人乳头状瘤病毒早期及晚期感染之免疫分析试验的制作方法

专利名称：人乳头状瘤病毒早期及晚期感染之免疫分析试验的制作方法
人乳头状瘤病毒早期及晚期感染之免疫分析试验本项发明应用相关参照此专利应用范围受利于美国临时专利申请序号61/131，991，2008年6月13号提 交，和美国临时专利申请序号61/192，912，2008年9月22日提交。每一上述相关之专利申 请，在此以提及方式纳入。图示概述图IA说明以抗E7单克隆抗体经免疫组织化学(IHC)组织芯片染色，鳞状细胞癌 (SCC)组织的代表性图。图IB说明图IA之鳞状细胞癌个案正常上皮细胞(与肿瘤组织相距15毫米)代 表性图。图IC说明以相同抗E7单克隆抗体，经免疫组织化学组织芯片染色鳞状细胞癌样 本的代表性图。图ID说明图IC肿瘤细胞之细胞质染色放大代表性图。图2A说明以抗E7单克隆抗体，经免疫组织化学染色腺癌(ADC)肿瘤细胞样本之 代表性图。图2B说明图2A腺癌样本之相关正常上皮细胞(与肿瘤组织相距15毫米)代表 性图。图2C说明图2A腺癌细胞之细胞质染色放大代表性图。图3A说明第三级子宫颈上皮内赘瘤结构不良细胞代表性染色图，依据另一发明 实施案例，以老鼠单克隆抗人乳头状瘤病毒E7抗体进行免疫组织化学试验。图;3B说明图2A结构不良上皮细胞之放大表表性图，指出第三级子宫颈上皮内赘 瘤结构不良之细胞核染色。图4A说明第二级子宫颈上皮内赘瘤结构不良细胞代表性染色图，依据一发明实 施案例，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行免疫组织化学试验。图4B说明图IA之第二级子宫颈上皮内赘瘤样本结构不良组织邻近之正常上皮细 胞代表性染色图，以相同之老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行免疫组织化学试验。图4C说明第三级子宫颈上皮内赘瘤组织之结构不良性上皮细胞染色结果，依据 另一发明实施案例，以与图IA相同之老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行免疫组 织化学试验。图4D说明另一第三级子宫颈上皮内赘瘤组织之结构不良性上皮细胞染色结果， 依据另一发明实施案例，以与图IC相同之老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行免 疫组织化学试验。图5A说明临床检体诊断为意义不明的不典型鳞状细胞(ASCUS)之染色结果，依据 一发明实施案例，在溶液中以老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行免疫细胞化学 (ICC)试验。图5B说明与图5A相同之临床检体染色结果，依据一发明实施案例，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。图6A说明临床检体诊断为第二级子宫颈上皮内赘瘤之染色结果，依据一发明实 施案例，在溶液中以老鼠之抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。图6B说明另一诊断为第二级子宫颈上皮内赘瘤临床检体之染色结果，依据另一 发明实施案例，在溶液中以老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。图7A说明临床检体诊断为第三级子宫颈上皮内赘瘤之染色结果，依据另一发明 实施案例，在溶液中以老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。图7B说明另一也诊断为第三级子宫颈上皮内赘瘤临床检体之染色结果，以图7A 相同之老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行染色。图7C说明与图7B相同之临床检体的另一免疫细胞化学染色图，以相同老鼠之抗 人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行染色。图7D说明与图7B相同之临床检体的另一免疫细胞化学染色图，以相同老鼠之抗 人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行染色。图7E说明与图7B相同之第三级子宫颈上皮内赘瘤样本的另一免疫细胞化学染色 图，但依据另一发明实施案例，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体进行染色。图7F说明与图7E相同之第三级子宫颈上皮内赘瘤样本的另一免疫细胞化学染色 图，以相同之老鼠之抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体进行染色。图7G说明与图:3B相同之第三级子宫颈上皮内赘瘤样本染色结果，但以老鼠之抗 P16单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。图8说明临床诊断为腺癌之染色结果，依据另一发明实施案例，以老鼠之抗人乳 头状瘤病毒E6单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。图9A说明临床诊断为鳞状细胞癌之染色结果，依据另一发明实施案例，以老鼠之 抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。图9B说明与图9A相同之鳞状细胞癌样本染色结果，依据另一发明实施案例，以老 鼠之抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。 图9C说明与图9A相同之鳞状细胞癌样本染色结果，依据另一发明实施案例，以老 鼠之抗P16单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。图IOA说明临床诊断为正常样本之染色结果，依据另一发明实施案例，以老鼠之 抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。图IOB说明与图6A相同之临床样本染色结果，依据另一发明实施案例，以老鼠之 抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。图IlA说明另一子宫颈抹片样本之细胞质染色结果，依据另一发明实施案例，以 老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。图IlB说明与图IlA相同样本之细胞核染色结果，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒E7 单克隆抗体进行试验。图IlC说明另一子宫颈抹片样本之细胞质染色结果，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒 E6单克隆抗体进行试验。

