应用超极化13c-丙酮酸盐,通过13c-mr检测测定丙氨酸转氨酶(alt)活性的方法

专利名称：应用超极化13c-丙酮酸盐,通过13c-mr检测测定丙氨酸转氨酶(alt)活性的方法
应用超极化13C-丙酮酸盐，通过13C-MR检测测定丙氨酸转 氨酶(ALT)活性的方法本发明涉及一种应用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质，通过13C-MR检测测定 丙氨酸转氨酶(ALT)活性的方法。ALT，也称为谷丙转氨酶(GPT)和丙氨酸氨基转移酶(ALAT)，是催化丙氨酸和 α -酮戊二酸盐之间的可逆性氨基交换，以形成丙酮酸盐和谷氨酸盐的一种酶。通过介导这 四个主要代谢产物的转化，ALT在糖异生和氨基酸代谢中发挥重要作用。在肌肉和某些其他 组织中，ALT降解氨基酸以提供燃料，并通过氨基交换从谷氨酸盐中收集氨基。ALT将α -氨 基从谷氨酸盐中转移到丙酮酸盐中，形成丙氨酸，其为禁食期间血中的主要氨基酸。在可逆 ALT反应中，丙氨酸通过肝吸收，以从丙酮酸盐中产生葡萄糖，构成所谓的丙氨酸-葡萄糖 循环。这种循环在骨骼肌缺氧运作时的强度锻炼中也是重要的，其不仅从蛋白的断裂中产 生氨基，并且从糖酵解中产生大量丙酮酸盐。也许ALT最为人熟知的方面是其在临床上作为肝完整性或肝细胞损害的指标使 用。血清ALT活性在各种肝损伤病症中，包括病毒感染、酒精性皮脂腺病、非酒精性脂肪性 肝炎(NASH)和药物毒性中，显著增高。当由于常规细胞更新或从非血管性源中释放而使外 周循环中出现低水平ALT时，肝显示出含有最高水平的ALT。已表明在肝和血液中ALT水平 之间的差值约为2，000-3, 000倍。因此，血清、血浆或血液中ALT增加可被视为肝损伤的标 志，因为肝的ALT “泄漏”进入循环。通常，肝损伤的本质导致血中ALT水平非常大的变化。 极高的氨基移转酶水平(大于常态的8-10倍)可表明急性病毒性肝炎和/或药物造成的 肝毒性。血清中较轻微、慢的ALT (2-8倍)的增加通常是慢性肝炎、脂肪肝和/或皮脂腺病 的特征。然而，ALT水平与肝损伤病因的关联的机制的许多细节仍有待了解。尽管血清ALT是临床化学中一个最广泛应用的测定，但该测定存在严重的缺点， 原因是它在某些情况下是一种不适当的预测。最近研究引起了对肝病的血清ALT测定特异 性的怀疑。高于常规的ALT水平经常与其它临床情况有关，如肥胖、肌病、心力衰竭、血色素 沉着病、肝豆状核变性或抗胰蛋白酶缺乏。需要改善的方法，用于更直接和准确的指示和/或诊断肝组织损伤和/或疾病的 测定ALT活性。此外，需要改善的方法，用于在评估肝组织损伤和/或疾病的治疗响应，如 生活方式改变或药物治疗的响应上测定ALT活性。已知用于ALT活性检测的各种方法，其主要依靠测定血清的ALT。血清ALT活性的体外测定一般通过连续监测由酶反应生成的丙酮酸盐来进行。这 通过偶合酶促反应完成，其应用乳酸脱氢酶催化还原丙酮酸盐生成乳酸盐，同时还原的烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化成其氧化的形式，即NAD。该反应通过在由于NADH的氧化 引起的吸收度(通常在340nm)降低之后，经分光光度法测定。有一种IFCC推荐的用于血 清ALT活性检测的公式。W0-A-2005/113761公开ALT多肽和与所述多肽特异性结合的抗体，其可用于诊断 或检测涉及包含所述ALT多肽的组织的损伤或疾病。动物或患者的体液样品用于所述体外 诊断或检测。
US 5，705，045公开一种能测量ALT和AST (天冬氨酸转氨酶)活性的生物传感器。 所述生物传感器由两组分别对ALT和AST敏感的电极组成。在应用这种生物传感器的测试 中，将包含ALT和/或AST的生物液体，如血清或血浆，放入所述生物传感器上。然而，上述所有的ALT测定方法都应用血样作为基础，因此其不能确定当测得的 ALT水平升高时，其是由于肝损伤或疾病引起的。因此，需要新的和改进的方法，用于测定 ALT活性，特别是直接局限于肝的ALT活性。现在，已发现超极化13C-丙酮酸盐可用作试剂用于体内(如直接在肝中)或体外 通过用13C-MR检测法测定ALT活性。如上所述，ALT催化超极化13C-丙酮酸盐与谷氨酸盐之间的可逆反应，生成超极化 13C-丙氨酸和α-酮戊二酸盐。已发现与非禁食大鼠的肝相比，禁食大鼠(一种评价肝代谢 状态的模型)肝内ALT活性增高呈现出本身低13C-丙氨酸信号，而13C-乳酸盐信号保持未 变。在禁食大鼠肝内观测到的超极化13C-丙氨酸水平的减少指ALT-介导的13C-丙酮酸盐 /13C-丙氨酸反应平衡的移动，即13C-丙氨酸的减少是由于ALT水平增高。在禁食过程中， 大鼠中ALT水平已呈现出增加，促进丙氨酸作为葡萄糖异生作用的底物的应用和其转化丙 酮酸盐以最后生成葡萄糖(F. Rosen等，J. Bio. Chem. 234(3)，1958，476-480)。