专利名称：凝血时间延长原因的判定方法
技术领域：
本发明涉及用于判定血液试样中的凝血时间延长原因的方法。
背景技术：
凝血试验是测定从向样本或样本混合物中添加活化剂和/或Ca2+等的时刻开始 到形成可检测的纤维蛋白块时的时间(凝血时间、以下有时也仅称凝固时间)，其是用于筛 选凝血反应系统有无异常或测定个别因子的活性而实施的。作为典型例，有凝血酶原时间 (PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间等。PT是指向被测血浆中添加组织凝血活酶和Ca2+的混合液后到凝固时的时间，用于 对与外源性凝血机制有关的第VII因子、第X因子、第V因子、凝血酶原、纤维蛋白原等的凝 血活性进行综合性检查。另外，APTT是指向被测血浆中添加足够量的磷脂和活化剂(高岭 土、无水硅酸、鞣花酸等)及适量的Ca2+后到凝固时的时间，用于对与内源性凝血机制有关 的第XII因子、第XI因子、激肽释放酶原、高分子激肽原、第IX因子、第VIII因子、第X因 子、第V因子、凝血酶原、纤维蛋白原等的凝血活性进行综合性检查。一般来说，这些凝血试 验的异常是指凝血时间延长。凝血反应系统的异常反映出体内的出血倾向或血栓形成倾向 (凝血倾向)的征兆。作为其原因，考虑有如下几个1)凝血因子的缺乏或减少、2)存在针对构成凝血 系统的血液成分的抗体、幻存在针对凝血时间测定试剂中的成分的抗体、4)存在针对构成 凝血系统的血液成分和凝血时间测定试剂中的成分的复合物的抗体、幻施用了抑制凝血反 应的药剂等。但是，仅凭进行凝血时间的测定不能鉴别其原因是由于单纯的凝固因子缺乏导致 的活性降低，还是由于针对构成凝血系统的成分或凝血时间测定试剂中的成分等的抗体 (抑制物)抑制了凝血反应而导致的活性降低。另外，由于治疗方案根据该原因的不同而 异，因此该鉴别是很重要的。因此，进行向被测血浆中添加正常血浆，对其凝血时间校正的 (正常化的)程度作图来进行判定的凝血校正试验(混合试验)(非专利文献1)。以往，混合试验例如如下实施。准备通过向被测血浆添加正常血浆并混合使正常血浆的比例为0、20、50、80、 100%而制备的样品，进行APTT的测定。将其结果标绘制图(横轴混和的正常血浆的比例 或被测血浆的比例(％)、纵轴凝固时间(秒))，根据该曲线图的形状目测进行判定。例 如，凝固因子缺乏的情况下，添加少量的正常血浆(图I(A)中为20% )时凝固时间即显著 缩短而接近正常血浆时的值，因此显示为与被测血浆和正常血浆的点连接而成的直线(虚 线)相比向下凸出的曲线(图1(A))。存在凝固因子抑制物的情况下，即使提高正常血浆的添加比例，正常血浆中的该 凝固因子也会失活，因此添加正常血浆所引起的凝固时间的改善程度小，显示为向上凸起 的曲线(图1(B))。但是，根据样本的不同有时会呈现与虚线相同形状的曲线图(图1(C))，此时存在
3非常难以进行判定的问题。另外，混合试验是通过目测进行判定，并非将校正的程度定量化的统一的方法，最 终的判定取决于判定者，因此，判定结果因判定者的熟练程度而异的可能性也是个问题。另外，还存在判定结果随测定的试剂对凝固因子抑制物的敏感性的差异而改变的 可能性。作为特别依赖于试剂的敏感性的凝固因子抑制物，已知有狼疮抗凝物(以下称为 LA)。LA并非对各个凝固因子的抑制物，而是抑制磷脂依赖性凝血反应的免疫球蛋白。由于 凝血反应中必须存在磷脂，因此，通常很多凝血测定试剂中含有丰富的磷脂。LA与试剂中的 磷脂反应而将其消耗，结果抑制凝血反应，因此，PT、APTT之类的凝血检查多发现变为异常。 但是，已知LA的反应强度因磷脂的种类(来源、磷脂组成等)而异，因此判定结果会因所使 用的试剂而异。