图12A说明临床诊断为第一级子宫颈上皮内赘瘤样本之染色结果，依据另一发明
7实施案例，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。图12B说明与图12A相同第一级子宫颈上皮内赘瘤样本之另一免疫细胞化学染色 结果，以相同老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行试验。图12C说明与图12A相同第一级子宫颈上皮内赘瘤样本之另一免疫细胞化学染色 结果，以相同老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行试验。图12D说明与图12A相同第一级子宫颈上皮内赘瘤样本之另一免疫细胞化学染色 结果，但依据另一发明实施案例，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体进行免疫细胞 化学试验。图12E说明与图12D相同第一级子宫颈上皮内赘瘤样本之另一免疫细胞化学染色 结果，以相同老鼠之抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体进行试验。图12F说明与图12A相同第一级子宫颈上皮内赘瘤样本之染色结果，依据另一发 明实施案例，以老鼠之抗P16单克隆抗体进行免疫细胞化学试验。图13A说明侦测人乳头状瘤病毒Ll蛋白之免疫印迹法结果，依据一发明实施案 例，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒Ll单克隆抗体进行试验。图1 说明另一侦测人乳头状瘤病毒Ll蛋白之免疫印迹法结果，以与图1相同之 老鼠之抗人乳头状瘤病毒Ll抗体进行试验。图14A说明与图13A相同侦测人乳头状瘤病毒E6蛋白免疫印迹法之结果，依据另 一发明实施案例，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行试验。图14B说明与图1 相同侦测人乳头状瘤病毒E6蛋白免疫印迹法之结果，依据另 一发明实施案例，使用与图14A相同之老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行试验。图15B说明与图13A及图14A相同免疫印迹法之结果，依据另一发明实施案例，以 老鼠之抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体侦测人乳头状瘤病毒E7蛋白。图16说明由10组子宫颈抹片样本之细胞裂解物，抗体基因芯片试验分析之平均 萤光强度结果，依据另一发明实施案例，侦测各式人乳头状瘤病毒蛋白和细胞内生性蛋白 质。图17为图16中10组细胞裂解物每一样本之萤光强度结果，依据发明另一实施案 例，侦测人乳头状瘤病毒Ll蛋白。图18为图16中10组细胞裂解物每一样本之抗体基因芯片分析萤光强度结果，依 据发明另一实施案例，侦测人乳头状瘤病毒E7蛋白以及细胞pl6 INMa蛋白。图19为图16中10组细胞裂解物每一样本之抗体基因芯片分析萤光强度结果，依 据发明另一实施案例，侦测人乳头状瘤病毒Ll蛋白以及细胞p53蛋白。图20为图16中10组细胞裂解物每一样本之抗体基因芯片分析萤光强度结果，依 据发明另一实施案例，侦测人乳头状瘤病毒E7蛋白以及来自Rb蛋白之细胞磷酸盐。图21为另一图片说明样本S2之抗体芯片分析萤光强度结果。图22图16中10组细胞裂解物每一样本之抗体芯片分析萤光强度结果，依据发明 另一实施案例，侦测细胞p21 WAFl以及p53蛋白。图23说明酶联免疫吸附试验试验结果，针对临床诊断为鳞状细胞癌，或与人乳头 状瘤病毒阴性血清样本比对后为人乳头状瘤病毒阳性(经聚合酶链反应测试)之人体血清 样本，侦测其人乳头状瘤病毒E6，E7和Ll蛋白，依据发明另一实施案例，以兔子之抗人乳头状瘤病毒多克隆抗体作为包被及侦测。图M说明以萤光流式细胞仪(FACQ进行夹心珠法侦测人乳头状瘤病毒16L1重 组蛋白之结果，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒16L1单克隆抗体作为包被抗体，以兔子之抗人 乳头状瘤病毒16L1多克隆抗体作为侦测抗体。图25说明以萤光流式细胞仪(FACQ进行夹心珠法侦测人乳头状瘤病毒16E6重 组蛋白之结果，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒16E6单克隆抗体作为包被抗体，以兔子之抗人 乳头状瘤病毒16E6多克隆抗体作为侦测抗体。图沈说明以萤光流式细胞仪(FACQ进行夹心珠法侦测人乳头状瘤病毒18E6重 组蛋白之结果，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒18E6单克隆抗体作为包被抗体，以兔子之抗人 乳头状瘤病毒18E6多克隆抗体作为侦测抗体。图27说明以萤光流式细胞仪(FACQ进行夹心珠法侦测人乳头状瘤病毒16E7重 组蛋白之结果，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒16E7单克隆抗体作为包被抗体，以兔子之抗人 乳头状瘤病毒16E7多克隆抗体作为侦测抗体。