检测到的超 极化13C-丙氨酸的减少也可能是由于禁食肝中内源丙氨酸的减少，即较低的起始丙氨酸， 其可影响最终超极化13C-丙氨酸平衡。检测肝中ALT活性变化/丙氨酸代谢变化的能力可用于研究和鉴别肝疾病，如肝 炎、脂肪肝和肝硬化，并可用于监测肝疾病的治疗。早已发现并描述超极化13C-丙酮酸盐转化为其代谢产物超极化13C-乳酸盐、超极 化13C-碳酸氢盐(在只有13C1-丙酮酸盐、13Cu-丙酮酸盐或13Cu3-丙酮酸盐的情况下) 和超极化13C-丙氨酸的代谢转化可用于应用13C-MR研究人和非人动物体中的代谢过程。 13C1-丙酮酸盐在37°C的人全血中具有约4 的T1弛豫，然而，已发现超极化13C-丙酮酸盐 至超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐和超极化13C-丙氨酸的转化能足够快使得能进 行13C-丙酮酸盐母体化合物和它的代谢产物的信号检测。丙氨酸、碳酸氢盐和乳酸盐的量 取决于研究中的组织的代谢状态。超极化13C-乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐和超极化13C-丙 氨酸的MR信号强度与测定时这些化合物的量和留下的极化程度有关，因此通过监测超极 化13C-丙酮酸盐到超极化1:3C乳酸盐、超极化13C-碳酸氢盐和超极化13C-丙氨酸的转化，可 通过应用非侵袭性的MR成像或MR光谱法研究在人或非人动物体的体内的代谢过程。还已发现源于不同丙酮酸盐代谢产物的MR信号振幅根据组织的类型而变化。由 丙氨酸、乳酸盐、碳酸氢盐和丙酮酸盐形成的独特的代谢峰图谱可用作检查下组织的代谢 状态的指纹图谱，因此允许进行健康组织和肿瘤组织之间的鉴别。用于肿瘤成像的超极化 13C-丙酮酸盐应用-肿瘤组织表现出高代谢活性-在W0-A-2006/011810中有详细描述。另外，用于心脏成像的超极化13C-丙酮酸盐的应用在W0-A-2006/054903中有描 述。因此，本发明第一方面提供一种应用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质，通过 13C-MR检测测定ALT活性的方法，其中检测13C-丙氨酸和任选的13C-乳酸盐和/或13C-丙 酮酸盐的信号。术语“测定ALT活性”指通过测定经ALT酶的13C-丙酮酸盐至13C-丙氨酸的动力
4学和/或最大转化，而进行的ALT活性的初始测量。术语“ 13C-MR检测，，指13C-MR成像或13C-MR光谱学或组合13C-MR成像和13C-MR光 谱学，即13C-MR光谱成像。该术语还指不同时间点的13C-MR光谱成像。术语“成像介质”指液体组合物，其包含作为MR活性剂(即成像剂)的超极化 13C-丙酮酸盐。本发明方法所用的成像介质可用作体内13C-MR检测的成像介质，即在活的人或非 人动物体内。此外，本发明方法中所用的成像介质可用作体外"C-MR检测的成像介质，例如 在细胞培养物、机体样品，如血液、离体组织，如活组织检查中获得的离体组织或来自动物 或人体的分离器官。术语"13C-丙酮酸盐”指13C-丙酮酸的盐，其富含同位素13C,即其中13C同位素的量 大于它的天然丰度。本发明方法中所用的超极化13C-丙酮酸盐的同位素富集优选至少75%，更优选 至少80 %，并且尤其优选至少90 %，最优选高于90 %的同位素富集。所述富集理想的是 100%。本发明方法中所用的成像介质中的13C-丙酮酸盐可富集同位素在Cl-位置(以下 以13C1-丙酮酸盐表示)、在C2-位置(以下以"C2-丙酮酸盐表示)、在C3-位置(以下以 13C3-丙酮酸盐表示)、在Cl和C2位置(以下以13Cu-丙酮酸盐表示)、在Cl-和C3-位置 (以下以13Cu-丙酮酸盐表示)、在C2-和C3-位置(以下以"C2,3_丙酮酸盐表示)或在 C1-、C2-和C3-位置(以下以13Cu3-丙酮酸盐表示)上。优选在Cl-位置富集同位素，因 为在37°C下人全血中的"C1-丙酮酸盐比在其它C-位置上富集同位素的13C-丙酮酸盐具有 更高的T1弛豫(约42s)。术语“超极化”和“极化”在下文中可互换使用，并且指原子核的极化水平超过 0.1%，更优选超过1 %，且最优选超过10 %。例如，极化水平可通过在固态超极化13C-丙酮酸盐中的固态13C-NMR测量来测定， 如通过13C-丙酮酸盐的动态核极化(DNP)获得的固态的超极化13C-丙酮酸盐。所述固态 13C-NMR测量优选由用低倾倒角的简单脉冲-获得NMR序列组成。将NMR光谱中超极化 13C-丙酮酸盐的信号强度与在极化过程前获得的NMR光谱中的13C-丙酮酸盐信号强度比 较。从极化前与后的信号强度的比率计算极化水平。