或未知的糖脂。多糖识别系统多糖假定是先以简单的同型多糖(直链淀粉、纤维素等等)的形式合成，进化为 复杂的杂合多糖。此种进化假定引发了涉及“多糖识别系统”的蛋白质(凝集素)的出 现，所述识别系统可以识别各种结构分子、鉴定分子，可以引入生物信号以及促进感染 性疾病。多糖的所述合成系统和所述识别系统相互依赖，并且认为仍然在进行共进化。多糖识别系统包括但不限于凝集素(包括动物凝集素、植物凝集素和病原体 凝集素)、含有糖类识别结构域(CRD)的酶、抗多糖的抗体、抗细胞因子的抗体、抗伴 侣蛋白的抗体和抗运输蛋白的抗体、结合微生物糖类的蛋白、结合糖胺多糖的蛋白或任 意其它已知或未知的多糖识别系统。凝集素是糖结合蛋白，它们的糖部分是高度特异的。在本发明的公开内容中， 凝集素包括但不限于动物凝集素、植物凝集素、病原体凝集素和任意其它已知或未知 的凝集素。凝集素是天然普遍存在的，典型地含有进化上保守的糖识别结构域。已知凝 集素通过识别在病原体中独特的糖类或在宿主细胞上难以接近的糖类，而在免疫系统中 发挥重要作用。来自病毒、细菌、原生动物和昆虫的病原体凝集素通过它们的唾液酸识 别活性，从而涉及感染。动物凝集素包括但不限于C型凝集素、M型凝集素、L型凝集素、P型凝集 素、R型凝集素、I型凝集素、F型凝集素、F盒H型凝集素(F-box Η-type lectins)、 半乳凝集素(galectins)、穿透素(pentraxin)、蜘蛛毒素(spider toxin)、泰克凝集素 (tachylectin),甲壳质结合蛋白、甲壳酶类凝集素、TIM凝集素、钙联接蛋白-钙网织蛋 白(calnexin-calreticulin)、纤维胶原素(ficolins)、富克凝集素(focolectin)、内凝集蛋白 (intelectins)和任意其它类型的已知或未知的动物凝集素。植物凝集素包括但不限于β _棱柱(prism) I型凝集素、β -棱柱II型凝集素、 β-三叶草凝集素、打结素(knottin)、豆类凝集素(legume lectin)、果糖特异性凝集素、 甘露糖特异性凝集素、葡萄糖特异性凝集素、岩藻糖特异性凝集素、半乳糖特异性凝集 素、N-乙酰半乳糖胺特异性凝集素和N-乙酰葡萄糖胺特异性凝集素、以及任意其它类 型的已知或未知的植物凝集素。病原体凝集素包括但不限于细菌凝集素、病毒凝集素和真菌凝集素。细 菌凝集素包括看不限于AB5毒素、细菌神经毒素、葡萄球菌毒素、纤毛粘附素(piliadhensin)、蓝细菌凝集素(cyanobacterial lectins)、I-Ca β-三明治、2_Ca β-三明治、
β-螺旋、毒素重复结构域。病毒凝集素包括但不限于外壳蛋白、红细胞凝集素 (hemmagglutinin)、尾突起蛋白(tailspike protein)、衣壳突起蛋白和纤维球形突起(fiber knob)。真菌凝集素包括但不限于Ig-样凝集素、actinoporin-样凝集素、β -三叶草孔 形成凝集素、半乳凝集素、6-叶片β-螺旋和7-叶片β-螺旋、以及任意其它类型的已 知或未知的病原体凝集素。动物多糖识别蛋白包括但不限于以下两组凝集素和硫酸化的糖胺多糖 (SGAG)结合蛋白。结构复杂的糖胺多糖(GAG)的生物合成是被调控的，形成了器官特 异性和组织特异性的以及在生长和发育过程中暂时性的多种硫酸化模式。除抗体和T-细 胞受体以外的通过免疫球蛋白(Ig)类结构域介导多糖识别的蛋白质称为“I型凝集素”。 具有唾液酸(Sia)结合特性和特征性氨基末端结构特征的I型凝集素的主要同源亚家族称 为“ Siglecs ”(识别Sia的Ig超家族凝集素)。
粘蛋白可以是含唾液酸的糖蛋白。粘蛋白被分泌到呼吸道和消化道的粘液中。 粘蛋白基因编码粘蛋白单体，该单体合成为杆状的核粘蛋白(apomucin)核心，并通过特 别丰富的糖基化进行翻译后修饰。在成熟的粘蛋白中发现两个不同区域1)氨基和羧基 末端区域，该区域是轻度糖基化的，但是富含半胱氨酸，可能涉及在粘蛋白单体的内部 和单体之间建立二硫键。2)大的中央区，由10-80个残基序列的多重串联重复形成，在 这些残基序列中，一半以上的氨基酸是丝氨酸或苏氨酸。该区域可以被数百个O-连接 的寡糖所饱和。在粘蛋白中也可以找到N-连接的寡糖，但是数量较少。