利用紫外线放射对活细胞进行3d成像的制作方法

专利名称：利用紫外线放射对活细胞进行3d成像的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及光学层析成像系统，更具体地，涉及用于3D显微镜法的光学投 影层析，在所述3D显微镜中利用紫外线放射照射诸如生物细胞的微小对象来伪投影成像 和重建到3D图像中。
背景技术：
纳尔逊(Nelson)推动了使用光学层析对生物细胞成像的发展，例如在2003 年 2 月 18 日授权的、题为"Apparatus and method for imaging small objects in a flow stream using optical tomography" W^H^^J No. 6, 522, 775 ^Pfi7AJf ^i,
部公开内容被作为参考而被整体合并于此。在福沃尔(Fauver)等于2003年11月18 日提交的美国专利申请号为10/716,744、并于2004年4月22日公开的美国公开号为 No. US-2004-0076319-A1 的、题为“Method and apparatus of shadowgram formation for optical tomography”的美国专利申请(福沃尔’ 744)以及福沃尔等于2006年9月18 日提交的美国专利申请号为11/532,648的、题为“Focal plane tracking for optical microtomography”的美国专利申请(福沃尔’ 648)中对该领域的进一步发展给出了启示， 上述专利申请的全部公开内容作为参考而被整体合并于此。光学层析系统中的处理从样本准备开始。通常，从医院或诊所接收从患者那里采 下的样本，处理该样本以移除非诊断性要素，固定该样本，然后对该样本染色。被染色的样 本然后与光学胶体混合，并被插入毛细管中，之后通过使用光学层析系统来生成样本中对 象(诸如，细胞)的图像。产生的图像包括一组来自不同透视法的延伸景深的图像，该图像 被称为“伪投影图像”。这组伪投影图像可以通过使用反向投影和滤光技术而被重建，以产 生感兴趣的细胞的3D重建。在全部三维上具有等大的或大致相等的分辨率的能力在3D层 析细胞成像中是有利的，尤其是量化图像分析中是有利的。然后，3D重建对于分析依然可用，从而能够对感兴趣的结构、分子或分子探针进行 量化以及位置确定。诸如生物细胞的对象可以用至少一种染料或带标签的分子探针来标 记，且所测量的该生物标记的数量和位置可以产生关于细胞的疾病状态的重要信息，包括 但不局限于诸如肺癌、乳癌、前列腺癌、子宫颈癌、胃癌和胰腺癌等各种癌症。本公开允许将光学投影层析扩展至活细胞成像，并期望促进细胞分析、药物开发、 个人化疗法和相关领域。到目前为止，活细胞显微镜检查传统上是由非标记2D成像技术来 完成的，所述非标记2D成像技术为诸如相位对比、DIC和偏振对比显微镜法。通过使用250nm到290nm波长的深紫外线(DUV)来进行天然吸光(native absorbance)和荧光成像在技术上很有挑战，并且在被放射的细胞中会造成光毒性反应。最 近以来，已使用活体染料，该活体染料通常发射用于3D活细胞成像的荧光信号，因为商业 显微镜(共焦的、去卷积的和多光子激励的多种种类的显微镜)依赖于荧光来创建用于生 成3D图像的多个平面层。然而，在这种情况下，由一堆2D图像形成的3D图像在每个层内 的纵向分辨率是横向分辨率的大约四分之一，从而使得量化分析不精确。在全部三维上具有等大的或大致相等的分辨率的能力在3D层析细胞成像中是非常有利的，尤其是量化图 像分析中是非常有利的。使用DUV照射活细胞的一个优点是天然DNA和蛋白质分别吸收260nm和280nm的 光，而不用使用任何必须渗入细胞膜和有时渗入细胞核膜(在非正常状态下)的光化标签。 而且，标签或染料只是要测量目标蛋白质或核苷酸(DNA)的中间步骤，这给该测量增加了 很大程度的可变性。排除这种外源物种将会潜在地改善蛋白质或核苷酸(DNA)的量化测量 的准确性，而且通过排除样品准备中的步骤能减少时间、经历和复杂性。不幸地，由于激发 强信号需要大剂量的放射，DUV照射的使用在过去表明存在光毒性反应。最近，然而，展示了通过使用DUV发光二极管(LED)来在260nm和280nm下对的活 的培养的人和老鼠细胞进行DUV成像(例如参见2^1^11(1，8等的叩.灿(316化acid and protein mass mapping by live cell deep ultraviolet microscopy, "Nature Methods 4(7) :567-569(2007))。本公开描述了一种新的、新颖的和惊人有效的3D成像系统，该3D成像系统给细胞 尤其是活细胞的DUV 3D成像领域中的长期需要提供了解决方案。

发明内容
提供了一种用于在光学层析系统中对细胞进行3D成像的方法，该方法包括将生 物对象相对于显微镜物镜移动，以显示变化的视角。利用具有波长局限于150nm到390nm 的光谱带宽的光学放射来照射生物对象。利用相机感测穿过生物对象发送的、由生物对象 分散的或由生物对象间接发射的、并由显微镜物镜采集的放射，以记录多个不同视角的图 像。根据所感测的放射来形成生物对象的多个伪投影图像，并且重建多个伪投影，以形成细 胞的3D图像。


图1示意性显示了用于在光学层析系统中利用紫外线放射对细胞进行3D成像的 系统的示例；图2示意性显示了用于在光学层析系统中通过使用UV相机和可选自适应光学器 件、利用紫外线放射对细胞进行3D成像的系统的可替换的示例；图3示意性显示了用于光学层析系统的温度控制的外壳的实施方式；图4示意性显示了在用于对细胞进行成像的轨道配置中使用的微流体盒的示例 的侧视图；图5示意性显示了在用于对细胞进行成像的轨道配置中使用的微流体盒的示例 的顶视图；图6示意性显示了包括沿相同路径的分开的成像阶段的光学层析过程。在附图中，相同的附图标记指示 相似的元件或组件。附图中元件的大小和相对位 置不必按比例绘制。例如，不同元件的形状和角度没有按比例绘制，且这些元件中的一些元 件被任意扩大和设置，以改善附图的易理解性。而且，所绘制的元件的特定形状不意在表达 关于特定元件的实际形状的任意信息，而仅被选择以便于附图中的识别。
具体实施例方式