图观说明以萤光流式细胞仪(FACQ进行夹心珠法侦测人乳头状瘤病毒16E6重 组蛋白之结果，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒16E6单克隆抗体作为包被抗体，以兔子之抗人 乳头状瘤病毒16E6多克隆抗体作为侦测抗体。图四说明以萤光流式细胞仪(FACS)进行夹心珠法侦测人乳头状瘤病毒18E6重 组蛋白之结果，以老鼠之抗人乳头状瘤病毒18E6单克隆抗体作为包被抗体，以兔子之抗人 乳头状瘤病毒18E6多克隆抗体作为侦测抗体。图30A说明利用与金颗粒共轭之兔子之抗人乳头状瘤病毒Ll多克隆抗体进行之 单步骤测流试验用以侦测人乳头状瘤病毒Ll重组蛋白(由左至右875，435，0微克/毫 升)之结果，其与金颗粒共轭之兔子之抗人乳头状瘤病毒Ll多克隆抗体在与人乳头状瘤病 毒Ll蛋白产生键结后会自薄膜上剥离，由此作为侦测试剂。图30B说明单步骤测流试验侦测鳞状细胞癌病患血清样本(左)之人乳头状瘤病 毒Ll重组蛋白之结果，与正常血清(人乳头状瘤病毒阴性)做比较，使用与图30B相同之 方法。图30C说明利用与金颗粒共轭之老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行之 单步骤测流试验用以侦测人乳头状瘤病毒E6重组蛋白(由左至右10，2，0微克/毫升)之 结果，其与金颗粒共轭之老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体在与人乳头状瘤病毒E6 蛋白产生键结后会自薄膜上剥离，由此作为侦测试剂。图30D说明单步骤测流试验侦测鳞状细胞癌病患血清样本(由左至右为第一及第 二)人乳头状瘤病毒Ll蛋白之结果，与正常血清(人乳头状瘤病毒阴性)做比较，使用与 图30C相同之方法。图30E说明利用与金颗粒共轭之老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体进行之 单步骤测流试验用以侦测人乳头状瘤病毒E6重组蛋白(由左至右875，435，0微克/毫 升)之结果，其与金颗粒共轭之老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体在与人乳头状瘤病 毒E6蛋白产生键结后会自薄膜上剥离，由此作为侦测试剂。图30F说明利用与金颗粒共轭之老鼠之抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体进行之 单步骤测流试验用以侦测人乳头状瘤病毒E7重组蛋白(由左至右0，660，66，6. 6，0.66微克/毫升)之结果，其与金颗粒共轭之老鼠之抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体在与人乳头 状瘤病毒E7蛋白产生键结后会自薄膜上剥离，由此作为侦测试剂。图30G说明单步骤测流试验侦测人乳头状瘤病毒阳性患血清样本(左)人乳头状 瘤病毒E7蛋白之结果，与人乳头状瘤病毒阴性血清(右)做比较，使用与图30F相同之方 法。本项发明摘要本项发明主体提供利用各式抗人乳头状瘤病毒重组蛋白之单克隆抗体进行各式 免疫试验原位侦测人乳头状瘤病毒蛋白，此人乳头状瘤病毒蛋白包括感染高风险或低风险 人乳头状瘤病毒型，其可被单一特异性单克隆抗体或一般泛抗体侦测到。在一实施案例中， 一方法用来侦测人体人乳头状瘤病毒感染，利用一种或多种能与人乳头状瘤病毒早期蛋白 产生键结之单克隆抗体，进行临床人类检体之免疫试验和人体细胞核染色。在另一实施案 例中，一方法用来侦测人体人乳头状瘤病毒感染，利用一种或多种抗体，产生多种纯化后人 乳头状瘤病毒重组蛋白，对临床检体之人体细胞进行免疫组织化学试验，并比较细胞核与 细胞质之染色。另一方法亦用来侦测人体人乳头状瘤病毒感染，利用多种抗体与筛选自E6， E7，L1及其组合群蛋白之人乳头状瘤病毒蛋白产生键结，进行临床人类检体之免疫试验，并 以两种以上抗体比较人体细胞染色情形，若至少一种以上抗体试验呈阳性染色结果，则表 示人体受人乳头状瘤病毒感染。在一方面，本发明提供一抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体，能应用于一免疫试验中， 对人乳头状瘤病毒晚期感染之人类细胞进行细胞质染色。在另一面项中，本发明提供一抗 人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体和抗人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体，能应用于一免疫试验 中，对人类细胞进行细胞核染色，以表示在疾病发展阶段中之人乳头状瘤病毒感染状况。人 乳头状瘤病毒感染之人体细胞的细胞核染色，显示人乳头状瘤病毒之早期感染，而细胞质 之染色，则指出病变增生成为晚期疾病阶段。使用于免疫试验之抗人乳头状瘤病毒单克隆 抗体包括，抗人乳头状瘤病毒E7、抗人乳头状瘤病毒E6和浓缩人乳头状瘤病毒Ll单克隆 抗体，以及其结合。在另一面项中，本发明提供一抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体和人乳 头状瘤病毒E7蛋白，作为生物标记，用以侦测子宫颈癌之增生。此外，本发明提供多种免疫 试验之实施方法，包括免疫组织化学和免疫细胞化学分析。单克隆抗体对人乳头状瘤病毒 蛋白具有高度专一性，亦可用于人乳头状瘤病毒侦测之免疫试验。在一实施案例中，以抗人 乳头状瘤病毒单克隆抗体对上皮组织样本的细胞核染色，可显示一般人乳头状瘤病毒之感 染。在另一实施案例中，以抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体对上皮组织样本之细胞质染色，可 显示人乳头状瘤病毒感染之病变增生。在另一方面，提供临床检体免疫试验之试剂盒，包含抗人乳头状瘤病毒单克隆抗 体其能对人乳头状瘤病毒感染之人类细胞之细胞核进行染色，显示人乳头状瘤病毒之感 染；对人乳头状瘤病毒感染之人类细胞之细胞质进行染色，则显示人乳头状瘤病毒晚期疾 病阶段之感染。在另一方面，人体人乳头状瘤病毒感染之侦测试剂盒，包含一抗人乳头状瘤 病毒单克隆抗体，其能用于人类临床检体中进行免疫试验，能对来自临床之人体细胞进行 细胞核染色，并与人体细胞之细胞质染色做比较。