通过cDNA克 隆，区别出至少19个人类粘蛋白基因-MUC1、MUC2、MUC 3A、MUC 3B、MUC 4、 MUC 5AC、MUC 5B、MUC 6-9, MUC 11-13 和 MUC 15-19。主要分泌的呼吸道粘蛋 白是MUC5AC和MUC5B，而MUC2大部分在肠中分泌，但是在呼吸道中也有分泌。在 许多腺癌中粘蛋白的产生增加，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等等。在 肺部疾病中粘蛋白也有过表达，例如哮喘、支气管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)或囊性 纤维化(cystic fibrosis)。草药和传统中草药此处所用的草药指具有价值特性(例如药用性质、香味、气味等等)的植物。 在本发明的公开内容中，传统的中草药包括但不限于本草纲目(繁体汉字本草綱目； 简体汉字本草纲目；拼音bSncfio Gangmu ；韦氏拼音法(Wade-Giles) Pen-ts' ao Kang-mu)(也称为Compendium of Materia Medica)中列出的草药，本草纲目是由明代李
时珍撰写的中药著作。它是一部归纳明代本草的著作。该著作中列出了所有的认为具有 药用性质的植物、动物、矿物和其它物质。特别地，基本的传统中草药包括但不限于藿香(Agastache ragosa)、八角 枫(Alangium chinense)、白头翁(Anemone chinensis，同名 Pulsatilla chinensis)、山直 菪(Anisodus tanguticus)、紫金牛(Ardisia japonica)、紫H (Aster tataricus)、黄苗或北苗 (Astragalus propinquus,同名 Astragalus membranaceus)、茶丰对或茶叶(Camellia sinensis)、 大麻(Cannabis sativa)、红花(Carthamus tinctorius)、肉桂(Cinnamomum cassia)、锡 生藤或亞乎奴(Cissampelos pareira)、短萼黄连(Coptis chinensis)、延胡索(Corydalis ambigua)、巴豆(Croton tiglium)、芫花(Daphne genkwa)、洋金花(Datura metel)、紫花曼陀罗(Datura stramonium, 同名 Datura tatula)[13]、石斛或石斛兰(Dendrobium nobile)、 常山(Dichroa febrifuga)[14]、草麻黄(Ephedrasinica)、杜^[中(Eucommia ulmoides)、大卓戈 (Euphorbia pekinensis)[15]、——口十秋(Flueggea sufjraticosa，曾名 Securinega suffruticosa)、 连翅(Forsythia suspensa)、地 丁 (Gentiana loureiroi)、阜荚(Gleditsia sinensis)、甘草 (Glycyrrhiza uralensis)、大风子(Hydnocarpus anthelmintics，同名 H.anthelminthica)、 冬青(Ilex purpurea)、益母草(Leonuras japonicus)、川弯(Ligusticum wallichii)[18]、半 边莲(Lobelia chinensis)、黄桕(Phellodendron amurense)、侧桕(Platycladus orientalis， 曾名 Thuja orientalis)、金钱松(Pseudolarix amabilis)、山麻黄(Psilopeganum sinense)、 葛根(Pueraria lobata)、蛇根木或從蛇根木或印度蛇木(Rauwolfia serpentina)、地黄或 干地黄(Rehmannia glutinosa)、药用大黄(Rheum officinale)、青海杜(Rhododendron tsinghaiense)、 云木香(Saussurea costus)、 五味子(Schisandra