下面的公开描述了用于对感兴趣对象进行成像的一些实施方式和系统。附图中列 举并描述了根据本发明的示例性实施方式的方法和系统的一些特征。可以理解，根据本发 明的其他示例性实施方式的方法和系统可包括与图中所示的程序和特征不同的另外的程 序和特征。示例性的实施方式在此针对生物细胞而被描述。然而，可以理解，这些示例性实 施方式是用于示出本发明的原理的目的，而不是限制本发明。另外，根据本发明的一些示例性实施方式的方法和系统可以不包括图中所示的所 有特征。贯穿所有附图，相似的附图标记指示相似的或相同的组件或程序。除非上下文需要，否则贯穿下面的说明书和权利要求书，词语“包括(comprise) ” 和其变换形式，诸如“包括(comprises) ”和“包括(comprising) ”是开放式包含的意思，和 “包含，但不局限于” 一样。贯穿该说明书，所参考的“一个示例”或“示例性实施方式”、“一个实施方式”、“实 施方式”或这些术语的各种组合表示与实施方式结合起来描述的特定特征、结构和特性包 括在本公开的至少一个实施方式中。从而，在本说明书的各处出现的短语“在一个实施方式 中”或“在实施方式中”不必都指相同的实施方式。而且，特定的特征、结构或特性可以在一 个或多个实施方式中以合适的方式相结合。如在这里通常使用的，当在光学显微镜法过程的背景中使用时，下面的术语具有 下述意思“毛细管”具有其通常被接受的意思，并且意在包括透明微毛细管和具有通常500 微米或更小的内径的同等项。“景深”是沿光轴的长度，在所述光轴中，在产生特定特征的不可接受的图像模糊 之前可以移动焦平面。“对象”指单个细胞、项、物体或其他实体。“伪投影”包括表示大于光学器件的固有景深的范围的采样体积的单个图像。在福 沃尔’ 744中讲授了伪投影的概念。“样本”表示通过单个测试或程序所获得的来自单个患者的完整产物(例如，为分 析提交的痰、活组织检查或鼻拭子)。样本可以包括一个或多个对象。样本诊断的结果成为 病例诊断的一部分。“样品”指准备用于分析的已完成的细胞制备品，包括全部或部分等分部分或样 本。关于活细胞的成像，该本公开中做出一些假设(1)细胞核中的染色质结构要求 具有亚微米等大分辨率，这将光学放射的波长限制到高于红外线的频率(小于或等于近红 外波长，< IOOOnm)，(2)单个细胞被成像或可能被分析，这可以允许以多个角度进行衍射 测量，以及(3)需要在最小细胞损害的情况下获得成像后的细胞。现在参考图1，示意性显示了用于在光学层析系统11中对细胞进行3D成像的系 统，所述光学层析系统11采用紫外线放射。诸如毛细管、微毛细管或等同物的管22被设置 为由显微镜16观察，所述显微镜16包括显微镜物镜18和镜筒透镜元件52。旋转机构，例 如旋转电机20被连接到管22上。轴向平移机构，例如电机34，耦合到显微镜物镜。放射源29被设置成照射包括保持于其内的生物对象1的管22的部分。放射源29产生具有局限于150nm和390nm之间的波长的光谱带宽的放射。在一个有用的示例中，放射源29包括 发射至少两个选择波长的多个源30、31，所述至少两个选择波长由第一光检测器10和第二 光检测器14同时检测。可选滤光器12A、12B被选择以阻止具有比UV限制的光谱带宽长的 波长的荧光，例如天然色氨酸荧光，和/或增加不同的紫外线放射信号的分离。放射源可以 有利地被合并到计算机控制的光源及聚焦透镜组件56中，该计算机控制的光源及聚焦透 镜组件56还可以包括聚焦透镜光学器件24、26、光扩散器28和放射源29。在一个示例性实施方式中，管22置于两个光学平坦表面之间的可视区域中，所述 光学平坦表面诸如为标准显微镜载片23A和标准显微镜盖玻片23B。在管22与显微镜载 片23A和盖玻片23B之间的间隙由光学胶体32或诸如无机或有机油的等同材料填充，所述 光学胶体或等同材料具有还基本与管22、显微镜载片和盖玻片匹配的折射率。管22本身 可以有利地由具有类似光学特性的油涂覆。管22的外径可以例如是大约250微米。虽然 为了清楚而简化附图没有示出，但是应该理解，可使用折射率匹配的材料来匹配这里所述 的不同的实施方式中的光学器件。与在光学层析系统中使用的毛细管匹配的折射率η在例 如590nm时大约为1. 48，但色散曲线在UV中急剧上升。石英玻璃毛细管的估计折射率在 250nm时为1. 51，UV级石英玻璃的DUV透射比为大约90%。生物对象1有利地可以从包括细胞、活细胞、固定细胞、非固定细胞、冷冻细胞、解 冻细胞、干的细胞、克隆细胞、流式细胞、固定化细胞、包被细胞、细胞核、细胞部分、细胞器、 亚细胞成分、染色体和同等材料的组中选择。光学层析成像系统11可以有利地利用具有从 生物对象激发天然荧光的频率的照射放射，其中光检测器和图像处理器还包括用于测量所 激发的荧光的模块。生物对象被包含于水相环境2中。水相环境2包括生理缓冲盐水或下 面所述的其他溶液。分光器15被设置成将穿过生物对象发送的放射分离成至少两种所选波长。分光 器可以有利地从由偏振光束分光器、沃拉斯顿棱镜、双折射元件、半镀银镜、50/50强度分光 器、光学渡介质镜(dielectric optically coated mirror)、薄膜(pellicle film)、二向 色分光器、镜子、棱镜、衍射光学元件、光栅和同等物组成的组中选择。第一光检测器10被 设置成感测穿过生物对象1、显微镜物镜18、分光器15和第一组可选滤光器12A发送的放 射。类似地，第二光检测器14被设置成感测穿过生物对象1、显微镜物镜18、分光器15和 第二组可选滤光器12B发送的放射。在一个示例中，第一和第二光检测器10、14每个可以 特别包括对紫外光敏感的像素阵列检测器，其中每个像素阵列检测器被选择以检测两个所 选波长中的不同的一个。计算机41包括图像处理器40，该图像处理器40被耦合以从第一和第二光检测器 10、14接收数据。重建模块42被耦合到图像处理器40，其中重建模块使用诸如在例如福沃 尔’ 744中教导的重建算法技术来处理数据以形成细胞的3D图像。图像处理器40将处理 后的图像数据发送到3D图像重建模块42，该3D图像重建模块42可以有利地耦合到用于 操作者观察的光学显示器44。用户界面46可以被提供以用于操作者控制和信息显示的目 的。用户界面46可以是耦合到计算机41的GUI界面等等。在一个示例中，轴向平移机构34包括压电式换能器或等同装置。被连接以控制压 电式换能器的控制器35可以有利地为计算机、计算机模块等等，其中压电式换能器被控制以在轴向移动物镜透镜18。在一个示例系统中，光学层析成像系统11被配置为通过使用滤光器和放射源并 通过使用限制在240nm和300nm之间的波长来对细胞成像。由第一检测器10检测的放射 可以具有主要在260nm和265nm之间的第一范围内的波长。由第二检测器14检测的放射 可以具有主要在280nm和285nm之间的第二范围内的波长。第一范围用来提高DNA和RNA 的自然放射吸光率。第二范围用来提高蛋白质的自然放射吸光率。第一和第二波长范围可 以使用一对放射源来提供，每个源发送两个所选波长范围中的一个波长范围。检测器中的 一个检测器可以被调成检测诸如DNA和蛋白质的亲水表面附近的大约270nm的吸光率。在一个实施方式中，放射可以通过使用时间按时间序列被测量以分离信号。放射 源可以按时间序列被脉冲激发，从而促使细胞脉冲激励(以增加信噪比)以及信号分离。例 如，260nm的放射源可以在Ttl时刻被施加脉冲，随后在T1时刻是280nm的脉冲，随后在η个 随后的时间增量Tn依次是一个或多个激光脉冲，其中η是指示随后的时间点的任意数字。