本发明提供各式免疫试验，包括免疫组织化学，免疫细胞化学分析，及流细胞试 验，利用各式抗人乳头状瘤病毒重组蛋白之单克隆抗体进行各式免疫试验原位侦测人乳头状瘤病毒蛋白，此人乳头状瘤病毒蛋白包括感染高风险或低风险人乳头状瘤病毒型，其可 被单一特异性单克隆抗体或一般泛抗体侦测到。本发明亦提供人乳头状瘤病毒免疫细胞化 学试验、人乳头状瘤病毒流细胞试验和人乳头状瘤病毒免疫组织化学试验，侦测子宫颈细 胞或组织中人乳头状瘤病毒蛋白之存在。此外，单克隆抗体对人乳头状瘤病毒蛋白具有高 度专一性，可用于人乳头状瘤病毒免疫细胞化学或人乳头状瘤病毒流细胞试验。在一实施案例中，一免疫细胞试验方法用来原位侦测人体人乳头状瘤病毒感染， 侦测玻片上含有人类细胞薄层之生物检体中，来自多种人乳头状瘤病毒型之人乳头状瘤病 毒蛋白，利用多种抗体对人类细胞薄层进行染色。方法包含提供来自人体之临床检体，将 检体制备成不正常和正常形态之人类细胞均勻混合物溶液，将混合物于玻片上制成细胞薄 层，以一种或多种抗多种纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白之抗体，进行免疫细胞化学试验， 玻片上临床检体中的不正常和正常形态之细胞混合物中，来自一种或多种人乳头状瘤病毒 型之一种或多种人乳头状瘤病毒蛋白可被原位染色。在另一实施案例中，提供侦测人体人乳头状瘤病毒感染之方法，包括提供人类临 床检体，该检体被制备成含有不正常和正常型态之人类细胞混合物之溶液，并以试剂标记 一种或多种抗体，。利用一种或多种抗一种或多种纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白抗体，对 含有不正常和正常型态之人类细胞混合物进行染色。该方法进一步包含进行一样或多样流 细胞试验，将含有不正常和正常型态之人类细胞混合物之溶中单一细胞分离以进行侦测， 侦测液态临床检体不正常和正常型态之人类细胞混合物中，一种或多种人乳头状瘤病毒型 之人乳头状瘤病毒蛋白之存在。在一实施案例中，产生一种或多种抗一种或多种纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白 之抗体，其中至少一种抗体可辨识人乳头状瘤病毒早期蛋白。在另一实施案例中，此一种或 多种抗体以试剂进行标记，将人体生物样本中之多种人类细胞制备成溶液，各式抗体与来 自各种人乳头状瘤病毒型之各种人乳头状瘤病毒蛋白产生键结，与被标记的抗体反应，藉 由试剂的表达被侦测到。在另一实施案例中，试剂包括比色试剂、萤光染色试剂和其他试 剂，作为流细胞试验中人类细胞分离和定性之试剂。此外，提供一进行免疫试验之试剂。该试剂包含抗体前封闭液、抗体后封闭液、抗 人乳头状瘤病毒抗体作为一级抗体、与抗老鼠或抗兔子免疫球蛋白共轭之辣根过氧化物酶 或生物素、或其他作为二级抗体之试剂，含有适当试剂之溶液作为二级抗体之基质被侦测。在另一实施案例中，提供试剂盒侦测人体人乳头状瘤病毒感染，包含抗人乳头状 瘤病毒单克隆抗体，其能与人乳头状瘤病毒早期蛋白产生键结，以用来进行临床检体之免 疫细胞化学试验，该检体被制备成含有不正常和正常型态之人类细胞混合物之溶液，，并置 于玻片上形成细胞薄层，将一种或多种来自一种或多种人乳头状瘤病毒型之人乳头状瘤病 毒蛋白加以原位染色。本发明提供多种固态表面免疫试验，利用各式抗人乳头状瘤病毒重组蛋白之单克 隆抗体进行各式免疫试验原位侦测人乳头状瘤病毒蛋白，此人乳头状瘤病毒蛋白包括感染 高风险或低风险人乳头状瘤病毒型，其可被单一特异性单克隆抗体或一般泛抗体侦测到。 本发明亦提供人乳头状瘤病毒膜免疫印迹分析法、蛋白质晶片基因芯片试验、人乳头状瘤 病毒微粒试验、人乳头状瘤病毒测流快速试验、人乳头状瘤病毒垂直通透快速试验、人乳头 状瘤病毒微流体快速试验、酶免疫分析方法(EIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)，侦测生物检体如子宫颈细胞或组织中人乳头状瘤病毒蛋白之存在。此外，亦提供进行这些试验的试 剂和设备。在一实施案例中，提供一方法侦测多种人乳头状瘤病毒蛋白，提供一抗人乳头状 瘤病毒抗体，能与临床检体中来自各种人乳头状瘤病毒型之多种人乳头状瘤病毒蛋白产生 键结，提供一固体表面，包被抗人乳头状瘤病毒抗体或表达于细胞裂解物溶液中的病毒蛋 白；将临床检体制程细胞裂解溶液，其中含有多种人乳头状瘤病毒蛋白。方法进一步包含抗 人乳头状瘤病毒抗体与细胞裂解物溶液进行反应，形成一含有多种人乳头状瘤病毒蛋白与 抗人乳头状瘤病毒抗体复合物之固态玻片，侦测玻片上的复合物，确认临床检体中人乳头 状瘤病毒蛋白之表达。在另一实施案例中，提供一方法侦测生物样本中，来自不同人乳头状瘤病毒型的 一种或多种人乳头状瘤病毒蛋白之存在，并将生物样本制成细胞裂解溶液，将抗人乳头状 瘤病毒第一抗体包被于固态表面，与细胞裂解溶液中的抗人乳头状瘤病毒第二抗体进行反 应。两者抗体皆能与来自多种人乳头状瘤病毒型之人乳头状瘤病毒蛋白产生键结。方法进 一步包括在固态表面形成多种人乳头状瘤病毒蛋白与抗人乳头状瘤病毒一级、二级抗体之 复合物，藉侦测固态表面上复合物的形成，可侦测生物样本中一种或多种人乳头状瘤病毒 蛋白之表达。此外，依据本发明一实施案例，提供一测流系统，可侦测制备成细胞裂解物溶液的 临床样本中，来自一种或各种人乳头状瘤病毒型的一种或多种人乳头状瘤病毒蛋白，此测 流系统包括在玻片一端之固态表面包被上抗人乳头状瘤病毒抗体，该第一抗人乳头状瘤 病毒抗体可与来自各式人乳头状瘤病毒型之一种或多种人乳头状瘤病毒蛋白产生键结，因 此能将细胞裂解物溶液中的人乳头状瘤病毒蛋白捕捉至固态表面；在玻片之另一端包被上 第二抗人乳头状瘤病毒抗体，流经玻片之细胞裂解物溶液测流进入后，与第二抗体反应形 成复合体，该第二抗体能与一种或多种人乳头状瘤病毒蛋白产生键结，因此能侦测临床样 本中人乳头状瘤病毒蛋白之表达。在一方面，抗人乳头状瘤病毒第一抗体由抗一种或多种带有各式人乳头状瘤病毒 基因之重组蛋白产生，该抗人乳头状瘤病毒第一抗体可捕捉固态表面上，细胞裂解溶液中 的多种人乳头状瘤病毒蛋白。在另一方面，抗人乳头状瘤病毒第二抗体由带有相同人乳头 状瘤病毒基因之相同第一重组蛋白产生，该抗人乳头状瘤病毒第二抗体能与固态表面上， 细胞裂解溶液中的多种人乳头状瘤病毒蛋白产生键结并进行侦测。