chinensis)、 黄苳 (Scutellaria baicalensis)、百部(Stemona tuberosa)、防己(Stephania tetrandra)、槐或 槐树或槐花(Styphnolobiumjaponicum,曾名 Sophora japonica)、栝楼(Trichosanthes kirilowii)、了哥王(Wikstroemia indica)、板蓝丰艮(Isatis indigotica)、云南白药、丹参 (Eclipta prostrate herb)、蒲公英(Taraxacum mongolicum herb)、人参(Ginseng)、熟地 黄(Rehmannia glutinosa/foxglove root prep.) λ 绞股蓝(Panto Teapills)、山药(Dioscorea opposite/Chinese yam rhizome)、牡丹皮(Paeonia suffruticosa/peony tree root-bark) λ 获等 (Poria cocos fungus/mushroom filaments)、泽 写(Alisma plantago aquatica/water plantain rhizome)、山茱萸(Cornus officinalis/dogwood tree fruit)、肉桂(Cinnamomum cassia/ cinnamon bark)、熟附子(Aconitum carmichaeli root prep.)、党参(Codonopsis root)、朿丨J 五力口(Eleuthro root)、冬虫夏草(Cordyceps)、灵芝(Reshi/Mushroom of Immortality)、 可首乌(Polygonum multifloram root)、意孩仁(Coix lachrymal jobi/Seeds of Jobs Ears seed)、桂枝(Cinnamomum cassia/cinnamon twig)、生姜(Zingiber officinalrhizome.Ginger root)、白苟(Paeonia lactiflora/white peony root)、当归(Angelica sinensis root)、防风 (Ledebouriella divaricata root)、获等(Pori α cocos fungus)、杜仲(Eucommia ulmoides bark)、 苍术(Atractylodes lancea rhizome e)、 桔梗(Platycodon grandiflorum/ballon flower root)、乳香(Boswellia carterii)、没药(Commiphora myrrha/myrrh resin)、延古月索 (Corydalis yanhusuo/fumewort rhizome)、桃仁(Prunus persica/peach seed)、鹿鸾(Deer antler)、白术(Atractylodes macrocephala)、薄荷(Mentha halocalyx/field mint hearb)、柴 古月(Bupleurum chinense root)、连翅(Forsythisia suspense fruit)、白 (Angelica dahurica root)、陈皮(Citrus reticulate/citrus peel)、大麥(Ziziphus jujube/Chinese date fruit)、菊 花(Chrysanthemum morifolium flower)、酸 Φ 仁(Ziziphus spinosa/sour jujube seed)、山 药(Dioscorea opposite/Chinese yam rhizome)、荞麦(Buckwheat)、半夏(Pinellia ternata rhizome)。无机离子和小分子本发明公幵内容中的无机离子包括矿物质营养素，包括但不限于硼元素、 铜元素、锰元素、锌元素、钼元素、硫元素、铁元素、钙元素、钾元素、硝酸盐、磷酸 盐、氯化物等等不限。