可替换地，天然色氨酸荧光可以被测量以获得对蛋白质的补充测量和其确认和成 分，诸如氨基酸。第三分光器可能是必需的，除非使用时间序列照射。在该可替换的设计 中，分光器15可以将所有的DUV光(240nm到300nm)分到DUV光检测器14中，同时低频荧 光信号可以被荧光检测器10(> 300nm)检测。DUV光源30、31的操作可以按时间序列，所 以主要由核苷酸进行的放射吸光(260-265nm)可以在Ttl时刻被采集，而主要由氨基酸进行 的放射吸光(280-285nm)可以在T1时刻使用相同的检测器14被采集。在该示例中对滤光 器12A、12B的讨论确保为在荧光检测器前的设置是标准长通荧光发射滤光器，而在DUV检 测器前的设置是DUV带通滤光器或短通荧光阻挡滤光器。在又另一个示例中，激光以相对于物镜透镜光轴的斜角入射，阻挡非散射光并允 许对较高散射角的散射轮廓进行暗区域测量。使用可见波长的激光散射的一个示例可以从 T 2004^5 ^ 25 HgtX^B Rahn ^>H^j"Method and Apparatus for Three Dimensional Imaging in the Fourier Domain”的美国专利No. 6，741，730中找到，该专利作为参考而被 合并于此。在又另一个实施方式中，使用平行于光轴的激光照射。吸收材料盘位于物镜的后 焦平面上。吸收器的直径为只够阻挡非散射和非常低角度的散射光那么大。最终的环孔径 允许对较高散射角的散射轮廓进行暗区域测量。在又另一个实施方式中，对于对活细胞中的蛋白质和/或DNA进行分子特定标记 而言，在标准亮区域发送模式(移除衍射分析)中使用活染料(吸光或荧光)或抗体/探 针，且在暗区域照射模式中使用纳米粒子。在操作中，图像重建模块42确定重建的3D图像中三维像素的大小。重建模块42 还包括根据已知的软件工程技术构建的模块，用于通过测量每个三维像素的吸光率来测量 吸收所述放射的分子的浓度。在一个有用的实施方式中，光学层析成像系统11使其本身很好地用于DUV吸光 成像。使用在260nm和280nm的具有20nm带宽的LED允许简单且高效的仪器而不需要感 光滤光器。聚焦光学器件56可以包括例如DUV聚焦透镜(例如，来自德国的蔡司(Zeiss) 的UV-Kond型号)，且物镜透镜18可以包括诸如来自蔡司的100X、1. 25NA、超级荧光 (Ultrafluar)的透镜、或诸如来自纽约罗彻斯特的光学技术公司(Optics Technologies,Inc.)的定制的265nm物镜。为了在光到达UV灵敏C⑶相机之前阻挡周围的光和荧光，滤光器12A、12B可以包括具有从250nm到290nm的带通的带通滤光器，诸如来自佛蒙特州布拉 特尔伯勒的可罗马技术公司(Chroma Technology Corp.)或欧米茄光学(Omega Optical) 的带通滤光器。有用的C⑶相机包括来自日本的索尼公司(Sony Corporation)的C⑶相 机、来自新泽西州特伦顿的普林斯顿仪器(Princeton Instruments)的PhotonMax型号相 机、或来自新泽西州普林斯顿的沙诺夫成像公司(Sarnoff Imaging)的设备。活细胞成像通常需要样本镜台和甘油、油或水浸物镜透镜可被温控。为了从2D DUV成像转换成3D细胞CT DUV成像，材料对于对直径为50微米的微毛细管中的隔离细胞 进行成像所需要的短发送距离(光程长)而言必须是UV透明的。例如，细胞介质应该是 生理缓冲溶液，该生理缓冲溶液可以具有较高的折射率以帮助匹配细胞质膜。对水溶液的 添加剂可以包括但不局限于聚乙二醇(PEG)、甘油、改良的或衍生的PEG和琼脂糖凝胶。当 细胞基质不能很好地与用于微毛细管的玻璃匹配时，则增加内径会减少在内管壁的折射程 度。折射率应该能够与外管壁很好地匹配，因为不需要满足(address)生物适应性。然而， 当选择转动接点时，不发射信号波长范围是250nm-290nm内的荧光的材料应该被考虑。现在参考图2，示意性示出了用于在光学层析系统中通过使用UV相机和可选自适 应光学器件、利用紫外线放射来对细胞进行3D成像的系统的可替换示例。活细胞成像的需 要对水溶液和生理缓冲溶液进行了限制，从而对可以在细胞周围使用的折射率的范围进行 了限制。该围绕细胞的和管内的嵌入式介质被认为具有与标准干浸或油浸显微镜物镜的足 够的折射率失配，从而在生成的图像中引起像差。可以针对特定的成像深度或从包括生理 缓冲剂的细胞到物镜透镜的距离来设计对该折射率失配的补偿。然而，即使低阶球面像差 也随着轴向深度上的变化而变化，所以光学波前畸变的动态补偿对于穿过轴向深度进行成 像的显微镜而言有利的。动态畸变控制或补偿技术涉及自适应光学器件。用于这种动态像 差补偿的光学器件通常是空间光调制器或可变形薄膜镜。由于穿过精密光学组件的DUV光 的非最佳发送特性，自适应反射镜是DUV显微镜中的优选组件。用于对细胞进行3D成像的系统200包括多个组件，所述多个组件与根据图1所述 的那些组件相同或相似。如上所述，管22被相对于显微镜物镜18设置，以用于观察感兴趣 的对象1。如上所述，显微镜16包括物镜透镜18和镜筒透镜元件52。显微镜物镜18沿着 光轴202对齐。与图1中的系统对比，只有单个紫外线(UV)相机48被用于获取感兴趣的 对象的图像。UV相机48也沿着光轴202对齐。介于UV相机48和镜筒透镜元件52之间的 是荧光阻挡滤光器50。如上所述，选择荧光阻挡滤光器50以阻挡较长波长的荧光和/或增 加不同的紫外线放射信号的分离。水相环境2和感兴趣的对象1可以造成在显微镜物镜18与管22和光学胶体32或 等价物之间的足够大的折射率失配，从而必须使用自适应镜54和相关的自适应光学(AO) 控制器201，以减少与深度相关的图像像差。该自适应光学组件可以是位于放射源29、光 学元件27和聚焦透镜24之间的光学元件。无论是未上电还是以恒定波前补偿(2D)曲线 (profile)被供电，自适应镜54在光学系统中均变成静态90度旋转，这可以补偿单个深度 水平。如上所述，来自UV相机48的图像被发送到图像处理器40。图像处理器将处理后 的图像数据发送到3D图像重建模块42，该3D图像重建模块42可以有利地被耦合到光学显示器44以在需要时用于操作者观察。用户界面46被提供以用于操作者控制和显示信息的 目的。用户界面46可以是GUI界面等等。 现在参考图3，示意性示出了用于光学层析系统的温控外壳的实施方式。温控外 壳300包含感兴趣的对象，诸如生物细胞1，或其他生物材料被包含于管、毛细管或微毛细 管22中，所述管、毛细管或微毛细管22被相对于显微镜物镜18设置。微毛细管22可被旋 转电机20旋转以允许微毛细管22内的细胞1的被控旋转运动21。细胞1和胶体32可以 在毛细管22内被例如由注射器80施加的正压力沿着水平轴推进。另一个电机34控制显 微镜物镜18和镜筒透镜52的垂直轴向运动。