以相似方法，通过液态NMR测量测定溶解的超极化13C-丙酮酸盐的极化水平。再 将溶解的超极化13C-丙酮酸盐的信号强度与已知成分的参比样品的信号强度比较，如液态 丙酮酸或溶于水溶液的丙酮酸钠。然后用超极化13C-丙酮酸盐信号积分与已知参比样品的 比率计算极化水平，任选校正相对浓度。也可通过比较在逐渐衰弱超极化后的相同13C-丙 酮酸盐样品的热平衡信号测定极化。活跃13C-核的NMR超极化可通过不同方法实现，例如在W0-A-98/30918、 W0-A-99/24080和W0-A-99/35508中所述的方法，这些专利申请通过引用结合到本文中， 并且超极化方法是惰性气体、“强力程序”、自旋冷冻(spin refrigeration)、仲氢方法 (parahydrogenmethod)和动态核极化(DNP)的极化转移。为了获得超极化13C-丙酮酸盐，优选直接极化13C-丙酮酸盐或极化13C-丙酮酸，并 转化极化的13C-丙酮酸至极化的13C-丙酮酸盐，如通过用碱中和。一种获得超极化13C-丙酮酸盐的适合方法是在W0-A-98/30918中描述的从超极化惰性气体中极化转移。通过应用循环极化光可将具有非零核自旋的惰性气体进行超极化。 超极化惰性气体优选He或Xe，或这些气体的混合物，可用于完成13C-核的超极化。所述超 极化气体可以是气相，其可溶于液体/溶剂中，或者超极化气体本身可作为溶剂。或者，可 将所述气体浓缩在冷却的固体表面上，并以此形式应用，或使其升华。优选将超极化气体与 13C-丙酮酸盐或13C-丙酮酸充分混合。因此，如果极化在室温下是液态的13C-丙酮酸，则优 选将所述超极化气体溶入液体/溶剂中或作为溶剂。如果极化1V丙酮酸盐，则优选将超极 化气体溶于也溶解丙酮酸盐的液体/溶剂中。获得超极化13C-丙酮酸盐的另一种适合的方法是在非常低的温度和高场下，通过 热力学平衡将极化赋予给13C-核。与操作场和NMR光谱温度相比的超极化通过采用非常高 的场和非常低的温度(强力程序)实现。所用磁场强度应尽可能的高，适合高于1T，优选高 于5T，更优选15T或更高，并且尤其优选20T或更高。所述温度应非常低，如4. 2K或更低， 优选1. 5K或更低，更优选1. OK或更低，尤其优选IOOmK或更低。获得超极化13C-丙酮酸盐的另一种适合方法是自旋冷冻法。这种方法包括通过自 旋冷冻极化固体化合物或系统的自旋极化。将所述系统掺杂适当的结晶顺磁性材料，如具 有依次三个或更多个对称轴的M2+、镧系元素或锕系元素离子或与其充分混合。仪器比DNP 需要的简单，不需要均与磁场，因为没有施加共振激发场。所述方法通过围绕垂直于磁场方 向上的轴物理旋转样品进行。该方法的必要因素是顺磁性物质具有高度各向异性g_因子。 作为样品旋转的结果，是使得电子顺磁共振与核自旋相联系，导致核自旋的温度下降。进行 样品旋转，直至核自旋极化达到新的平衡。在一个优选实施方案中，使用DNP(动态核极化)获得超极化13C-丙酮酸盐。在 DNP中，将要极化的化合物的MR活性核的极化受极化剂或所谓的DNP试剂，即包含未成对 电子的化合物的影响。在DNP过程中，提供通常以微波辐射形式存在的能量，其将最先激发 DNP试剂。当衰退至基态时，存在从DNP试剂的未成对电子到将要极化的化合物的NMR活性 核，如到13C-丙酮酸盐中"C核的极化转移。一般情况下，在DNP过程中使用适度的或高的 磁场和非常低的温度，如在液体氦和约IT或以上的磁场中进行DNP过程。或者，可采用适 度的磁场和能达到足够极化促进作用的任何温度。例如，DNP技术还在W0-A-98/58272和 在TO-A-01/96895中描述，它们都通过引用结合到本文中。为通过DNP方法极化化合物，制备要极化的化合物和DNP试剂的混合物(“样品”)， 将其冷冻并以固体形式插入DNP偏振器中进行极化，或将其以液态形式插入DNP偏振器，并 在所述偏振器中由于非常低的环境温度而冻结。极化后，或者通过熔化或通过在适当的溶 解介质中溶解，将所述冻结的固体超极化样品快速转移至液态中。优选溶解，并且冷冻的超 极化样品的溶解方法和因此合适的装置在W0-A-02/37132中有详述。熔化方法和用于熔化 的适用装置例如在W0-A-02/36005中有描述。为了在将被极化的化合物中获得高的极化水平，DNP过程中所述化合物和DNP试 剂需充分接触。如果样品在冷冻或冷却时结晶，就不是这种情况。为避免结晶，需要玻璃 成形物存在于样品中或需要选择用于极化的化合物，其能在冷冻时不结晶但形成玻璃状物 质。如上所述，13C-丙酮酸或13C-丙酮酸盐是获得超极化13C-丙酮酸盐的合适起始物 质。