本发明公幵内容中的小分子包括但不限于结合多糖的肽，糖链(也称为脂肪族糖，且具有共同的化学式CnHn+2)；具有相同的烃化学式但是具有不同结构的结构异构 体；不饱和烃，其中，糖链含有多重键；醇(携带直接与碳原子相连的一个或多个羟基 的脂肪族碳化合物)；醛(酮的次级醇)；有机酸(由醛基氧化产生)；酯(由醇和酸的 缩合反应产生)；或者任意其它已知或未知的小分子。毒素本发明公开内容中的毒素包括但不限于蜂毒素(apitoxin)、外毒素 (exotoxin)、内毒素(endotoxins)、蓝藻毒素(cyanotoxins)、坏死毒素(necrotoxins)、血毒 素(hemotoxin)、真菌毒素(mycotoxin)、神经毒素(neurotoxin)、光毒素(phototoxin)、毒 性团(toxicophore)、类毒素(toxoid)、毒液(venom)、蓖麻毒素(ricinis)、或任意其它已
知或未知的毒素。所述毒素是由活的细胞或生物体产生的有毒物质，在非常低的浓度即有活性。 毒素可以是小分子、肽或蛋白质，且能够在接触机体组织时或被机体组织吸收时，由于 与生物大分子(例如酶或细胞受体)相互作用而引起疾病。毒素的严重程度有很大的不 同，通常从较小的和急性的(如蜂螯伤)到几乎立即致命的(如肉毒杆菌毒素)。生物毒 素在目的和机制方面有很大的不同，且可以是高度复杂的(鸡心螺(coneOTail)的毒液含 有几十种小蛋白质，各自靶向特异的神经通路或受体)或相对较小的蛋白质。初级筛选如上所述的用于初级筛选的材料和化学试剂，可以用作此初级筛选方法的靶试 剂或检测试剂。在下文中它们被称为“靶候选物”或“检测候选物”。靶候选物如上所述，靶候选物可以根据需要以多种组合附着或固定于载体上。所述靶候 选物和检测候选物的组合包括但不限于表1中列出的那些。表1靶候选物和检测候选物结合的组合
权利要求
1.一种鉴定多糖相关靶点的方法，该方法包括a)将至少一种靶候选物附着或固定于至少一种芯片载体上，所述靶候选物包括第 一生物的健康的或疾病的细胞、组织、器官或颗粒，第一病原体，第一多糖，第一凝集 素，第一多糖识别系统，第一抗体，第一血清，第一草药，第一小分子或第一毒素，所 述芯片载体包括固体载体；b)使至少一种检测候选物与附着或固定在所述至少一种芯片载体上的至少一种靶候 选物相结合，所述检测候选物包括第二抗体、第二血清、第二病原体、第二多糖、第 二凝集素、第二多糖识别系统、第二草药、第二小分子或第二毒素；c)对所述至少一种检测候选物与附着或固定在所述至少一种芯片载体上的所述至少 一种靶候选物的结合进行检测；以及d)如下步骤中的至少一种1)对附着或固定在所述至少一种芯片载体上并与所述至 少一种检测候选物相结合的至少一种靶候选物进行鉴定；2)对与所述鉴定的靶候选物相 结合的至少一种检测候选物进行鉴定；或3)对附着或固定在所述鉴定的靶候选物和所述 鉴定的检测候选物上的多糖相关靶点进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述固体载体包括载玻片、平板、膜、条、芯 片或颗粒中的至少一种。
3.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中，所述第一生物包括原核生物 或真核生物；所述第一生物的健康的或疾病的细胞、组织或器官来自于以下中的至少一 种体外培养的细胞、组织或器官，细胞系，原代细胞，新鲜组织，新鲜器官，组织切 片，新鲜的、冷冻的或固定的组织或器官的涂片，组织、器官或部分器官的提取物、勻 浆或溶解物。
4.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中，所述第一和第二病原体各自 独立地包括以下中的至少一种病毒、细菌、寄生虫、真菌、类病毒、朊病毒、原生动 物、或昆虫；并且所述病原体的类型包括以下类型中的至少一种活的、死的、失活 的、新鲜的、干燥的、固定的、冷冻的、全部的或部分的病原体，或者所述病原体的片 段、切片、涂片、勻浆、溶解物和提取物。