微毛细管22被包住在光学胶体或折射率匹 配介质32内，并且微毛细管22是样品-聚焦光组件56的一部分或在样品_聚焦光组件56 的顶上。功率放大器60提供用于温度控制器64的能量，所述温度控制器64响应于至少一 个传感器74，并还可以用计算机和电子输入端78管理，以将所需温度维持在特定范围内， 诸如5到39摄氏度。然而，为了使功能维持到接近生理水平，诸如人的恒温动物细胞需要严 格的温度控制，即36摄氏度上/下0. 5摄氏度。对微流体条件以及温度的管理便于保持细 胞活性(即，特别不稳定的正常或异常的细胞、癌症前的细胞群体、癌症的细胞群体、病毒 感染的细胞群体或其他病原细胞群体)。在一个示例中，三个传感器74被设置在显微镜头 16附近，和在微毛细管22上面和下面。用于空气环流的可选内部风扇68存在于一些实施 方式中，以帮助温度控制。帕尔帖(Peltier)热电加热器/冷却器70可以遍及在系统中， 并且可以位于微毛细管22上面和下面，以提供用于细微的温度控制的热能。在特定的实施 方式中，帕尔帖(Peltier)加热器/冷却器70的其他位置也可能是有利的。位于围绕显微 镜的腔室周围的温控水循环器或等价物附件可以作为热电加热器/冷却器和风扇的替换。 在一些实施方式中，大约35摄氏度到大约36摄氏度的温度被使用，在其他实施方式中，更 高或更低的温度可以便于研究特定的生化过程或用于在活着的细胞中使用特定试剂。上面详细描述了光学层析系统，为了帮助理解本公开，现在将描述系统的操作。诸 如活着的细胞的生物对象1经由注射器设备80而被注入微毛细管22中，在注射器设备80 中受压的毛细流84将生物对象1移动到显微镜16的物镜透镜18下面的观察窗口。至少 一个放射源29(例如，DUV和可见光)被设置以照射微毛细管22的一部分，所述微毛细管 22包括生物对象1。在一些实施方式中，大约260nm到280nm的放射波长被使用。放射穿 过光扩散器28和作为样品-聚焦光组件56的一部分的聚焦透镜组件24、26。集成的传感 器74、温度控制器64和风扇68维持温度，以维持和增加细胞存活度。系统允许多种变化来 研究限定的和被控的条件下的活着的细胞。上述的和别处的光学层析系统使用温度控制和微流体以维持合适的条件，从而任 意活着的生物材料可以被检查，所述生物材料包括但不局限于来自人体的细胞以及来自任 意其他物种的细胞。细胞或其他生物材料流过一个或多个管(例如，微毛细管)以便于成 像。在一些实施方式中，微毛细管22包括多个通道的直管。可以理解，在某些实施方式中， 光学层析系统可以被用于获得细胞或亚细胞材料。在一些实施方式中，系统感测放射，该放射包括从包括在活着的细胞或在一些情 况中包括在非活着的细胞或其片段中的大分子复合物、核蛋白质、DNA、RNA或蛋白质传出的 成像信号。包括DNA、RNA和蛋白质复合物成分的细胞可以用化学物质、生物药剂(该化学物质或生物药剂包括但不局限于生物上的活性分子、纳米粒子、改良的纳米粒子、微球体、 蛋白质原始细胞、抗体、生物标记、细胞因子、其他核苷酸、其他蛋白质)处理，或者可替换 地，该细胞可以由显微操作或其他处理(例如，转染试剂、病毒、脂质体等药剂)在机械上操 作以在成像过程期间改变或便于分子摄入或影响其他细胞处理。生物或化学药剂可以利用 发色团和荧光团而被标记或修改。实施方式还可以使用通过利用金、胶态金、铁和氧化铁来 进行标记而被修改的纳米粒子、以及具有吸收(absorption)、荧光(fluorescence)和散射 (scattering)性质的用作3D图像或衍射图案中的光学对比度机制的类似分子。除了发色 团和荧光团之外，纳米粒子和微球体的使用可允许增强的3D对比度。例如，可以利用影响 细胞周期、细胞分化、传染性、减少或增加病原性的药剂来对细胞进行处理，或者还可以对 细胞进行进一步操作以改变亚细胞划分。细胞表面生物标记、染色质、其他细胞核蛋白质或 大分子复合物的表示和显示可以在这些处理中的所有或一些处理期间被检查。在某些实施方式中，活着的细胞或其他生物材料可以用多个波长的放射来照射。 在这些情况下，细胞的多个伪投影图像或对输入图像进行计算机处理所形成的其他生物材 料可以通过使用比率成像技术来被处理。在一些实施方式中，比率成像包括根据大约260nm 到大约280nm的放射波长形成的图像。可替换地，在一些情况下，包括但不局限于荧光和激光衍射的活细胞染色技术可 以被用于有助于获得图像。现在参考图4，示意性显示了微流体盒400。旋转电机20包括被耦合以旋转皮带 188的轴121，其中皮带188的另一端被耦合以旋转微毛细管22。微流体盒400利用正压力 和负压力120操作，以在滚道(raceway)中移动细胞，且利用第二通道504提供营养物和氧 气、移除代谢废料和允许药物与生理缓冲剂中的细胞相互作用(这在图5中进行了最好地 显示)。轴承或摩擦器具92允许微毛细管22在诸如细胞的对象穿过管时旋转。包括聚焦 照射组件56的显微镜位于盒附近，以沿着显微镜16的光轴查看对象。现在参考图5，示意性示出了用于对细胞成像的轨道(racetrack)配置中的微流 体盒的一个示例的顶视图。微流体盒400耦合在流体轨道配置500中。该轨道配置包括沿 着包括光学窗口的物镜透镜的光轴的成像区116。还包括入口阀96、出口阀124和第一通 道502。第一通道502与第二通道504液体连通。通道可以例如用半渗透薄膜104而被接 合。通过使用帕尔帖加热器/冷却器元件或等价物，整个轨道被维持在关于图3在此所述 的温控环境中。在一些实施方式中，轨道和通道包括管道。需要用来维持细胞存活度的新鲜的营养物、氧气、缓冲剂(pH、同渗容摩等)、可选 药物等等可以通过被流向箭头108指示的第二通道504来引入。然而，如果微流体条件是 对的，则细胞不会从旁边移动，只会从轴向通过第一通道502，而渗滤允许诸如O2的新鲜营 养物、缓冲剂材料和代谢废料移动，并之后沿着浓度梯度混合。在一个示例中，半渗透薄膜 104可以被接合的具有非急速平行流的通道代替，所述接合的通道允许小分子和溶液的渗 滤而将细胞维持在其微流体流的初始层流内。生理范围内的切应力在慢的流动速率下是可 能的，且通道几何形态、液体黏性、温度和细胞类型也起着作用。在操作中，细胞通过入口阀96被 注入到微流体盒400。槽(trough) 100用作旋转 电机和用于当细胞通过管时旋转微毛细管22的皮带的外壳。正压力和负压力120被施加 以控制贯穿轨道的受压流84。在成像后，出口阀124可以被用于通过流动的液体将选择的细胞1引导到废弃通道或用于获得活细胞。 正被检查的样本可以是来自细针穿刺抽吸(FNA)的活体组织检查。产生的活细胞 样品可以被分入多个具有单独的入口阀(未示出)的不同的轨道。每个子正被检查的子样 品可以接触不同的药物(诸如药物A、药物B、药物组合A+B、和控制——非药物)，且反应可 以作为实时反馈来被监控以用于患者的个人化药物反应。在一个示例中，轨道配置作为研究/药物药物研发仪器是有用的。