同位素富集的13C-丙酮酸盐可市售获得，如作为13C-丙酮酸钠。或者，可通过 S. Anker, J. Biol. Chem 176，1948，133-1335 中描述的方法合成。本领域中已知几种"C1-丙酮酸的合成方法。简单地讲，Seebachet al.，Journal of Organic Chemistry 40 )，1975，231-237描述一种合成路线，其依靠包含羰基的起始 物质如S，S-缩醛(例如1，3_ 二噻烷或2-甲基-1，3-二噻烷)的保护和活化。二噻烷是 金属化的并与含甲基的化合物和/或13CD2反应。如该参考文献中所述，通过应用适当的同 位素富集的13C-组分，可能获得13C1-丙酮酸盐或"Cu-丙酮酸盐。随后通过应用文献中所 描述的常规方法，将羰基官能团释放。一种不同的合成路线是从乙酸开始，其首先转化为 乙酰溴，然后与Cu13CN反应。所得的腈经酰胺转化为丙酮酸(参见如S. H. Anker et al., J.Biol. Chem. 176(1948)，1333 或 J. E. Thirkettle, Chem Commun. (1997)，1025)。另夕卜， 13C-丙酮酸可通过质子化市售获得的13C-丙酮酸钠获得，如通过US 6，232，497中所述方法 或W0-A-2006/038811中所述方法。通过DNP的13C-丙酮酸的超极化在W0-A1-2006/011809中有详述，其通过引用结 合至本文中。简要地说，13C-丙酮酸可直接用于DNP，因它在冷冻时形成玻璃状物质。DNP之 后，冷冻的超极化13C-丙酮酸需溶解并中和，即转化为13C-丙酮酸盐。为进行转化，需要强 碱。此外，由于13C-丙酮酸是强酸，因此需选择在这种强酸中稳定的DNP试剂。优选的碱是 氢氧化钠，并且用氢氧化钠进行超极化13C-丙酮酸的转化得到超极化13C-丙酮酸钠，其为成 像介质的优选的13C-丙酮酸盐，该介质用于体内MR成像和/或光谱，即在活的人或非人动 物中进行的MR成像和/或光谱。或者，13C-丙酮酸盐，即13C-丙酮酸的盐可用于DNP。优选的盐是那些13C-丙酮酸 盐，其包含选自以下的无机阳离子AH/、K+、Rb+、Cs+、Ca2+、Sr2+和Ba2+，优选NH4+、K+、Rb+或 Cs+，更优选K+、Rb\ Cs+,且最优选Cs+，其在通过引用结合至本文中的W0-A-2007/111515中 有详述。这些优选的13C-丙酮酸盐的合成也在W0-A-2007/111515中公开。如果将所述超 极化13C-丙酮酸盐在用于体内MR成像和/或光谱的成像介质中应用，则优选通过生理上非 常好的耐受的阳离子(如Na+或葡甲胺)更换选自NH4+、K+、Rb+、Cs+、Ca2+、Sr2+和Ba2+的无 机阳离子。这可通过本领域已知的方法，如应用阳离子交换柱进行。进一步优选的盐是有机胺或氨基化合物的13C-丙酮酸盐，优选TRIS-1V1-丙酮酸 盐或葡甲胺-1V1-丙酮酸盐，其在通过引用结合至本文中的W0-A2-2007/069909中详细描 述。这些优选的13C-丙酮酸盐的合成也在W0-A2-2007/069909中公开。如果用于本发明方法的超极化13C-丙酮酸盐是通过DNP获得，那么将要极化的包 含13C-丙酮酸或13C-丙酮酸盐和DNP试剂的样品还可包含顺磁性金属离子。已发现将要通 过DNP极化的组合物中的顺磁性金属离子的存在导致13C-丙酮酸/13C-丙酮酸盐的极化水 平增加，如在通过引用结合至本文中的W0-A2-2007/064226中详细描述。如之前提及，本发明方法的成像介质可用作用于体内ALT活性测定的成像介质， 该ALT活性测定通过13C-MR检测进行，即在活的人或非人动物内。为了该目的，所述成像介 质是作为适用于给予活的人或非人动物体的组合物提供。除MR活性剂13C-丙酮酸盐外，这 种成像介质优选包含含水载体，优选为生理上耐受的和药学上可接受的含水载体，如水、缓 冲溶液或盐水。此类成像介质还可包含常规的药物或兽药载体或赋形剂，例如制剂助剂，如 一般在人或兽医药上用于诊断用组合物。
此外，本发明方法的成像介质可用作用于体外ALT活性测定的成像介质，该体外 ALT活性测定通过"C-MR检测进行，即细胞培养物、机体样品如血样、离体组织如活组织检 查组织或分离器官。为了该目的，所述成像介质是作为适合加入到如细胞培养物、血样、离 体组织如活组织检查组织或分离器官中的组合物提供。除MR活性剂13C-丙酮酸盐外，此 类成像介质优选包含与体外细胞或组织测定相容，并用于体外细胞或组织测定的溶剂，如 DMSO或甲醇或包含含水载体和非含水溶剂的溶剂混合物，如DMSO和水或缓冲溶液，或甲醇 和水或缓冲溶液的混合物。对于技术人员来讲，很显然药学上可接收的载体、赋形剂和制剂 助剂可存在于此类并非此目的所需要的成像介质中。如果本发明方法所用的成像介质用于体内ALT活性的测定，即在活的人或非人动 物体内，所述成像介质优选经胃肠外给予所述机体，优选由静脉内给予。一般情况下，将在 试验中的机体置于MR磁体中。放置专用的13C-MR RF-线圈以覆盖目标区域。