5.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中，所述第一和第二抗体或血清 各自独立地包括至少一种免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，该免疫球 蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分对以下中的至少一种具有特异性第二生 物、第三病原体、第三多糖、糖复合物、糖蛋白、蛋白质、肽、重组抗原、自身抗原、 或所述第一或第二生物的生物学标记。
6.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中，所述第一和第二多糖各自独 立地包括以下中的至少一种多糖、寡糖或糖复合物的糖类部分、或在蛋白质或脂类部 分中适合于氨基酸侧链的O-糖苷键或N-糖苷键连接的单糖；所述糖复合物包括糖蛋 白、糖脂、蛋白多糖和糖磷酸鞘脂中的至少一种。
7.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中，所述第一和第二多糖识别系 统包括以下中的至少一种动物凝集素、植物凝集素或病原体凝集素，含有糖类识别结 构域的酶，多糖、细胞因子、伴侣蛋白或转运蛋白的抗体，微生物糖结合蛋白，糖胺多 糖结合蛋白，或硫酸化糖胺多糖结合蛋白。
8.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中，所述第一和第二草药各自 独立地包括以下中的至少一种藿香、八角枫、白头翁、白头翁、山莨菪、紫金牛、 紫菀、黄芪、茶叶、大麻、红花、肉桂、锡生藤、短萼黄连、延胡索、巴豆、洋金花、 紫花曼陀罗、曼陀罗、石斛、常山、草麻黄、杜仲、大戟、一叶秋、一叶秋、连翘、地 丁、皂荚、甘草、大风子、大风子、冬青、益母草、川芎、半边莲、黄柏、侧柏、侧 柏、金钱松、山麻黄、葛根、蛇根木、從蛇根木、地黄、药用大黄、青海杜鹃、云木 香、五味子、黄芩、百部、防己、槐树、槐花、栝楼、了哥王、板蓝根、丹参、蒲公 英、人参、熟地黄、绞股蓝、山药、牡丹皮、茯苓、泽泻、山茱萸、肉桂、熟附子、 党参、刺五加、冬虫夏草、灵芝、何首乌、薏苡仁、桂枝、生姜、白芍、当归、防风、 茯苓、杜仲、苍术、桔梗、乳香、没药、延胡索、桃仁、鹿茸、白术、薄荷、柴胡、连 翘、白芷、陈皮、大枣、菊花、酸枣仁、山药、荞麦、或半夏。
9.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中，所述第一和第二小分子各自 独立地包括以下中的至少一种多糖结合肽、糖链、脂肪烃、烃结构异构体、不饱和 烃、醇、醛、酮、有机酸、酯、或含硫化合物。
10.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中，所述第一和第二毒素各自 独立地包括以下中的至少一种蜂毒素、外毒素、内毒素、蓝藻毒素、坏死毒素、血毒 素、真菌毒素、神经毒素、光毒素、毒性团、类毒素、毒液、或蓖麻毒素。
11.一种药物递送工具，该药物递送工具用于诊断、预防或治疗携带治疗靶点的组 织或器官的感染性疾病、癌症、自身免疫性疾病、过敏症、炎症、毒素相关的生物学损 伤、或其它疾病，其中，所述药物递送工具包括前述权利要求中的任意一项所述的鉴 定的多糖相关靶点、或它们的衍生物，其中，附着或固定在所述鉴定的多糖相关靶点上 的所述鉴定的检测候选物与所述至少一种第一病原体或所述第一生物的所述至少一种健 康的或疾病的组织相结合。
12.—种疾病的药物靶点或生物学标记的鉴定方法，其中，该方法包括对与前述权 利要求中的任意一项所述的检测候选物和它们的衍生物相结合的药物靶点或生物学标记 进行鉴定，其中，所述检测候选物结合于至少一种生物体的疾病组织，但是不与相匹配 的健康组织或器官结合，以及一种由所鉴定的药物靶点或生物学标记构成的选择性药物 递送工具，该药物递送工具用于诊断、预防或治疗以下疾病中的至少一种靶向携带所 述药物靶点和所述生物学标记的组织或器官的感染性疾病、癌症、自身免疫性疾病、过 敏症、炎症、毒素相关的生物学损伤、或其它疾病。
13.一种用于药物递送工具的基于多糖的结合位点和它们的衍生物，所述药物递送工 具用于诊断、预防或治疗靶向具有所述多糖结合位点作为细胞或组织结构的一部分的组 织或器官的感染性疾病、癌症、自身免疫性疾病、过敏症、炎症、毒素相关的生物学损 伤或其它疾病，所述基于多糖的结合位点和它们的衍生物包括与所述至少一种第一病 原体和所述第一生物的所述至少一种健康的细胞、组织、器官或颗粒相结合的所述鉴定 的靶候选物。