为了不受判定者熟练程度的影响而容易地进行判定，还已知如下的判定方法(非 专利文献2)设被测血浆的凝固时间为a、被测血浆与正常血浆的5 5的混合物的凝固时 间为b、正常血浆的凝固时间为C，1) (a+c)/2 ( b、2) (b_c)/a ≤ x、3)b_c ≤ x、4)b/c ≤ χ。上述判定方法1)只是将曲线上凸或是下凸进行数值化，目测判定和结果并没有 改变。判定方法2)也称为罗斯纳指数(Rosner Index)，被认为是对于判定LA特别有用的 判定方法，χ为0.15是适当的，而该值是通过白陶土凝固时间(KCT)设定的值。实际上，对 于各设备中使用的试剂需要设定适当的χ值，但该设定方法不明确(非专利文献幻。判定 方法3) 4)也需要在各设备中进行χ的设定，但该设定方法不明确，作为判定方法不能说 是充分的。非专利文献非专利文献1 检查和技术，Vol. ；34，no. 8，2006年8月，p735_742非专利文献2 临床检查法提要第32版，p443非专利文献3 =Thrombo. Haemost. Vol. 57，no. 2，1987，pl44_14
发明内容
如上所述，现有方法中，截止值的设定方法不明确，有漏检凝固因子抑制物为弱阳 性的样本的危险性。实际上，在本发明人的研究中，也发现了在LA弱阳性样本的情况下通 过混合试验所得的曲线向下凸出的例子。另外，混合试验受到测定的试剂对凝固因子抑制 物的敏感性的差异的影响较大，有测定结果因试剂的不同而改变的可能性。另外，目测判定 方法，如上所述受判定者经验的影响大，有判定结果因熟练程度的差异而改变的危险性。由此可见，迫切希望开发出不受试剂对凝固因子抑制物敏感性的强弱、判定者的 熟练程度的差异的影响，对于凝固时间延长原因是由于凝固因子抑制物的存在还是由于凝 固因子的缺乏都能够得到确定的判定结果的判定方法。本发明人进行了深入研究，结果发现，通过不是目测混合试验的结果而是对比曲 线图中的面积比、进而使截止值的设定也明确的如下判定方法，能够解决所述课题，从而完 成了本发明。S卩，本发明提供下述发明。1. 一种判定方法，其特征在于，是判定被测血浆中的凝血时间延长原因的方法，其中(1)测定(a)仅为被测血浆、(b)仅为正常血浆、和(C)将被测血浆与正常血浆以 至少一种混合比混合而成的试样的磷脂依赖性的凝血时间，(2)以凝血时间或凝血时间的延长率为纵轴、以被测血浆或正常血浆的混合比或 混合率为横轴对所述(a)、(b)、(c)的测定结果进行标绘、描画出得到的折线图，求出此时 的折线下面积A、和连接所述(a)和(b)的测定结果的点的线的线下面积B，(3)计算由面积A减去面积B所得到的面积(A-B)相对于面积B的比率((A-B)/ (B))面积比X)，(4)对凝固因子抑制物阳性血浆进行所述工序(1) ( 的操作，预先确定标准面 积比Y，(5)将面积比X与标准面积比Y进行对比，当Y < X时判定为凝固因子抑制物型， 当Y > X时判定为凝固因子缺乏型。2.如上述1所述的判定方法，其中，凝固因子抑制物阳性血浆的标准面积比Y，是 利用超出统计学上求得的多个正常人血浆的凝血时间的标准范围的上限值、且为该上限值 +50%以内的凝血时间的凝固因子抑制物阳性血浆而求出的。3.如上述2所述的判定方法，其中，正常人血浆的凝血时间的标准范围是对多个 正常人血浆的凝血时间进行统计学处理而得到的值。4.如上述1所述的判定方法，其中，在上述1的工序O)中以凝血时间为纵轴时， 所述面积A和面积B使用减去常数而得到的值。5.如上述4所述的判定方法，其中，所述常数为，从描画出所述折线图时的正常血 浆的凝血时间的点画出平行于横轴的辅助线时该辅助线下的面积。6.