范例.范例一表达、纯化并制备人乳头状瘤病毒重组蛋白，作为抗原，产生抗血清及抗 人乳头状瘤病毒抗体，以融合瘤细胞株进行筛选形成单克隆抗体。人乳头状瘤病毒重组蛋白可为任何人乳头状瘤病毒蛋白及早期或晚期基因之人 乳头状瘤病毒蛋白，包括但不仅限于E2，E6，E7，Ll及L2，且可形成多种人乳头状瘤病毒型。 E6，E7及Ll之全段多肽序列，不仅难以被获得，且蛋白纯化时产生非预期之聚集现象，造成 蛋白质不稳定和低度表达，且纯化后之蛋白抗原表达量低。例如，许多早期E6原致癌蛋白 包含许多半胱氨酸，因而正确的E6原致癌蛋白拓图需要许多适切的双硫键之形成。此外， 某些免疫学试验使用早期E6和E7蛋白之小分子胜肽，其侦测特异性和敏感度极低，且不适 合作为临床活体诊断之工具。因此，本专利发明提供之重组蛋白，重组人乳头状瘤病毒原致癌蛋白之部分序列或全段续列，形成重组杂交蛋白。1).各式带有人乳头状瘤病毒16E6和人乳头状瘤病毒18E6基因的重组蛋白之克 隆和产生。一来自人乳头状瘤病毒范例病毒型人乳头状瘤病毒16之E6早期原致癌范例 基因被克隆，此克隆基因具有474个硷基对(b.p.)之脱氧核醣核酸片段，包含全部人乳头 状瘤病毒16E6基因之157种胺基酸编码区，经聚合酶链反应(PCR)获得并加以扩增。分 离出的脱氧核醣核酸片段之脱氧核醣核酸序列经由与基因银行资料库的比对进行确认。重 组蛋白人乳头状瘤病毒18E6亦可被获得。所有克隆步骤依据"分子克隆"，实验室手册， Sambrook,Fritsch and Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 一书所 描述之方法。此外，人乳头状瘤病毒18E6基因亦被克隆及确认脱氧核醣核酸序列。2).各式带有人乳头状瘤病毒16E7和人乳头状瘤病毒18E7基因的重组蛋白之克 隆和产生。一来自人乳头状瘤病毒范例病毒型人乳头状瘤病毒16之早期原致癌范例基因 E7被克隆，此克隆基因具有294个硷基对(b.p.)之脱氧核醣核酸片段，包含全部人乳头状 瘤病毒16E7基因之99种胺基酸编码区，经聚合酶链反应获得并加以扩增。分离出的脱氧 核醣核酸片段之脱氧核醣核酸序列经由与基因银行资料库的比对进行确认。人乳头状瘤病 毒18E7重组蛋白亦被获得。此外，来自不同人乳头状瘤病毒型的E7脱氧核醣核酸片段，可 由不同临床检体或来源被克隆。3).带有人乳头状瘤病毒16L1和人乳头状瘤病毒18L1基因的重组蛋白之克隆和 产生。一来自人乳头状瘤病毒范例病毒型人乳头状瘤病毒16之早期范例基因被克隆，1596 个硷基对(b. p.)之脱氧核醣核酸片段，包含全部人乳头状瘤病毒16L1基因之531种胺基 酸编码区，经聚合酶链反应获得并加以扩增。分离出的脱氧核醣核酸片段之脱氧核醣核酸 序列经由与基因银行资料库的比对进行确认。此外，来自不同人乳头状瘤病毒型的Ll脱氧 核醣核酸片段，可由不同临床检体或来源被克隆。由His-标记表达系统获得人乳头状瘤病毒16L1蛋白之N端重组片段。人乳头状 瘤病毒16L1N端重组蛋白之分子量约为34KD。LlC端片段亦可被获得。人乳头状瘤病毒 18L1重组蛋白也能被获得，做为抗原产生抗血清、多克隆抗体和单克隆抗体。此专利描述之多种重组蛋白可表达于各种合适之系统中，诸如细菌、病毒、酵母菌 和哺乳类表达系统，如大肠杆菌、酵母菌、杆状病毒和哺乳类之细胞培养等。虽多胜肽可由 其他方式获得，专利提供之实施案例中，多种重组蛋白大部分(或几乎)为其原始型式，此 构型在免疫分析试验中，更有可能与来自人乳头状瘤病毒感染人体组织之抗体产生键结。 例如，GST, MBP或His标志-人乳头状瘤病毒16-E6，人乳头状瘤病毒18E6，人乳头状瘤病 毒16E7，人乳头状瘤病毒18E7，人乳头状瘤病毒16L1，和人乳头状瘤病毒18L1重组蛋白， 利用IPTG驱动诱导，在大肠杆菌BL21(DE3)中被表达。诱导蛋白质表达后，标志-人乳头 状瘤病毒重组蛋白经由培养细胞裂解后溶解部分被获得，并纯化至浓度约为0. 1到1毫克 /毫升或更高。人乳头状瘤病毒重组蛋白之纯度，经电泳PAGE分析，预估大于90%。人乳 头状瘤病毒重组蛋白可用以侦测临床检体中人乳头状瘤病毒抗体之存在与否，也可做为抗 原制造多克隆抗血清和单克隆抗体。此专利描述之各式表达载体的细胞培养包含多种人乳头状瘤病毒重组蛋白，放大 至1公升，10公升或100公升甚至更高，以获得大量可溶的重组蛋白进行纯化。细胞裂解后 可溶解部分，通过各式层析管柱，在适当的表达系统中与人乳头状瘤病毒重组蛋白之标记
13位置键结；标志-人乳头状瘤病毒重组蛋白在由管柱中被冲提出来，浓缩至100毫升，10毫 升或1毫升。纯化后的水溶性人乳头状瘤病毒重组蛋白进一步以中性酸硷值缓冲液或磷酸 盐缓冲液浓缩和透析，作为抗原产生抗人乳头状瘤病毒蛋白之抗血清。由溶解部份纯化出 的水溶性人乳头状瘤病毒重组蛋白，摺叠方式与其在活体状态下原始摺叠方式相似。生产各种不同造型之单克隆抗体，获得高质量的纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白 是很重要的，抗体能辨识一般或特殊的抗原表位，用以侦测人乳头状瘤病毒感染。纯化后 人乳头状瘤病毒重组蛋白，经由测试确认与来自临床人乳头状瘤病毒感染检体之人乳头状 瘤病毒抗体的键结能力。该纯化后之人乳头状瘤病毒重组蛋白可作为抗原产生抗血清和抗 体，在活体中辨识人乳头状瘤病毒自然病毒蛋白。范例二 生产抗人乳头状瘤病毒多克隆抗 体·纯化大肠杆菌中表达之人乳头状瘤病毒E6，E7或Ll重组蛋白，以磷酸盐浓缩透析 后作为抗原。免疫反应按照标准程序进行，以酶联免疫吸附试验分析每一获得之血清，接着 程序性增加及出血。收集滴定度最佳之血液，产生之血清经由蛋白质A管柱或亲合性管柱 进行免疫球蛋白(Ig)之纯化；纯化后之免疫球蛋白G(IgG)作为人乳头状瘤病毒免疫针测 分析之抗人乳头状瘤病毒抗体。此专利发明描述的单克隆抗体、多克隆抗体和血清之获得、纯化和试验，无论致病 原因、细胞病灶、发炎反应或癌症之发展情况，可用以侦测人乳头状瘤病毒感染。