在操作中，当以 3D成像时，活细胞可以在轨道中循环。样品中的每个活细胞可以遭受化学和环境协定，且细 胞反应中的小的改变可以指示所需细胞类型。变化是细胞凋亡、有丝分裂、坏死、分泌和其 他所规划的细胞对刺激的反应，其可以实时以高灵敏性被测量。当活细胞显出所需的特性 时，该细胞可以被获得。在2007年9月20日公开的、公开号为US 2007-0215528 Al、题为 "Cantilevered coaxial flow injector apparatus and method for sorting particles" 的哈延加(Hayenga)的共同待决美国专利申请中公开了一种这样的获得方法，该专利申请 的全部公开内容被作为参考而被合并于此。在一些可替换的实施方式中，被标记的纳米粒子(类似于标记有金或纳米球体的 抗体/DNA)可以用于活细胞，以标记特定蛋白质、染色质和DNA。例如，金纳米粒子或胶体金 均具有吸收和散射差异，并且能够与活细胞不排斥。经荧光标记的纳米球体和微球体可以 具有作为3D图像或衍射图案中的光学对比度机制的吸收、荧光和散射。通过使用除了发色 团和荧光团之外的纳米粒子，将允许第三对比度增强，所述第三对比度是散射。用于将散射 信号成像作为“黑色”背景或区域上的高对比度的方法为用光进行照射，该光以超过成像物 镜的入射角的入射角来入射，从而只有信号散射被收集。该图像与荧光成像的图像类似，在 所述荧光成像的图像中，照射光子从最终图像中被剔除。在杜克大学进行过通过使用暗区 域显微镜方法进行活细胞2D成像，例如参见A ·柯里、W · L ·黄以及A ·韦克斯(2006)的 “Epiillumination through the microscope objective applied to dark-field imaging and microspectroscopy of nanoparticle interaction with cells in culture，，,Optics Express 14(14) :6535_65420衍射图案测量是非成像技术，该非成像技术是对上面测量DNA、染色质、蛋白质和 其特定的标记增强的3D空间图案的成像技术的补充。衍射的疾病特定识别标志可以在特 定的空间频率处被找到，所述特定的空间频率以从细胞的特定散射角被测量。由于来自激 光束的零阶光的数量级大于来自活细胞的弱散射光，因此提出了细胞斜射照射技术，以大 大地减少零阶光达到光学检测器或相机。该技术与使用上面所述的使用纳米粒子的暗区域 显微镜法类似。上述每个技术的示例也可以通过使用一些下面所述的一般概念而作为组合被实 施。然而，由于简化和缺少在活细胞3D成像的发展阶段期间的混淆变量，实验室实施将会 最可能作为用于单独的技术的示例而被完成。在下面会介绍组合多个成像和测量技术的一 些示例。现在参考图6，示出了包括沿相同路径的分开的成像阶段的光学层析过程。分开的 成像阶段可以沿着相同路径被处理，所述路径诸如单个微毛细管。例如，可见光衍射分析和 细胞计数(coimting)602可以在第一阶段611被完成，接下来是第二阶段612的可见光成 像604。在使用活染料(live stain)进行成像的情况下，280nm吸收成像606可以在第三阶段613进行，接下来是第四阶段614的260nm吸收成像608。对于该示例性实施方式，在每个阶段随着细胞持续沿着单个旋转毛细管向下移动，细胞应该在有限的视野内对齐。280nm 吸收成像包括用在大约275nm到285nm范围内的第一波长的DUV光照射对象1。260nm吸 收成像包括用在大约255nm到265nm范围内的第二波长的DUV光照射对象1。在另一个实施方式中，组合了一个或多个成像对比度机制(诸如，260nm和280nm 波长的吸收)的单个成像阶段测量DUV吸收和天然荧光，或测量对于一个或多个活染料的 多于两个可见波长的吸收。用于组合光学成像技术的组件能够使用用于光束分离和组合的 多个光学组件(二向色或偏振分光器)，并可能使用多个相机。可替换地，如果多个激励光 源按时间序列被脉冲激发，或滤光轮或实际源被物理移动、或按时间序列被关快门，则单个 相机和检测路径可以被使用。用于成像和测量的单个阶段允许停止的细胞流动轴向传送， 以用于精确地与视野对齐。在又另一个实施方式中，利用纳米粒子散射体进行活细胞染料暗区域成像可以有 利地与利用激光进行细胞斜射照射相结合，以用于衍射图案分析。该技术可以高速进行，并 且如果初始结果保证特定细胞的详细3D图像，则可以是较慢的和随后的3D成像之前的初 始阶段。在操作中，系统提供包括沿相同路径的分开的成像阶段的光学层析过程。多个生 物对象沿路径25被传送到第一阶段611。多个对象中的至少一个对象在第一阶段被可见光 照射以产生衍射图案，并且该衍射图案被光传感器感测。通过使用计算机程序或等价物，衍 射图案被分析以产生衍射分析。在第二阶段612，至少一个对象1被可见光照射，且从该至 少一个对象传出的可见光被感测以产生第一多个伪投影图像。在第三阶段613，至少一个 对象1被第一波长的DUV光照射，且从该至少一个对象传出的第一波长的DUV光被感测以 产生第二多个伪投影图像。在第四阶段，至少一个对象被第二波长的DUV光照射，所述第二 波长的DUV光被感测以产生第三多个伪投影图像。基于从第一、第二和第三多个伪投影图 像获得的特征和衍射分析，多个对象可以被分选，或通过使用分选器610而被分类。该分选 器610可以是许多类型的传统分类器中的任意类型的分类器，该分选器610通常嵌入装载 于计算机中的软件中，诸如统计分选器、自适应分类器、神经网络或等价物。在此相当详细地描述了本发明，以符合专利法规，并给本领域的技术人员提供应 用本发明的新颖概念以及组成和使用所需的那些示例性专用组件所需要的信息。然而，应 该理解，本发明可以由特别不同的装备和设备实施，并且在不脱离本发明的真正实质和范 围的前提下，可以完成对装备细节和操作程序的各种修改。
权利要求