如上述1 5中任一项所述的判定方法，其中，凝血时间为选自PT (凝血酶原时 间)、APTT (活化部分凝血活酶时间)、dPT (稀释凝血酶原时间)、dAPTT (稀释活化部分凝 血活酶时间)、KCT(白陶土凝固时间)和dRVVT (稀释蝰蛇毒时间)中的至少一种。7.如上述1 6中任一项所述的判定方法，其中，凝固因子抑制物为选自狼疮抗凝 物(LA)、第VIII因子抑制物、第IX因子抑制物和第V因子抑制物中的至少一种。根据本发明方法，可以更准确地进行目前难以判定的凝固因子抑制物为弱阳性的 血浆的判定。另外，根据本发明方法，可以不受判定者熟练程度的影响而容易且准确地进行 判定。因此，根据本发明方法，可以确定通过凝血时间试验测定的凝血时间延长的患者的正 确的治疗方案。
图1是表示通过现有方法进行的混合试验的结果的图。(A)表示凝固因子缺乏型， (B)表示凝固因子抑制物型，(C)表示原因不明确的模式。图2表示工序O)的折线图下面积的例子。图3表示工序O)的折线图下面积的例子。图4表示工序(3)的面积(A-B)的例子(与图2对应)。图5表示工序(3)的面积(A-B)的例子(与图3对应)。图6是对样本编号1作图得到的折线图。
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图7是对样本编号4作图得到的折线图。图8是对样本编号6作图得到的折线图。
具体实施例方式作为本发明中使用的被测血浆，与直接使用血液相比更优选使用血浆，进一步优 选使用除去血小板的血浆。这是因为，可以排除由于来自血浆中残留的血小板的磷脂使LA 之类的磷脂依赖性的凝固因子抑制物成为阴性的可能性。用于与被测血浆混合的正常血浆，可以是自己制备或市售的正常血浆，优选去除 血小板处理后的正常血浆。所述的去除血小板的方法使用公知的方法即可，例如可以使 用离心分离、去除血小板过滤器处理等。作为市售品，已知有混合正常血浆(Precision BioLogic公司制)、贫血小板血浆(Technoclone公司)、LAtrol (注册商标)正常对照 (American Diagnostica &司)等。作为凝固因子抑制物，除LA以外，还已知第VIII因子抑制物、第IX因子抑制物、 第V因子抑制物等，但是不限于这些，只要使用对对象凝固因子抑制物显示敏感性的凝血 时间测定试剂，则均可应用本发明方法。例如，以LA为对象时，只要是对LA显示敏感性的磷脂依赖性的凝血时间测定试剂 则可以是任何一种，可以使用测定PT、APTT、dAPTT、dPT、KCT和dRVVT等的试剂。另外，以第 VIII因子抑制物、第IX因子抑制物为对象时可以使用APTT测定试剂等，以第V因子抑制物 为对象时可以使用APTT测定试剂、PT测定试剂等。所述试剂均可使用市售品。例如，作为 PT测定用试剂，例如有Coagpia (注册商标)PT-S (积水医疗株式会社制)JhromboCheckPt plus (希森美康公司制)和STA试剂系列PT (罗氏公司制)等市售。作为APTT测定用试剂， 例如有Coagpia (注册商标)APTT-S (积水医疗株式会社制)、ThromboCheck APTT-SLA (希 森美康公司制)和APTTliquid RD (罗氏公司制)等市售。另一方面，作为可根据凝血试验的异常怀疑为缺乏或减少的凝固因子，可以列举 纤维蛋白原、凝血酶原、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XI因 子、第XII因子、激肽释放酶原、高分子激肽原、血管性血友病因子(VWF)等。在本发明的判定方法的工序(1)中，测定(a)仅为被测血浆、(b)仅为正常血浆、 和(c)如上所述得到的混合试样的凝血时间。