其他研究 者尝试发展抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体却未得成果，因未能得到足够之人乳头状瘤病毒 蛋白来产生单克隆抗体；无法产生高度专一性之单克隆抗体，因抗原不具免疫抗原性；或 产生之抗体无法辨识临床检体早期人乳头状瘤病毒感染之人乳头状瘤病毒原始病毒造型。 一些抗体产生抗突变之胜肽，仅能辨识晚期子宫颈癌，但不确定其抗体辨识人乳头状瘤病 毒野型之自然蛋白或任何早期人乳头状瘤病毒感染。此外，晚期人乳头状瘤病毒之侦测对 疾病介入和治疗已太迟。此专利发明所描述之临床抗体应用，可藉适当之临床检体经人乳头状瘤病毒免疫 侦测分析被证实，如酶联免疫吸附试验试验、免疫细胞化学试验、免疫组织化学试验。本发 明之新型单克隆抗体和抗血清获得方法，可与具有早期细胞病灶，如子宫颈上皮内赘瘤和 晚期人乳头状瘤病毒相关之子宫颈癌，之临床检体的人乳头状瘤病毒蛋白反应并产生键 结。此单克隆抗体和抗血清，为人乳头状瘤病毒相关致病原和早期晚期子宫颈癌发展之侦 测和筛选，提供了强而有利的侦测工具，因此提供疾病发展之介入和早期治疗之渠道。范例三发展抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体纯化在大肠杆菌表达之人乳头状瘤病毒E6，E7或Ll重组蛋白，以磷酸盐浓缩和透 析后作为抗原。小鼠之免疫反应测试按照标准程序进行，以酶联免疫吸附试验分析滴定每 一获得之血清，接着程序性增加及出血。当小鼠之血清达最佳化时，以标准步骤融合小鼠之 脾细胞和肿瘤细胞。克隆融合细胞，如融合瘤细胞，并进一步进行培养。1).融合瘤细胞筛选为获得本专利所描述对各种人乳头状瘤病毒蛋白具有专一 性键结能力之人乳头状瘤病毒产生抗体之融合瘤细胞，藉由筛选各种原始抗原和其他人乳 头状瘤病毒蛋白作为正向筛选，非相关性的蛋白则作为负向筛选，以进行融合瘤细胞克隆。 例如，两种以上纯化后人乳头状瘤病毒重组蛋白被筛选出，用以抗每一融合瘤细胞之克隆， 并用以测试和了解所获得的每一产生抗体之融合瘤细胞株之专一性。
2).融合瘤细胞株库以免疫分析方法(如酶联免疫吸附试验，酶免疫分析方法和 其他试验)克隆所希望之阳性反应及阴性反应之融合瘤细胞，并克隆至单一细胞。每一单 一细胞经细胞培养而生长，当细胞数达每毫升含一百万个细胞时，将细胞冷冻保纯在摄氏 零下80度或液态氮中，作为细胞库之存贮。3).腹水之产生每一融合瘤细胞株在组织培养中生长，并注射至小鼠体中以产 生腹水。产生并收集之腹水做为以G蛋白管柱纯化之免疫球蛋白，每一融合瘤细胞株纯化 出之免疫球蛋白是同型的，可应用于人乳头状瘤病毒免疫分析范例四人乳头状瘤病毒免疫组织化学试验.1).人乳头状瘤病毒免疫组织化学试剂和试验在一实施案例中，提供进行人乳 头状瘤病毒免疫组织化学试验的试剂。试剂包括抗原撷取试剂、抗体前封闭液、抗体后封闭 液、抗人乳头状瘤病毒第一抗体、与抗老鼠或抗兔子免疫球蛋白共轭之辣根过氧化物酶或 生物素或其他试剂作为之第二抗体、以及一溶液其中含有适当之试剂作为第二抗体被侦测 之基质。抗原撷取试剂包含低酸硷值、中性酸硷值或高酸硷值之缓冲溶液。前抗体封闭液 包含一些蛋白质、牛血清蛋白(BSA)、血清或其他试剂，用以终止由抗体所产生非之特异性 键结。后抗体封闭液与前抗体封闭液相似，含有少量蛋白质或血清，与第一抗体进行培养。 含有人乳头状瘤病毒抗体之溶液可以为浓缩形式，或被稀释作为试剂之使用。抗人乳头状 瘤病毒抗体可以辣根过氧化物酶、生物素或其它可被做为侦测基质之适当试剂直接标记。 含有第二抗体之溶液可以为浓缩形式，或被稀释作为试剂之使用。基质溶液由可做为侦测 基质之当试剂組成，包括DAB(3. 3' -diaminobenzidine)作为一组成成分或两种成分，或 AEC (3-Amino-9-Ethylcarbazole)基质作为一组成成分或两种成分，或其他基质。一旦子宫颈组织被制成和固定后，便进行免疫组织化学试验，玻片上的组织与抗 原撷取试剂一起加热沸腾一段时间，然后将玻片冷却至室温，以前抗体封闭液进行封闭一 段时间后，与人乳头状瘤病毒抗体进行培养。以磷酸盐、水或其他缓冲液清洗玻片，除去任 何未键结之人乳头状瘤病毒抗体；将玻片与第二抗体进行培养，如抗老鼠IgG辣根过氧化 物酶，以适当之基质进行侦测。试举一例，当过氧化物酶和过氧化氢存在时，DAB被氧化产 生棕色沉淀，和酵素活性部位上之酒精不溶性沉淀；沉淀颜色依酵素含量呈淡金棕色至深 金棕色，显微镜下金棕色沉淀，表示人乳头状瘤病毒抗体与玻片上组织细胞中表达的人乳 头状瘤病毒蛋白产生专一性键结。此试验可在室温或高温下加速键结反应进行，该人乳头 状瘤病毒免疫组织化学试验可徒手操作或以免疫组织化学自动仪进行，提供了人乳头状瘤 病毒感染和人乳头状瘤病毒原致癌蛋白原位侦测之有力工具。因此，人乳头状瘤病毒免疫 组织化学染色试验是非常有用的确认检查，对于结构不良细胞之确认，人乳头状瘤病毒免 疫组织化学染色提供人乳头状瘤病毒感染或人乳头状瘤病毒原致癌蛋白表达情形之进一 步信息。此外，不同阶段之子宫颈细胞结构不良，人乳头状瘤病毒E6和E7原致癌蛋白之过 度表达，可能表示子宫颈上皮内赘瘤之增生或子宫颈癌之发展。2).样本选择与制备爲了分析本发明所提供之抗人乳头状瘤病毒抗体是否能原 位侦测不同子宫颈上皮内赘瘤病程或癌症之人乳头状瘤病毒蛋白，以免疫组织化学试验分 析子宫颈组织，包括含有第二级子宫颈上皮内赘瘤(子宫颈上皮内赘瘤第二级伴随中度病 灶表达)之高度鳞状上皮内病变(HSIL)、第三级子宫颈上皮内赘瘤(子宫颈上皮内赘瘤第三级伴随重度病灶表达)、含有鳞状细胞癌(SCC，子宫颈癌最常见之癌症)之侵袭性癌症和 腺癌(ADC，腺型肿瘤)。将蜡质组织块切割成4微米，至于玻片上培养在60°C隔夜；去蜡质 /脱水部分则不遮蔽，进行标准免疫组织化学染色程序。将纯化后的抗人乳头状瘤病毒蛋白 单克隆抗体稀释作为第一抗体，染色步骤依序为第二抗体溶液、清洗和适当之基质试剂。当 片段形成时，立即以去离子水将玻片悬浮，以四溴萤光素进行复染，脱水后盖上盖玻片。3).组织芯片为了在一次均质试验反应中同时分析多个样本，以组织基因芯片 将许多样本同时点在玻片上。