1.一种用于在光学层析系统(11)中对生物对象(1)进行3D成像的方法，所述方法包括相对于显微镜物镜(18)移动生物对象(1)，以呈现变化的视角；利用具有波长局限于150nm与390nm之间的光谱带宽的放射来照射生物对象(1)；利用紫外线相机(48)感测穿过所述生物对象(1)和所述显微镜物镜(18)发送的放射；根据所感测的放射来形成所述生物对象(1)的多个伪投影图像；以及 重建所述多个伪投影图像，以形成3D图像。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述光谱带宽具有进一步局限于240nm与300nm 之间的波长。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述光谱带宽具有进一步局限于260nm与265nm 之间的波长。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述光谱带宽具有进一步局限于280nm与285nm 之间的波长。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物对象(1)选自由细胞、细胞部分、染色体、 活细胞、固定细胞、非固定细胞、冷冻细胞、解冻细胞、干的细胞、克隆细胞、细胞核、细胞器、 流式细胞、固定化细胞、脱氧核糖核酸(DNA)和蛋白质组成的组。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述放射从所述生物对象(1)激发天然荧光，所述 方法进一步包括测量所激发的荧光。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所重建的3D图像中的三维像素的大小是已知的， 所述方法进一步包括通过测量每个三维像素的吸光率来测量吸收所述放射的分子的浓度。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物对象(1)被包含在水相环境(2)中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述水相环境(2)包括生理缓冲盐水。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物对象(1)包括活细胞。
11.根据权利要求3所述的方法，其中所感测的放射包括从DNA传出的成像信号。
12.根据权利要求4所述的方法，其中所感测的放射包括从蛋白质传出的成像信号。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所感测的放射包括从亲水表面传出的成像信号。
14.根据权利要求1所述的方法，其中照射所述生物对象(1)包括利用多个波长进行照射。
15.根据权利要求1所述的方法，其中形成细胞(1)的多个伪投影图像包括通过使用比 率成像来处理图像。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述比率成像包括根据范围为从260nm到 285nm的波长而形成的图像。
17.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括获得细胞。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物对象(1)被保持在微毛细管(22)中。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物对象(1)位于管(22)内，该管(22)被 配置为回收利用通过成像区域(116)的细胞。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述放射包括至少第一波长和第二波长，所述第 一波长和第二波长被选择以增强DNA和蛋白质中至少一者的天然放射吸光率。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述放射包括至少两个选择波长，所述至少两个 选择波长按时间序列被脉冲激发。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述放射包括至少两个选择波长。
23.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括将穿过所述生物对象(1)发送的所述放 射分离成至少两个选择波长。
24.根据权利要求23所述的方法，所述方法进一步包括通过使用第一光检测器(10)和 第二光检测器(14)来感测所述至少两个选择波长，所述第一光检测器(10)对第一波长敏 感，所述第二光检测器(14)对第二波长敏感。
25.根据权利要求24所述的方法，其中分离放射包括通过分光器(15)来引导所述放射。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述分光器(15)选自由偏振光束分光器、沃拉 斯顿棱镜、双折射元件、半镀银镜、50/50强度分光器、光学镀介质镜、薄膜和二向色镜像棱 镜组成的组。
27.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括设置自适应镜(54)，以将所述放 射引导到所述显微镜物镜(18)。
28.根据权利要求27所述的方法，所述方法进一步包括通过利用自适应光学控制器 (201)控制所述自适应镜(54)来减低与深度相关的图像像差。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述自适应镜(54)选自由未上电自适应镜和以 恒定波前补偿曲线被供电的自适应镜组成的组。
30.一种用于获得3D图像的光学层析系统(11)，该系统包括至少一个光学照射源(29)，该光学照射源(29)用于产生具有波长局限于150nm与 390nm之间的光谱带宽的光；物镜透镜(18)，该物镜透镜(18)具有景深，且被定位以接收所述光；轴向平移机构(34)，该轴向平移机构(34)被耦合以使所述物镜透镜(18)在扫描范围 之中平移，从而延长所述景深；传送装置，该传送装置适于当样本呈现于所述扫描范围内时，呈现样本的多个不同的 视图；紫外线传感器，该紫外线传感器用于感测穿过所述物镜透镜(18)发送的光；图像处理器(40)，该图像处理器(40)被耦合以从所述传感器接收数据；以及重建模块(42)，该重建模块(42)耦合到所述图像处理器(40)，其中该重建模块(42) 处理所述数据，以形成细胞的3D图像。
31.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述轴向平移机构(34)包括压电式换能
32.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述至少一个放射源(29)包括计算机控 制的光源及聚焦透镜组件(56)。
33.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述传送装置包括微毛细管(22)。
34.根据权利要求31所述的系统(11)，其中计算机(41)被连接以控制所述压电式换 能器，其中所述压电式换能器沿轴向移动所述物镜透镜(18)，从而延长所述物镜透镜(18) 的景深。
35.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述光谱带宽具有进一步局限于240nm与 300nm之间的波长。
36.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述光谱带宽具有进一步局限于260nm与 265nm之间的波长。