成像介质的 准确剂量和浓度将取决于因素如毒性的范围和给予途径。所述成像介质的给予浓度适宜为 最高达Immol丙酮酸盐每千克体重，优选0. 01-0. 5mmol/kg,更优选0. 1-0. 3mmol/kg。在给 予后400s以内，优选120s以内，更优选给予后60s以内，尤其优选20_50s应用MR成像程 序，该成像程序以组合的频率和空间选择性方式编码目标体积。应用MR序列的准确时间高 度取决于目标体积。如果将本发明方法所用的成像介质用于ALT活性的体外测定，则所述成像介质在 13C-丙酮酸盐中为ImM-lOOmM，更优选在13C-丙酮酸盐中为20mM-90mM，最优选40_80mM。ALT活性可根据本发明方法，通过检测13C-丙氨酸信号和任选的13C-乳酸盐和/ 或13C-丙酮酸盐信号进行测定。所述测定基于以下"C1-丙酮酸盐举例说明的反应；*表示 13C-标记
NH,
"V^ir0"
ALT ,,H0N
OO
13C-丙酮酸盐谷氨酸盐
13O丙教酸α-酮戊二酸盐
uC-乳黢盐流程1.根据流程1，在ALT催化下的可逆反应中，13C-丙酮酸盐和谷氨酸盐反应生成 13C-丙氨酸和α-酮戊二酸盐。在另一可逆反应中，13C-丙酮酸盐转化为13C-乳酸盐。如前 所述，我们发现增加的ALT活性本身以低的13C-丙氨酸信号出现。本发明上下文中的术语“信号”指13C-MR光谱中MR信号振幅或相对于峰噪音的积 分或峰面积，其代表13C-丙氨酸和任选的13C-乳酸盐和/或13C-丙酮酸盐。在一个优选的 实施方案中，所述信号是指峰面积。
在一个优选的实施方案中，检测13C-丙氨酸和13C-乳酸盐的信号。本发明方法的一个优选实施方案中，将以上所述13C-丙氨酸和任选的13C-乳酸盐 和/或13C-丙酮酸盐信号用于产生为ALT活性指标的代谢特性。如果体内进行本发明方法， 即在活的人或非人动物体内，所述代谢特性可来自整个机体，如通过整个机体体内13C-MR 检测获得。所述代谢特性优选由目标区域或体积(即一定组织、器官或所述人或非人动物 体的部分)产生，且最优选是来自肝。本发明方法的另一个优选实施方案中，将上述13C-丙氨酸和任选的13C-乳酸盐和 /或13C-丙酮酸盐的信号用于产生细胞培养中的细胞、机体样品如血样、离体组织如活组织 检查组织或来自人或非人动物体的分离器官的代谢特性。然后通过体外13C-MR检测产生 所述代谢特性。所述代谢特性优选由肝细胞或来自肝活组织检查的离体组织或分离的肝产 生。因此，在一个优选实施方案中，提供一种应用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介 质，通过13C-MR检测测定ALT活性的方法，其中检测13C-丙氨酸和任选的13C-乳酸盐和/或 13C-丙酮酸盐的信号，并且其中所述信号或多种所述信号用于产生代谢特性。在一个优选实施方案中，13C-丙氨酸和13C-乳酸盐的信号用于产生所述代谢特性。在一个实施方案中，将13C-丙氨酸和任选的13C-乳酸盐和/或13C-丙酮酸盐的光 谱信号强度用于产生所述代谢特性。在另一个实施方案中，将13C-丙氨酸和任选的13C-乳 酸盐和/或13C-丙酮酸盐的光谱信号积分用于产生代谢特性，在另一个实施方案中，将来自 13C-丙氨酸和任选的13C-乳酸盐和/或13C-丙酮酸盐的分开图像的信号强度用于产生代谢 特性。在还另一个实施方案中，从两个或多个时间点获得13C-丙氨酸和任选的13C-乳酸盐 和/或13C-丙酮酸盐的信号强度，以计算13C-丙氨酸和任选的13C-乳酸盐和/或13C-丙酮 酸盐的变化率。在另一个实施方案中，所述代谢特性包括或是用13C-丙氨酸和任选的13C-乳酸盐 和/或13C-丙酮酸盐的处理的信号数据产生，如从多次MR检测的信号模式(即光谱或图像) 推导的信号的比值、较正信号、或动态的或代谢的速率常数信息。因此，在一个优选实施方 案中，将校正的13C-丙氨酸信号，即相对于13C-乳酸盐的13C-丙氨酸和/或相对于13C-丙酮 酸盐的13C-丙氨酸的信号，包括在内或用于产生代谢特性。在另一个优选实施方案中，将相 对于全部13C-碳的校正的13C-丙氨酸信号包括在内或用于产生代谢特性，并且全部13C-碳 信号为13C-丙氨酸和13C-乳酸盐和/或13C-丙酮酸盐的信号的总和。在一个更优选实施方 案中，将13C-丙氨酸对13C-乳酸盐和/或13C-丙酮酸盐的比率包括在内或用于产生代谢特 性。本发明方法的优选实施方案中产生的代谢特性表示在试验下的机体、部分机体、 细胞、组织、机体样品等的ALT活性，并且所获得的信息可用于随后步骤，用于各种目的。这些目的之一可为化合物的评价，例如药物，如化疗药物，如烷化剂(如环磷酰 胺、顺钼)、抗代谢药(如巯基嘌呤(marcaptopurine)，硫唑嘌呤)，长春花生物碱类(如长 春新碱、长春碱)或抗肿瘤抗生素类(如更生霉素)，其改变肝代谢，包括ALT活性。在一个实施方案中，体外进行本发明方法，并将获得的信息用于评价改变ALT活 性的潜在药物的功效，如在药物发现和/或筛选过程中应用。在此类实施方案中，本发明方 法可在适当的细胞培养物或组织中进行。将所述细胞或组织与潜在药物接触，并根据本发