将来自第二级子宫颈上皮内赘瘤，第三级子宫颈上皮内赘瘤 或非侵袭性癌症共84组样本制备成三个组织基因芯片一阵列包含30个第二级子宫颈上 皮内赘瘤个体以及其周围正常上皮细胞；另一阵列包含30个第三级子宫颈上皮内赘瘤个 体以及其周围正常上皮细胞；最后一阵列包含12%子宫颈鳞状上皮细胞癌以及其周围正 常上皮细胞，12个腺癌样本及其正常上皮相关细胞，距离肿瘤边缘至少15毫米的阴道或子 宫颈黏膜。在每一子宫颈上皮内赘瘤病例中，选择一肿瘤形成之代表性组织阵列点，和另一 代表其正常相关组织之基因芯片点；在非侵袭性癌症病例中，选择两个组织为阵列点，和一 个正常相关组织基因芯片点。取得人乳头状瘤病毒脱氧核醣核酸比对之组织玻片后，回收 来自相关蜡嵌入组织块之2毫米的阴道或子宫颈黏膜。在每一子宫颈上皮内赘瘤病例中， 选择一肿瘤形成之代表性组织阵列点圆形组织阵列点。4).人乳头状瘤病毒脱氧核醣核酸测试每一病例之人乳头状瘤病毒脱氧核醣核 酸比对，使用fesyChip 人乳头状瘤病毒点墨法或HR-人乳头状瘤病毒晶片，藉由修饰有 MY11/GP6+聚合酶链反应-基准之反-免疫印迹分析法进行确认，其在尼龙滤膜上含有13 种特异性之寡核苷酸，以全部细胞脱氧核醣核酸作为核苷酸的来源，放大后藉杂交进行侦 测。5).免疫组织化学程度和数据分析组织芯片上每一阵列点之染色结果，由专业 之解剖病理学家以显微镜进行分析，肿瘤细胞或结构不良性细胞之面积，经细胞染色后计 算其百分比，染色深浅分为0-3个等级。正常邻近上皮细胞，或与其相关之结构不良细胞和 肿瘤相距15毫米的阴道或子宫颈黏膜。在每一子宫颈上皮内赘瘤病例中，选择一肿瘤形成 之代表性组织阵列点的正常组织皆纳入等级分类；所有数据结果皆由专业病理学家进行分 级，将10%的染色部分切下以进行阳性或阴性试验，所有数据在表1-17中显示。为证明能够侦测非侵袭性子宫颈癌之人乳头状瘤病毒蛋白，鳞状上皮细胞癌是最 常见的子宫颈癌，将鳞状细胞癌癌组织进行人乳头状瘤病毒免疫组织化学试验。图1A-1D 说明以老鼠人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体进行鳞状上皮细胞癌组织免疫组织化学染色之 结果。图IA说明以浓缩人乳头状瘤病毒E7老鼠单克隆抗体，对组织基因芯片中的鳞状细 胞癌组织进行免疫组织化学染色之代表性影像图。图IB说明图IA中，鳞状细胞癌个案之 正常上皮细胞(与肿瘤组织相距15毫米)代表性影像图。图IC说明使用相同浓缩人乳头 状瘤病毒E7老鼠单克隆抗体，对组织基因芯片另一鳞状细胞癌样本进行免疫组织化学染 色之代表性影像图。图ID说明图IC中肿瘤细胞细胞质以相同浓缩人乳头状瘤病毒E7抗 体染色后之放大影像图。研究结果显示，E7原致蛋白癌的表达可在鳞状细胞癌组织中的肿 瘤细胞被侦测到，黑色实心箭头标示出肿瘤细胞中E7蛋白之特异性染色，而空心箭头则标 示出未被染色的正常细胞。这些结果显示，鳞状细胞癌子宫颈组织中的人乳头状瘤病毒E7 蛋白，可藉由浓缩人乳头状瘤病毒E7抗体进行免疫组织化学试验被原位侦测。
在另一类型非侵袭性子宫颈癌的人乳头状瘤病毒蛋白侦测中，图2A-2C说明以相 同老鼠人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体，对子宫颈腺癌进行免疫组织化学染色。结果显示， 腺癌组织中的肿瘤细胞，可侦测到E7原致癌蛋白的表达，黑色实心箭头标示出肿瘤细胞中 E7蛋白之专一性染色，而空心箭头则标示出未被染色之正常细胞。图2A说明以图1中相 同之浓缩人乳头状瘤病毒E7抗体，对腺癌多克隆样本之肿瘤细胞进行免疫组织化学染色 的代表性影像图。图2B图2A中，腺癌样本之相关性正常上皮细胞(与肿瘤组织相距15毫 米)代表性影像图。图2C说明图2A中腺癌肿瘤细胞的细胞质染色放大影像图，由放大的 影像图可标示出在肿瘤细胞细胞质中E7蛋白表达的位置。这些结果显示，以E7单克隆抗 体进行免疫组织化学染色，可侦测腺癌的肿瘤细胞，且与鳞状细胞癌染色型态相似。分析每一侵袭性癌症之人乳头状瘤病毒免疫组织化学结果，表1说明M个免疫 组织化学侵袭性癌症样本细胞质(C)、细胞核(N)染色之结果，在图1A-1D和图2A-2C中， 以C或N表示浓缩人乳头状瘤病毒E7抗体染色之百分比。附加的抗人乳头状瘤病毒抗体 包含其他抗E7抗体、抗人乳头状瘤病毒E6抗体，如MAbl和MAb 7，以及抗人乳头状瘤病毒 Ll抗体，皆以相同的组织基因芯片进行测试。为了进行各种抗人乳头状瘤病毒抗体之免疫 组织化学染色，使用另一浓缩人乳头状瘤病毒抗体对肿瘤细胞的细胞质染色，免疫组织化 学分级结果说明于表1，人乳头状瘤病毒脱氧核醣核酸比对之结果亦说明于表中，作为相关 性样本。表1结果说明，以抗E7抗体对鳞状细胞癌和腺癌的肿瘤细胞进行染色，可发现细 胞核和细胞质皆被染色；然而，与肿瘤细胞的细胞核染色做比较，细胞质的染色程度较大。 在其邻近正常上皮细胞中，仅在细胞核侦测到人乳头状瘤病毒E7蛋白的表达，而未在细胞 质中测得人乳头状瘤病毒E7蛋白表达，与正常邻近细胞做比较，肿瘤细胞的细胞质明显的 被染色。这些结果说明，鳞状细胞癌和腺癌组织中的肿瘤细胞，在其细胞质和细胞核中可侦 测到人乳头状瘤病毒E7蛋白的表达。E7蛋白的表达位置在肿瘤细胞的细胞质中，而非正常 上皮细胞或基质细胞，显示出其对肿瘤存在特异性。藉由抗E7抗体，侦测表达在正常邻近 上皮细胞和肿瘤细胞的人乳头状瘤病毒E7蛋白，可显示原致癌蛋白表达的人乳头状瘤病 毒感染。使用其他抗人乳头状瘤病毒抗体的类似染色型态说明于表1，结果显示此处所描述 之人乳头状瘤病毒免疫组织化学试验，可侦测到表达于子宫颈组织肿瘤细胞中的人乳头状 瘤病毒早期基因，如E6和E7，以及晚期基因Ll蛋白。比较人乳头状瘤病毒免疫组织化学及人乳头状瘤病毒脱氧核醣核酸比对之结 果，抗E7抗体对所有测试样本中的人乳头状瘤病毒型呈阳性反应。此处所描述之浓缩E7 单克隆抗体可侦测单一人乳头状瘤病毒型感染，诸如人乳头状瘤病毒16，人乳头状瘤病毒 18，人乳头状瘤病毒33和人乳头状瘤病毒45此类与癌症相关之人乳头状瘤病毒型(高风 险人乳头状瘤病毒型)。单一抗E7单克隆抗体也可侦测多种病毒型感染的人乳头状瘤病 毒，如人乳头状瘤病毒11，人乳头状瘤病毒16，人乳头状瘤病毒18，人乳头状瘤病毒52，人 乳头状瘤病毒58，人乳头状瘤病毒51和人乳头状瘤病毒59这些病毒型之结合，包含高风 险、低风险和非原致癌基因α-人乳头状瘤病毒；然而，多重人乳头状瘤病毒型之感染，其 中至少含有一种高风险型人乳头状瘤病毒。这些结果显示，本发明中描述之浓缩Ε7抗体是 非专一性的，因此可作为有利之工具，侦测子宫颈癌常见之一般高风险病毒型的人乳头状 瘤病毒Ε7蛋白。