14.一种抗多种病原体的疫苗，其中，该疫苗包括前述权利要求中的任意一项所述鉴 定的多糖相关结合位点和它们的衍生物中的至少一种，或者共有所述多糖相关结合位点 的两种不同病原体中的至少一种，其中，附着或固定于所述鉴定的多糖相关结合位点上的所述鉴定的靶候选物或所述鉴定的检测候选物各自独立地与所述至少两种不同的病原 体相结合。
15.—种药物制剂，其中，该药物制剂用于诊断、预防、或治疗靶宿主中的感染性疾 病、癌症、自身免疫性疾病、过敏症、炎症、毒素相关的生物学损伤或其它疾病，所述 药物制剂包括附着或固定于前述权利要求中的任意一项所述的鉴定的多糖相关靶点上 的所述鉴定的检测候选物或所述鉴定的靶候选物和它们的衍生物中的至少一种，其中， 所述鉴定的检测候选物或所述鉴定的靶候选物和它们的衍生物包括至少一种小分子，所 述小分子包括含硫化合物或大蒜产品、凝集素或草药或抗体、多糖和它们的羟基取代 物。
16.根据权利要求15所述的药物制剂，其中，所述鉴定的检测候选物或所述鉴定的靶 候选物和它们的衍生物中的至少一种，被制成以下制剂形式片剂、胶囊、定时释放和 持续释放制剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、溶液、悬浮剂、糖浆剂、乳剂、喷 雾剂、滴鼻剂、注射剂、输液、或与纳米颗粒偶联的形式。
17.根据权利要求15所述的药物制剂，其中，所述鉴定的检测候选物或所述鉴定的靶 候选物和它们的衍生物中的至少一种，被制成经以下形式给药的药物制剂向宿主施用 皮下给药、局部给药、口服给药、经鼻给药、肌肉内给药、静脉内给药、腹膜内给药、 肌肉内给药、皮下给药、腔内给药、经皮给药、吸入给药、或肠胃外给药；并且施用的 量使在宿主内产生治疗性疾病靶点的阻断、中和或饱和的至少一种功效，并不使所述宿 主发生免疫作用。
18.—种试剂盒，该试剂盒用于诊断与所述的至少一种鉴定的靶候选物或检测候选物 相关的疾病，其中，所述试剂盒包括前述权利要求中的任意一项所述的鉴定的检测候 选物或鉴定的靶候选物、或它们的衍生物中的至少一种。
19.一种抗感染性病原体的织物或表面，其中，该织物或表面包括以下的至少一种 1)纤维，该纤维包括前述权利要求中的任意一项所述的鉴定的检测候选物或鉴定的靶候 选物或它们的衍生物中的至少一种；或2)颗粒，该颗粒包括前述权利要求中的任意一项 所述的鉴定的检测候选物或鉴定的靶候选物或它们的衍生物中的至少一种，其中，所述 颗粒附着于包括布、面膜、帽子或眼罩在内的织物或表面。
20.—种用于鉴定多糖相关靶点的芯片载体，其中，该芯片载体包括a)至少一种附着于芯片载体的靶候选物，所述靶候选物包括第一生物的健康的或 疾病的细胞、组织、器官或颗粒，第一病原体，第一多糖，第一凝集素，第一多糖识别 系统，第一抗体，第一血清，第一草药，第一小分子，或第一毒素；以及b)至少一种结合于所述芯片载体的检测候选物，所述检测候选物包括结合于至少 一种靶候选物的第二抗体、第二血清、第二病原体、第二多糖、第二凝集素、第二多糖 识别系统、第二草药、第二小分子、或第二毒素；其中，至少一种所述检测候选物和所 述至少一种靶候选物是不同的；以及C)所述芯片载体被配置成允许进行以下之一的操作1)对附着或固定于所述至少一 种芯片载体并与所述至少一种检测候选物相结合的所述至少一种靶候选物进行鉴定，2) 对与所述鉴定的靶候选物相结合的所述至少一种检测候选物进行鉴定，或3)对附着或固 定于所述鉴定的靶候选物和所述鉴定的检测候选物的多糖相关靶点进行鉴定。
全文摘要
本发明公开了基于多糖或基于糖类的用于快速鉴定人类、动物、植物和其它生物的感染性疾病、癌症、自身免疫性疾病、过敏症、炎症、毒性、肥胖症和/或其它病症的生物学标记和治疗性靶点(尤其是多糖相关靶点)的简单、有效的方法。因此，可以基于这些治疗性靶点来开发用于诊断、预防和治疗此类疾病的新的方法和产品。
文档编号G01N33/53GK102016583SQ200980112434
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月7日 优先权日2008年4月8日
发明者王慧茹 申请人:美国博慧生物技术有限公司