使用被测血浆与正常血浆以至少一种混合比混合而成的试样的凝血时间的测定 (混合试验)中的标绘点数，包括被测血浆和正常血浆自身在内为3点以上即可，但是，为 了明确被测血浆与正常血浆的混合比的变动所伴随的凝固时间的变动模式，优选为4点以 上、更优选5点以上。另外，标绘点数的上限没有特别限制，从经济性和测定时间的方面考 虑优选为10点以下，更优选为7点以下。凝固时间的延长率是指将正常血浆的凝固时间与仅含被测血浆时的凝固时间的 差设定为1时的相对比例。当然也可以用设该凝固时间的差为100时的相对百分数等表示。工序⑵是使用(a)仅为被测血浆的凝固时间、(b)仅为正常血浆的凝固时间和 (c)它们的混合液的凝固时间的测定结果，以凝血时间或凝血时间的延长率为纵轴、以被测 血浆或正常血浆的混合比或混合率为横轴，对所述(a)、(b)、(c)的测定结果进行标绘，描 画出得到的折线图，求出此时的折线下面积A、和连接所述(a)和(b)的测定结果的点的线的线下面积B。例如，以凝固时间的延长率为纵轴时的折线图的例子如图2和图3所示(标 绘点数为3、即混合的液体为一种的例子)。在此，面积㈧为例如图2或图3所示的四边 形的面积。图4是在图2中添加了对角线的图，图5是在图3中添加了对角线的图。面积 (B)如图4或图5所示是以对角线为斜边的直角三角形的面积。另外，以凝血时间为纵轴 时，所述面积A和面积B可以使用原来的值，也可以使用从两者中减去常数而得到的值。作 为该常数，例如可以使用从正常血浆的凝固时间的标绘点画出平行于横轴的辅助线时该辅 助线下的面积。工序( 是计算从折线图与横轴和纵轴所成的多边形的面积(A)中减去所述三角 形的面积所得的面积(A-B)，相对于以连接仅为被测血浆和仅为正常血浆的凝血时间或凝 固时间的延长率的对角线为斜边的直角三角形的面积⑶的比率((A-B)/(B))面积比X) 的工序。另外，面积比可以以百分率表示。图4的情况下面积㈧大于面积⑶，因此(A-B)/⑶为正数。另一方面，图5的 情况下面积(A)小于面积(B)，因此(A-B)/(B)为负数。工序是设定截止值的工序。作为用于设定截止值的试样，为了提高凝固因子抑制物的检测灵敏度，优选使用 显示与正常人血浆的凝固时间接近的凝固时间的凝固因子抑制物阳性血浆。例如，截止 值设定用试样的凝血时间，优选大于将多个正常人血浆的凝血时间进行统计学处理而得到 的正常人的标准范围的上限值，并且为上限值+50%以内，更优选+20%以内，进一步优选 +10%以内。另外，只要是落入所述范围的凝固因子抑制物阳性血浆即可，可以使用弱阳性血 浆，也可以使用将强阳性血浆用正常血浆梯度稀释后的血浆。作为所述已知的凝固因子抑制物阳性血浆，也可以使用市售品。例如，作为LA阳 性血浆的市售品，已知LAtrol (注册商标)(American Diagnostica公司)、狼疮阳性对 照(Precision BioLogic 公司制)、人血浆狼疮抗凝物(Geroge King Bio-Medical 公司) 等。作为第VIII因子抑制物的市售品，已知带抑制物的人血浆VIII因子(Geroge King Bio-Medical公司)或VIII因子抑制物血浆(Technoclone公司)等。其中，从所用试剂或测定设备等的差异方面考虑，可以根据实施混合试验的每个 设备来适当设定截止值(标准面积比Y)。另外，稀释试样的凝血时间测定试剂和正常人的凝固时间测定试剂使用相同的测 定试剂。作为例子，使用Coagpia(注册商标)APTT-S(积水医疗株式会社制、以下称为试剂 A)和ThromboCheck APTT-SLA (希森美康公司制、以下称为试剂B)时的APTT的例子如表1 所示。[表1]
7APTT