9明方法，通过13C-MR检测测定ALT活性。关于潜在药物的效力的信息可通过比较治疗的细 胞或组织的ALT活性与未治疗的细胞或组织的ALT活性获得。或者，可通过治疗前和治疗 后测定细胞或组织的ALT活性来测定ALT活性的变化。这种药效评价可在例如微量培养板 上进行，其允许平行试验不同的潜在药物和/或潜在药物的不同剂量，并因此使得其适用 于高通量筛选。在另一个实施方案中，在体内进行本发明方法，并且将获得的信息用于评价潜在 药物在体内改变ALT活性的效力。在此类实施方案中，本发明方法可在例如实验动物或临 床实验的志愿者身上进行。将潜在药物给予实验动物或志愿者，并根据本发明方法，通过 13C-MR检测测定ALT活性。关于潜在药物的效力的信息可通过治疗前和后测定ALT活性的 变化获得，如在重复治疗的某一时间段内。此类药效评价可在临床前研究(实验动物)或 临床试验中进行。在另一个实施方案中，本发明方法可在体内或体外进行，并将获得的信息用于评 价治疗的响应和/或用于测定他们的疾病正在治疗的患病患者的治疗效果。例如，如果 用预期影响ALT活性的抗病毒药物治疗患有病毒性肝炎的患者，则可根据本发明方法测定 ALT活性。适合在开始使用所述抗糖尿病药治疗之前，和之后如在某一时间段内通过本发明 方法测定ALT活性。通过比较初始ALT活性与治疗期间和之后的ALT活性，可评价抗糖尿 病药是否表现出对ALT活性有任何阳性效果，如果有效果，其程度如何。为上述目的，体外 实施本发明方法，当然需要可获得处于治疗中患者的适当样品，如组织样品或机体样品，如 血液样品。如前所述，通过本发明方法获得的信息可用于随后步骤，用于各种目的。另一目的可以是了解疾病状态，即辨别患病风险的患者、疾病的早期检测、评价病 情发展、预测与疾病相关的严重性和并发症。一个优选的目的是了解肝病状态，即辨别患病 风险的患者、肝病的早期检测、评价肝病病情发展、预测与肝病相关的严重性和并发症。因此，在一个实施方案中，在体内或体外实施本发明方法，并将获得的信息用于辨 别具有发展肝病风险的患者和/或候选者，以便采取预防措施避免急性或慢性肝疾病的发 生。与肝相关的疾病(如非病毒性肝炎)的早期治疗(如生活方式的改变)可防止一些与 此类肝病相关的最具破坏性的并发症，如慢性肝炎或肝硬化。最佳途径仍然待定，该最佳途 径用于鉴别处于患病风险中的患者和/或候选者，以采取预防措施，如涉及控制糖尿病和 高脂血症、超重患者的减肥和戒酒的生活方式改变。因此，获得可用于鉴别具有患上肝疾病 风险的患者和用于鉴别候选者以采取预防措施的方法将是有利的。本发明方法可提供用于 进行所述鉴别所需的信息。在这个实施方案中，本发明方法可用于测定在第一时间点的初 始ALT活性，并在其后的一段时间内以一定频率进行ASL活性测定，如每半年或一年进行一 次。可预测ALT活性的增加将预示着患上肝病的风险增加，并且增加率可被内科医生用作 判定预防措施和/或治疗的起始。此外，可将ALT活性随时间的测定结果与其它如AST或 ALP测定的肝功能试验结果结合，并且可将结合结果用在预防措施和/或治疗上做决策。为 上述目的，体外进行本发明方法，当然的确需要可获得处于治疗中的患者的合适样品，如组 织样品或机体样品，如血样。或者，体内13C-MR检测导致直接在肝显像上检测ALT活性，因 此所获得的信息可直接且便利地用于鉴别具有发展肝病的风险的患者和/或候选者，以采 取预防措施避免急性或慢性肝病发生。
在另一个实施方案中，在体内或体外实施本发明方法，并将所获得的信息用于疾 病的早期检测。在这一个实施方案中，本发明方法可用于测定初始ALT活性，并将其与正常 ALT活性比较，如，在健康受试者中的ALT活性或在某一组织测定初始ALT活性。在还另一个实施方案中，在体内或体外实施本发明方法，并将所获得的信息用于 监测病情的进展。这可用于疾病或障碍，在该障碍中疾病还没发展到表现或认识到需治疗 的水平，如由于与所述治疗相关的严重副作用引起的障碍。在此类情况下，行动选择是密切 监测患者的病情发展和恶化的早期检测。在该实施方案中，本发明方法可用于测定初始ALT 活性，并在一段时间内以一定频率进行随后的ALT活性测定。对于肝病来说，可能期望ALT 活性的增加将表明疾病的发展和恶化，并且所述增加可被内科医生用作治疗的开始判定。 为上述目的，体外进行本发明方法，当然的确需要可获得处于治疗中的患者的合适样品，如 (肝)组织样品或机体样品如肝活组织检查样品或血样。在还另一个实施方案中，在体内或体外实施本发明方法，并将所获得的信息用于 测定疾病的严重性。