37.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述光谱带宽具有进一步局限于280nm与 285nm之间的波长。
38.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述生物对象(1)选自由细胞、细胞部分、 染色体、活细胞、固定细胞、非固定细胞、冷冻细胞、解冻细胞、干的细胞、克隆细胞、细胞核、 细胞器、流式细胞、固定化细胞、DNA和蛋白质组成的组。
39.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述光从所述生物对象(1)激发天然荧光。
40.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所重建的3D图像中的三维像素的大小是 已知的，所述系统进一步包括用于通过测量每个三维像素的吸光率来测量吸收所述放射的 分子的浓度的装置。
41.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述传送装置将具有生物对象(1)的样本 包含于水相环境(2)中。
42.根据权利要求41所述的系统(11)，其中所述水相环境(2)包括生理缓冲盐水。
43.根据权利要求41所述的系统(11)，其中所述生物对象(1)包括活细胞。
44.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所感测的放射包括从DNA传出的成像信号。
45.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所感测的光包括从蛋白质传出的成像信号。
46.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所感测的光包括从亲水表面传出的成像信号。
47.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述至少一个光学照射源(29)生成具有 多个波长的光。
48.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述重建模块(42)包括比率成像过程。
49.根据权利要求47所述的系统(11)，其中所述比率成像过程包括根据范围为从 260nm到280nm的波长而形成的图像。
50.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述传送装置包括具有多个通道的直管 (22)。
51.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述紫外线传感器(10)是紫外线像素阵 列检测器。
52.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述光谱带宽局限于被选择以增强蛋白质 的自然放射吸光率的波长。
53.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述至少一个光学照射源(29)包括以至 少两个选择波长发送的多个源(30)。
54.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述传送装置适于保持样本，该样本包括 选自由细胞、细胞部分、染色体、活细胞、固定细胞、非固定细胞、冷冻细胞、解冻细胞、干的细胞、克隆细胞、细胞核、细胞器、DNA和蛋白质组成的组的生物对象(1)。
55.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述紫外线传感器包括第一光检测器(10)，该第一光检测器(10)对具有第一波长的光敏感，且被设置成感测 穿过所述显微镜物镜(18)的光；以及第二光检测器(14)，该第二光检测器(14)对具有第二波长的光敏感，且被设置成感测 穿过所述显微镜物镜(18)的光，其中所述第一光检测器(10)和所述第二光检测器(14)沿 着交叉的光路径被设置。
56.根据权利要求55所述的系统(11)，其中所述第一波长和第二波长中的至少一者被 选择以增强DNA的自然放射吸光率。
57.根据权利要求55所述的系统(11)，该系统进一步包括被设置成将穿过所述生物对 象(1)发送的放射分离成至少两个选择波长的分光器(15)，所述至少两个选择波长被分开 地发送到所述第一光检测器(10)和所述第二光检测器(14)。
58.根据权利要求55所述的系统(11)，其中所述第一光检测器(10)包括CCD传感器。
59.根据权利要求55所述的系统(11)，其中所述第一光检测器(10)对具有与人体DNA 的自然吸光率匹配的波长的放射敏感。
60.根据权利要求55所述的系统，其中所述第二光检测器对具有与蛋白质的自然吸光 率匹配的波长的放射敏感。
61.根据权利要求55所述的系统(11)，其中所述第一光检测器(10)对具有包括从亲 水表面传出的成像信号的波长的放射敏感。
62.根据权利要求57所述的系统(11)，其中所述分光器(15)选自由偏振光束分光器、 沃拉斯顿棱镜、双折射元件、半镀银镜、50/50强度分光器、光学镀介质镜、薄膜和二向色镜 像棱镜组成的组。
63.根据权利要求30所述的系统(11)，该系统进一步包括介于所述紫外线传感器和所 发送的放射之间的至少一个滤光器(12A)。
64.根据权利要求30所述的系统(11)，其中所述至少一个放射源(29)包括一组产生 不同波长的UV光源(30)。
65.一种用于在光学层析系统(11)中对活细胞进行3D成像的系统，该系统包括微流体盒(400)，该微流体盒(400)包括相对于显微镜物镜(18)设置的管(22)和管 道回路(502)，该管道回路(502)具有耦合到入口阀(96)的第一端口、耦合到出口阀(124) 的第二端口、半渗透薄膜部分(104)、旋转部分(22)和成像窗口(116)；其中所述旋转部分(22)安装在第一配件(92)和第二配件(92)之间，其中所述第一配 件(92)将所述旋转部分(22)耦合到所述入口阀(96)，且所述第二配件(92)将所述旋转部 分(22)耦合到所述出口阀(124)；旋转机构(20)，该旋转机构(20)连接到所述旋转部分(22)；显微镜物镜(18)，该显微镜物镜(18)被定位以通过所述成像窗口(116)查看对象⑴；轴向平移机构(34)，该轴向平移机构(34)耦合到所述显微镜物镜(18)；第二管道(504)，该第二管道(504)与半渗透薄膜(104)相接，其中该第二管道(504) 将营养物带到所述管道回路(502)中，并将废料产品带出所述管道回路(502)；至少一个放射源(29)，该至少一个放射源(29)被设置成照射所述成像窗(116)，该成 像窗口(116)包括保持于该成像窗口内的生物对象(1)，其中所述至少一个放射源(29)产 生具有波长局限于150nm与390nm之间的光谱带宽的放射；至少一个传感器，该至少一个传感器被设置成感测穿过所述生物对象(1)和所述显微 镜物镜(18)发送的放射；图像处理器(40)，该图像处理器(40)被耦合以从所述传感器接收数据；以及重建模块(42)，该重建模块(42)耦合到所述图像处理器(40)，其中该重建模块(42) 处理所述数据，以形成所述生物对象(1)的3D图像。