试剂A试剂B标准范围26.5~36.624.6 35.71/451.543.21/646.139.9稀 释 倍 率1/839.935.81/1036.033.41/1235.532.81/1434.331.51/1633.930.7表1中，试剂A的情况下，截止值设定用试样为APTT显示为39. 9秒、比正常人的 标准范围36. 6秒大的8倍稀释试样。试剂B的情况下，截止值设定用试样为APTT显示为 35. 8秒、比正常人的标准范围35. 7秒大的8倍稀释试样。另外，正常人的标准范围如后所 述，优选将多个正常人血浆的凝血时间进行统计学处理而得到的范围。工序( 是判定凝固因子抑制物型或凝固因子缺乏型的工序，将面积比X与标准 面积比Y进行对比，当Y < X时可以判定为凝固因子抑制物型，当Y > X时可以判定为凝固 因子缺乏型。判定可以通过数值对比来进行，因此是明确的，不需要熟练。在此，凝固因子 抑制物型是指凝血时间延长的原因在于所述凝固因子抑制物。凝固因子缺乏型是指凝血时 间延长的原因在于所述凝固因子的缺乏。所述的面积或面积比可以通过实际作图等来进行计算，但是只要能够得到相同的 计算结果，则其方法不受限制。即，可以在凝固时间测定设备中附加能够得到该计算结果的 功能，使其根据试样的测定结果自动地进行计算。实施例以下，列举实施例进一步详细说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。实施例1(1)截止值设定用试样的确定准备将LA阳性血浆用正常血浆稀释4 16倍的样本各50 μ L，添加APTT测定 试剂50 μ L，在37°C加热3分钟后，再添加氯化钙溶液50 μ L，使用全自动凝血分析装置 Coapresta (注册商标)2000(积水医疗株式会社销售)，测定凝固时间。作为LA阳性血浆使用狼疮阳性对照，作为正常血浆使用混合正常血浆(均为 Precision BioLogic公司制)。另外，作为APTT测定试剂，使用Coagpia(注册商标) APTT-S (积水医疗株式会社制、以下称为试剂A)和ThromboCheck APTT-SLA (希森美康公司 制、以下称为试剂B)。试剂的正常标准范围是基于用各试剂测定的48位正常人的测定值， 以凝固时间的平均值士2SD来设定的。如上述表1所示，试剂A的情况下10倍稀释样本为36. O秒，已经在正常标准范围 内5 36. 6秒)，因此截止值的设定使用8倍稀释样本。同样，试剂B的情况下10倍 稀释样本为33. 4秒，也在正常标准范围内6 35. 7秒)，因此截止值的设定使用8倍 稀释样本。(2)混合试验的实施使用⑴中所用的8倍稀释样本和表2所示的LA阳性血浆(样本编号1 5)、凝固因子缺乏血浆(样本编号6 7)、华法林施用患者血浆(样本编号8 10)，按照以下的 顺序实施混合试验。准备被测血浆以0、20、50、100%的比例与正常血浆混合的试样，使用(1)中所示 的APTT测定试剂测定凝固时间。然后，根据各凝固时间计算相对于被测血浆为0% (仅为正常血浆)的凝固时间延 长率，以凝固时间延长率为纵轴、以被测血浆的比例为横轴进行标绘，制成折线图。通过从该折线图下面积中减去以连接被测血浆100%的凝固时间延长率和被测血 浆0% (仅为正常血浆)的凝固时间延长率的对角线为斜边的直角三角形的面积来计算该 对角线与该折线图所成的多边形的面积(图6、7、8)，并计算所得面积相对于以该对角线为 斜边的直角三角形的面积的比例(面积比(％ ))(表2)。将利用8倍稀释样本计算的面积比(％)设定为各试剂的截止值，达到该截止值以 上时判定为凝固因子抑制物型(以下有时仅记作“抑制物型”)，小于该截止值时判定为凝 固因子缺乏型(以下有时仅记作“因子缺乏型”)。此次，在测定点为3点(被测血浆的比例0,50,100% )时和测定点为4点(被测 血浆的比例0、20、50、100% )时计算两种面积比(％ )，分别作为“本发明3点”、“本发明4 点”显示于表中(表2、3)。[表 2]