通常疾病从其开始后就随时间发展。根据症状的类型和/或某些临床 标记的发现，疾病可通过某些阶段表征，如早(轻)期，中(适度)期和严重(晚)期。某 些疾病通常分为更细的阶段。多种临床标记已知用于将疾病分阶段，包括更特异性的那些， 如某些酶或蛋白表达，也包括更普遍的那些，如血液质、电解质水平等等。在该上下文中， ALT活性可为这样的临床标记，其单独使用或与其它标记和/或征状结合使用，以确定疾病 的状态和因此导致的疾病严重性。因此，可应用本发明的方法，以定量的方式在患者中测定 ALT活性，并由获得的ALT活性值将患者的疾病分期。表征某一疾病阶段的ALT范围可通过 在患者中根据本发明的方法，测定ALT活性来建立，该患者患有例如处于早期、中期和晚期 中的疾病，并确定表征某一阶段的ALT活性范围。由于ALT活性受各种因素的影响，如饮食状态或锻炼，因此控制这些因素很重要， 如在实施本发明方法之前，通过给患者提供饮食计划或标准化膳食来控制。也已发现患者 不禁食，因其能导致13C-丙氨酸信号的降低。当在体内实施本发明方法时，解剖学(如果适合)的和/或输注信息也可包括在 内。解剖学的信息如可通过本发明方法之前或之后，应用或不应用适当的造影剂获得质子 或13C-MR图像来获得。附图简述

图1显示3D-13C_MR光谱成像获得的动力学曲线(图la)和单一体素光谱(图lb) 的特征。图2显示正常和禁食大鼠中代表性的肝切片局部动力学曲线。这些最终动力学曲 线来自堆叠图插图，其中堆叠图中各水平线代表每3秒采集一次的超极化类物质的分开的 幅度谱。为清楚的缘故，已将丙酮酸盐-水合物从最终标绘的动力学曲线中除去，并且为易 于观测，通过四个因素中的一个缩小该丙酮酸盐曲线范围。在所述动力学曲线中，各标明的 点代表在该时间点上的13C-丙酮酸盐( 171ppm)、13C-乳酸盐( 183ppm)和13C-丙氨 酸( 176ppm)的强度，即在相关堆叠图中的那些脊的痕线，显示13C-丙酮酸盐的吸收和转 化。图3显示正常和禁食大鼠的13C-MR光谱切片获得物的13C-乳酸盐/13C-丙氨酸的 比值的峰的所有数据点。三角形标识表示收集的数据点，正方形标识/误差线表示平均/标椎误差。图4显示代表性肝切片光谱图的比较，该肝切片光谱图来自具有正常(图4a)和 禁食(图4b)大鼠Icm3体素分辨率的3D-13C-MR光谱成像谱图。一般大鼠肝跨越(spanned) 一对切片。图5显示正常和禁食大鼠肝的3D-13C_MR光谱成像研究(平均超过肝体素/大鼠) 的13C-乳酸盐比总碳的分数(图5a)和13C-丙氨酸比总碳的分数(图恥)。三角形标识显 示收集的数据点，正方形标识/误差线表示平均值士标准误差。注意五个正常的相对于总 碳的13C-丙氨酸的点重叠，因此使得底部两点变得模糊。
实施例在以下术语丙酮酸盐中，13C-丙酮酸盐和1V1-丙酮酸盐可互换使用，并且都表示 13C1-丙酮酸盐。术语丙酮酸、13C-丙酮酸和"C1-丙酮酸可互换使用，并且都表示1V1-丙酮 酸。术语丙氨酸、13C-丙氨酸和13C1-丙氨酸可互换使用，并且都表示13C1-丙氨酸。术语乳 酸盐、13C-乳酸盐和uC1-乳酸盐可互换使用，并且都表示"C1-乳酸盐。实施例1包含通过DNP方法获得的超极化13C1-丙酮酸盐的成像介质的制备将根据W0-A1-98/39277的实施例7合成的三(8-羧基-2，2，6，6-(四(羟乙 基)_苯并-[1，2-4，5，]-二(1，3)_ 二硫杂环戊二烯-4-基)-甲基钠盐(三苯甲基自由 基)加入到装有13C-丙酮酸GOmM)的试管中，得到含有15mM三苯甲基自由基的组合物。将所述组合物从试管中转移至样品杯中，并将样品杯插入到HyperSense DNP偏 振器(Oxford Instruments)中。将所述组合物在1. 4° K、3. 35T磁场的DNP条件下，在微 波(93. 89GHz)辐射下进行极化45min。随后在压力IObar和温度170°C下，将所述组合物溶入氢氧化钠、TRIS缓冲剂和 EDTA的水溶液中。得到的成像介质在pH 7. 2-7. 9下包含SOmM的超极化13C1-丙酮酸钠，并 且在给予过程中极化度为约18%。实施例2禁食大鼠肝模型-动物准备在本研究中包含两组大鼠，用于研究禁食和非禁食大鼠的肝代谢。非禁食大鼠允 许自由喂食，而禁食大鼠在MR-检测前约M小时移除它们的食物。实施例313C_MR检测实施例3a动物准备将导管插入尾部静脉，然后将大鼠放入MR扫描仪中。实施例北超极化13C-丙酮酸盐定量和给予在12s内，将3ml实施例1中制备的成像介质经尾部静脉导管注入到大鼠中。实施例3c13C_MR成像/光谱图将自制双调谐1HZil3C RF线圈安装在大鼠腹上，集中来自肝的信号。将大鼠放在3T 水平腔GE MR扫描仪中。为进行13C-MR光谱实验，每3秒应用切片选择性的(15mm板选择位于肝中心)RF脉 冲，以5°倾倒角开始注射。将收集到的用MATLAB处理过的数据，在傅里叶变换前用IOHz Lorentzian滤光器变迹，从幅度谱中取得动态数据点。从处理过的动力学曲线中，用13C-乳 酸盐的峰高和13C-丙氨酸的峰高导出用于统计比较的13C-乳酸盐的峰与13C-丙氨酸的峰的