66.根据权利要求65所述的系统，其中所述营养物包括氧气和缓冲剂。
67.根据权利要求65所述的系统，其中所述轴向平移机构(34)包括压电式换能器。
68.根据权利要求65所述的系统，其中所述至少一个放射源(29)包括计算机控制的光 源及聚焦透镜组件(56)。
69.根据权利要求65所述的系统，其中计算机(41)被连接以控制压电式换能器，其中 该压电式换能器沿轴向移动物镜透镜(18)，从而延长所述物镜透镜(18)的景深。
70.根据权利要求65所述的系统，其中所述光谱带宽具有进一步局限于240nm与 300nm之间的波长。
71.根据权利要求65所述的系统，其中所述光谱带宽具有进一步局限于260nm与 265nm之间的波长。
72.根据权利要求65所述的系统，其中所述光谱带宽具有进一步局限于280nm与 285nm之间的波长。
73.根据权利要求65所述的系统，其中所述放射从所述活细胞激发天然荧光，所述系 统进一步包括测量所激发的荧光。
74.根据权利要求65所述的系统，其中所重建的3D图像中的三维像素的大小是已知 的，重建装置(42)进一步包括用于通过测量每个三维像素的吸光率来测量吸收所述放射 的分子的浓度的装置。
75.根据权利要求65所述的系统，其中所述生物对象(1)包括活细胞。
76.根据权利要求65所述的系统，其中所述微流体盒(400)被包含于温控水相环境 (2)中。
77.根据权利要求76所述的系统，其中所述水相环境(2)包括生理缓冲盐水。
78.根据权利要求65所述的系统，其中所感测的放射包括从DNA传出的成像信号。
79.根据权利要求65所述的系统，其中所感测的放射包括从蛋白质传出的成像信号。
80.根据权利要求65所述的系统，其中所感测的放射包括从亲水表面传出的成像信号。
81.根据权利要求65所述的系统，其中所产生的放射包括多个波长。
82.根据权利要求65所述的系统，其中所述重建模块(42)通过使用比率成像来处理所 述数据。
83.根据权利要求82所述的系统，其中所述比率成像包括根据范围为从260nm到 280nm的波长而形成的图像。
84.根据权利要求65所述的系统，其中所述至少一个放射源(29)包括多个源(30)，该多个源(30)用于产生至少第一选择波长和第二选择波长，该第一选择波长和第二选择波 长被选择以增强DNA的自然放射吸光率。
85.根据权利要求65所述的系统，其中所述光谱带宽局限于被选择以增强蛋白质的自 然放射吸光率的波长。
86.根据权利要求65所述的系统，其中所述至少一个放射源(29)包括多个源(30)，该 多个源(30)发送至少两个选择波长，该至少两个选择波长按时间序列被脉冲激发。
87.根据权利要求65所述的系统，其中所述至少一个放射源(29)包括多个源(30)，该 多个源(30)发送至少两个选择波长。
88.根据权利要求65所述的系统，其中所述传感器是紫外线像素阵列检测器。
89.根据权利要求65所述的系统，该系统包括分光器(15)，该分光器(15)被设置成将 放射分离成至少两个选择波长。
90.根据权利要求89所述的系统，其中所述分光器(15)选自由偏振光束分光器、沃拉 斯顿棱镜、双折射元件、半镀银镜、50/50强度分光器、光学镀介质镜、薄膜和二向色镜像棱 镜组成的组。
91.根据权利要求65所述的系统，其中所述至少一个传感器包括第一光检测器(10)，该第一光检测器(10)被设置成接收具有第一波长的光；以及 第二光检测器(14)，该第二光检测器(14)对第二波长敏感，且被设置成接收具有所述 第二波长的光。
92.根据权利要求91所述的系统，其中所述第一光检测器(10)对具有与人体DNA的自 然吸光率匹配的波长的放射敏感。
93.根据权利要求91所述的系统，其中所述第二光检测器(14)对具有与蛋白质的自然 吸光率匹配的波长的放射敏感。
94.根据权利要求91所述的系统，其中所述第一光检测器(10)对具有包括从亲水表面 传出的成像信号的波长的放射敏感。
95.根据权利要求65所述的系统，该系统进一步包括介于所述至少一个传感器和所发 送的放射之间的至少一个滤光器(12A)。
96.根据权利要求65所述的系统，其中所述微流体盒(400)和第二管道封闭在温控环 境(300)中。
97.一种包括沿相同路径(25)的分开的成像阶段的光学层析方法，该方法包括 沿路径(25)将多个生物对象(1)传送到第一阶段(611)；在第一阶段(611)，利用可见光照射所述多个对象(1)中的至少一个对象(1)，以产生 衍射图案；感测所述衍射图案；分析所述衍射图案，以产生衍射分析(602)；在第二阶段(612)，利用可见光照射(604)所述至少一个对象(1)；感测从所述至少一个对象(1)传出的可见光，以产生第一多个伪投影图像；在第三阶段(613)，利用第一波长的DUV光照射所述至少一个对象；感测从所述至少一个对象(1)传出的第一波长的DUV光，以产生第二多个伪投影图像；在第四阶段(614)，利用第二波长的DUV光照射所述至少一个对象；感测从所述至少一个对象(1)传出的第二波长的DUV光，以产生第三多个伪投影图像；响应于所述第一多个伪投影图像、第二多个伪投影图像和第三多个伪投影图像和所述 衍射分析(602)，分选所述至少一个对象(1)。
98.根据权利要求97所述的方法，该方法进一步包括对所述生物对象(1)进行计数。
99.根据权利要求97所述的方法，其中所述多个生物对象(1)包括活细胞。
100.根据权利要求97所述的方法，其中第一波长的所述DUV光在255nm-265nm的范围内。
101.根据权利要求97所述的方法，其中第二波长的所述DUV光在275nm-285nm的范围内。
102.根据权利要求97所述的方法，其中所述衍射图案进一步包括暗区域成像图案。
全文摘要
一种用于在光学层析系统(11)中对生物对象(1)进行3D成像的方法，该方法包括相对于显微镜物镜(18)移动生物对象(1)，以呈现变化的视角。利用具有波长局限于150nm与390nm之间的光谱带宽的放射来照射所述生物对象(1)。利用相机(48)从多个不同的视角感测穿过所述生物对象(1)和所述显微镜物镜(18)发送的放射。根据所感测的放射来形成所述生物对象(1)的多个伪投影图像，并重建该多个伪投影图像，以形成细胞的3D图像。
文档编号G01B15/04GK102007369SQ200980113019
公开日2011年4月6日 申请日期2009年2月3日 优先权日2008年2月18日
发明者A·C·尼尔森, E·J·赛贝尔, J·R·拉恩, M·E·福韦 申请人:维森盖特有限公司