比较例1 (利用市售LA试剂进行的测定)使用市售的LA测定试剂LA test “Gradipore“(医学生物学研究所社制)和 StaclotLA(罗氏公司制)，根据附带的资料对与上述同样的样本(样本编号1 5)进行 测定。
权利要求
1.一种判定方法，其特征在于，是判定被测血浆中的凝血时间延长原因的方法，其中(1)测定(a)仅为被测血浆、(b)仅为正常血浆、和(c)将被测血浆与正常血浆以至少 一种混合比混合而成的试样的凝血时间，(2)以凝血时间或凝血时间的延长率为纵轴、以被测血浆或正常血浆的混合比或混合 率为横轴对所述(a)、(b)、(c)的测定结果进行标绘、描画出得到的折线图，求出此时的折 线下面积A、和连接所述(a)和(b)的测定结果的点的线的线下面积B，(3)计算由面积A减去面积B所得到的面积(A-B)相对于面积B的比率(A-B)/(B)即 面积比X，(4)对凝固因子抑制物阳性血浆进行所述工序(1) ( 的操作，预先确定标准面积比Y，(5)将面积比X与标准面积比Y进行对比，当Y< X时判定为凝固因子抑制物型，当Y >X时判定为凝固因子缺乏型。
2.如权利要求1所述的判定方法，其中，凝固因子抑制物阳性血浆的标准面积比Y，是 利用超出统计学上求得的多个正常人血浆的凝血时间的标准范围的上限值、且为该上限值 +50 %以内的凝血时间的凝固因子抑制物阳性血浆而求出的。
3.如权利要求2所述的判定方法，其中，正常人血浆的凝血时间的标准范围是对多个 正常人血浆的凝血时间进行统计学处理而得到的值。
4.如权利要求1所述的判定方法，其中，在权利要求1的工序(2)中以凝血时间为纵轴 时，所述面积A和面积B使用减去常数而得到的值。
5.如权利要求4所述的判定方法，其中，所述常数为，从描画出所述折线图时的正常血 浆的凝血时间的点画出平行于横轴的辅助线时该辅助线下的面积。
6.如权利要求1 5中任一项所述的判定方法，其中，凝血时间为选自PT(凝血酶原时 间)、APTT (活化部分凝血活酶时间)、dPT (稀释凝血酶原时间)、dAPTT (稀释活化部分凝 血活酶时间)、KCT(白陶土凝固时间)和dRVVT (稀释蝰蛇毒时间)中的至少一种。
7.如权利要求1 6中任一项所述的判定方法，其中，凝固因子抑制物为选自狼疮抗凝 物(LA)、第VIII因子抑制物、第IX因子抑制物和第V因子抑制物中的至少一种。
全文摘要
本发明提供准确且容易的凝血时间延长原因的判定方法。一种判定方法，其特征在于，是判定被测血浆中的凝血时间延长原因的方法，其中(1)测定(a)仅为被测血浆、(b)仅为正常血浆、和(c)将被测血浆与正常血浆以至少一种混合比混合而成的试样的凝血时间；(2)以凝血时间或凝血时间的延长率为纵轴、以被测血浆或正常血浆的混合比或混合率为横轴对所述(a)、(b)、(c)的测定结果进行标绘、描画出得到的折线图，求出此时的折线下面积A、和连接所述(a)和(b)的测定结果的点的线的线下面积B；(3)计算由面积A减去面积B所得到的面积(A-B)相对于面积B的比率(A-B)/(B)即面积比X；(4)对凝固因子抑制物阳性血浆进行所述工序(1)～(2)的操作，预先确定标准面积比Y；(5)将面积比X与标准面积比Y进行对比，当Y≤X时判定为凝固因子抑制物型，当Y＞X时判定为凝固因子缺乏型。
文档编号G01N33/86GK102066947SQ20098012260
公开日2011年5月18日 申请日期2009年6月16日 优先权日2008年6月18日
发明者中村来美, 森川千鹤, 矢后弘和, 须长宏行 申请人:积水医疗株式会社