12比值(见图1)。为进行3D-13C_MR光谱成像实验，使用双重自旋回波程序(Cunningham等， J. Mag. Reson. 187 =357-362(2007)，以可变倾倒角，中心相位编码命令，TE = 140ms, TR = 215ms (总采集时间14s), FOV = 8x 8cm和Icc分辨率下进行采集。从处理的3D幅度谱中， 对于每只大鼠，将从解剖学图像上观测到的包含绝大部分的肝组织的体素进行手动标记。 对于各个肝体素，计算幅度谱中13C-丙酮酸盐、13C-丙酮酸盐-水合物、13C-乳酸盐和13C-丙 氨酸峰下面积，将这四个面积的和称为总碳面积(见图1)。计算各个体素的相对于总碳面 积的乳酸盐面积和相对于总碳面积的丙氨酸面积，然后平均所有肝体素，得到平均乳酸盐 与总碳比值和平均丙氨酸与总碳比值的检验统计量。图2表明正常和禁食大鼠中代表性肝切片局部动力学曲线。这些最终动力学曲线 来自堆叠图插图，其中堆叠图中各水平线代表每3秒采集一次的超极化类物质的单独的幅 度谱。为清楚的缘故，已将丙酮酸盐-水合物从最终标绘的动力学曲线中除去，并且为易于 观测，通过四个因素中的一个缩小该丙酮酸盐曲线范围。在所述动力学曲线中，各标明的点 代表在该时间点上的丙酮酸盐( 171ppm)、乳酸盐( 183ppm)和丙氨酸( 176ppm)的 强度，即在相关堆叠图中那些脊的痕线，表示丙酮酸盐的吸收和转化。一般，乳酸盐和丙氨 酸曲线在注射后约20-30秒达稳定水平，意味着最高的乳酸盐和丙氨酸SNR出现在这个范 围内。选择3D-13C-MR光谱成像采集的成像窗非常重要，其中每个体素的SNR比全切片MRS 实验中的低很多。在定性上，在正常大鼠中的乳酸盐和丙氨酸曲线具有类似的最大振幅，而 在禁食大鼠中却显著不同(见图3)。应用Marm-Whitney秩和检验，乳酸盐与丙氨酸的比值 在统计学上有显著性差异(P < 0. 01)。图4表明来自3D-MRSI光谱的代表性切片，该3D-MRSI光谱具有正常和禁食大 鼠肝的Icm3体素分辨率(一般大鼠肝跨越一对切片)。所有禁食肝体素光谱表现出高的 乳酸盐比丙氨酸的比值，其证实从MRS采集中观测到结果。在定性上，在正常与禁食肝光 谱之间，观测到乳酸盐水平相当，但后者的丙氨酸水平较低。计算每只大鼠的平均乳酸盐 面积比总碳面积和平均丙氨酸面积比总碳面积的比值。图5显示这些乳酸盐分数。采用 Mann-Whitney秩和检验，乳酸盐与总碳面积的比值在正常组和禁食组之间没有统计学显著 性差异(P = 0. 42)，但是丙氨酸与总碳面积的比值在正常组和禁食组之间有统计学显著性 差异(P < 0. 01)。
1权利要求
1.一种应用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质，通过13C-MR检测测定ALT活性的方 法，其中检测13C-丙氨酸和任选的13C-乳酸盐和/或13C-丙酮酸盐的信号。
2.权利要求1的方法，其中使用13C-丙氨酸和任选的13C-乳酸盐和/或13C-丙酮酸 盐的信号产生用于检查下机体、机体部分、细胞、组织或机体样品的ALT活性的代谢特性指示。
3.权利要求1或2的方法，其中将所述成像介质给予人或非人动物体，以进行体内 13C-MR 检测。
4.权利要求1或2的方法，其中所述成像介质用于体外13C-MR检测。
5.权利要求2的方法，其中使用通过代谢特性得到的信息，来鉴别处于发展肝病风险 的患者和/或候选者，以便采取预防措施来避免急性或慢性肝病的发展。
6.权利要求1-5的方法，其中在第一时间点和其后一段时间内的各时间点测定ALT活性。
7.权利要求3、5或6的方法，其中将所述成像介质给予人或非人动物体，并且在给予后 400秒以内应用MR成像程序。
8.权利要求1-7的方法，其中所述超极化13C-丙酮酸盐通过13C-丙酮酸或13C-丙酮酸 盐的动态核极化获得。
9.超极化13C-丙酮酸盐在制备成像介质中的用途，所述成像介质用于通过1V-MR检测 测定ALT活性的方法中。
全文摘要
本发明涉及一种应用包含超极化13C-丙酮酸盐的成像介质，通过13C-MR检测测定丙氨酸转氨酶(ALT)活性的方法。
文档编号G01N33/50GK102083470SQ200980116578
公开日2011年6月1日 申请日期2009年4月30日 优先权日2008年5月2日
发明者D·B·维格尼龙, J·库尔哈尼维奇, R·E·赫德, S·J·尼尔森, Z-M·胡 申请人:加州大学评议会, 通用电气公司