表1 :12个鳞状细胞癌生物检体和12个腺癌生物检体之免疫组织化学染色结果 (% stained染色百分比)以及人乳头状瘤病毒脱氧核醣核酸比对结果(C 细胞质；N 细胞 核；Dys 结构不良性或肿瘤细胞)
权利要求
1.一种侦测人类感染乳突状病毒的方法，包括收集人类临床样本进行免疫学试验，以一种或多种以上之单克隆抗体，对临床样本中 人类细胞之细胞核进行染色。
2.根据申请专利范围第1项之方法，当人类细胞核染色呈阳性反应时，表示疾病发展 阶段处于疾病之早期阶段，诸如早期结构不良增生阶段、低度鳞状上皮细胞病变、高度鳞状 上皮细胞病变、第一级子宫颈上皮内赘瘤、第二级子宫颈上皮内赘瘤、第三级子宫颈上皮内 赘瘤，以及其上述组合群构成。
3.根据申请专利范围第1项之方法，当人类细胞质染色呈阳性反应时，表示人乳头状 瘤病毒感染可能发展成晚期病变，诸如晚期结构不良增生、高度鳞状上皮细胞病变、第二级 或第三级子宫颈上皮内赘瘤、侵袭性子宫颈癌、鳞状上皮细胞癌、腺癌，以及其上述组合群 构成。
4.根据申请专利范围第1项之方法，其一种或多种单克隆抗体是由一种或多种纯化后 之乳头状瘤病毒重组蛋白所产生。
5.根据申请专利范围第1项之方法，发展出的一种或多种单克隆抗体与至少一种人类 乳头状瘤早期病毒蛋白具有键结能力。
6.根据申请专利范围第1项之方法，发展出的一种或多种单克隆抗体与至少一种人类 乳头状瘤晚期病毒蛋白具有键结能力。
7.根据申请专利范围第1项之方法，发展出的一种或多种单克隆抗体与至少一种早期 及至少一种晚期之人乳头状瘤病毒蛋白具有键结能力。
8.根据申请专利范围第1项之方法，发展出的一种或多种单克隆抗体包含一抗体，其 与人类乳头状瘤早期病毒蛋白具有键结能力，并包含另一抗体其与人类乳头状瘤晚期蛋白 具有键结能力。
9.根据申请专利范围第1项之方法，其一种或多种单克隆抗体是由浓缩人乳头状瘤病 毒E6单克隆抗体、抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体、抗人乳头状瘤病毒Ll单克隆抗体，以 及其上述组合群构成。
10.根据申请专利范围第1项之方法，进一步包含有以一种或多种抗人乳头状瘤病毒 重组蛋白之抗体，对临床样本之人体细胞进行免疫组织化学试验；并比较临床样本人体细 胞之细胞核和细胞质染色。
11.根据申请专利范围第10项之方法，临床样本人体细胞之细胞核染色呈阳性反应较 细胞质多者，表示由族群中所筛选出之人乳头状瘤病毒感染病人处于疾病之早期阶段，诸 如早期结构不良增生、低度鳞状上皮细胞病变、高度鳞状上皮细胞病变、子宫颈上皮内赘瘤 (第一级子宫颈上皮内赘瘤，第二级子宫颈上皮内赘瘤，第三级子宫颈上皮内赘瘤)，以及 其上述组合群构成。
12.根据申请专利范围第10项之方法，临床样本人体细胞之细胞质染色呈阳性反应较 细胞核多者，表示由族群中所筛选出之人乳头状瘤病毒感染病人处于疾病之晚期阶段，诸 如晚期结构不良增生、第三级子宫颈上皮内赘瘤、侵袭性癌症，以及其上述组合群构成。
13.根据申请专利范围第1项之方法，进一步包含以两种或多种能与人乳头状瘤病毒 蛋白产生键结之抗体，对临床样本之人体细胞进行免疫组织化学试验，由族群中所筛选出 之相关蛋白如E6，E7，L1蛋白，以及由上述组成的构成群组；以两种以上抗体比较人体细胞染色之结果，染色结果呈阳性反应者，表示该人体受人乳头状瘤病毒之感染。
14.根据申请专利范围第1项之方法，免疫组织化学试验可用来侦测各种病程阶段之 人乳头状瘤病毒感染，由群组中筛选出的疾病阶段包括早期人乳头状瘤病毒感染、晚期人 乳头状瘤病毒感染、早期子宫颈细胞病灶、晚期子宫颈细胞病灶、低度鳞状上皮细胞病变、 高度鳞状上皮细胞病变、意义不明的不典型鳞状细胞、子宫颈上皮内赘瘤(第一级子宫颈 上皮内赘瘤，第二级子宫颈上皮内赘瘤，第三级子宫颈上皮内赘瘤)、发展中子宫颈癌、腺癌 多克隆、鳞状上皮细胞癌，及其上述组合群构成。
15.根据申请专利范围第1项之方法，进一步包含有提供一来自人体之临床样本，该 临床样本含有型态正常与不正常之人体细胞；将该样本制备成一薄层细胞平铺于玻片表 面；以一种或多种经由一种或多种纯化后之乳头状瘤病毒重组蛋白所产生之抗体，进行免 疫细胞化学试验分析，其中至少有一种抗体与人类乳头状瘤早期病毒蛋白具有键结能力； 并对玻片上临床样本中各式人乳头状瘤病毒蛋白型所产生的人乳头状瘤病毒蛋白进行染 色。
16.根据申请专利范围第1项之方法，进一步包含有进行多项流细胞侦测，由型态正 常与不正常之人体细胞之混和物中分离出每一细胞，以侦测每一个体细胞；分析临床样本 液态溶液，其型态不正常和正常之细胞混和物中含有多种人乳头状瘤病毒型，侦测来自各 种人乳头状瘤病毒型的人乳头状瘤病毒蛋白之表达。
17.侦测人体中各种人乳头状瘤病毒蛋白之方法，包含提供一能与来自各种人乳头 状瘤病毒型之各式人乳头状瘤病毒蛋白产生键结之抗人乳头状瘤病毒抗体；将临床样本制 备成细胞裂解物溶液，该溶液含有各式人乳头状瘤病毒蛋白；提供一包被至少一种蛋白之 固态表面，该蛋白由族群所中筛选出，包含有抗人乳头状瘤病毒抗体，以及各式表达于细胞 裂解物溶液中的蛋白质；将抗人乳头状瘤病毒抗体与细胞裂解物溶液进行反应；在固态表 面上形成一由抗人乳头状瘤病毒抗体与各式人乳头状瘤病毒蛋白组成之复合体；分析该复 合体，以侦测临床样本中各式人乳头状瘤病毒蛋白表达。
18.根据申请专利范围第17项之方法，其各式人乳头状瘤病毒蛋白，包括人乳头状瘤 病毒E6蛋白、人乳头状瘤病毒E7蛋白、人乳头状瘤病毒Ll蛋白，以及由上述组成的构成群 组。
19.根据申请专利范围第17项之方法，其固态表面，包括磁珠表面、试纸表面、快速试 验试纸表面、膜表面、重直流系统膜表面、微流系统表面、转渍膜表面、蛋白芯片表面、玻璃 表面、微孔盘底部表面，及其上述组合群构成。
20.根据申请专利范围第19项之方法，以萤光流式细胞仪侦测各式磁珠固态表面之复 合体。
21.根据申请专利范围第19项之方法，以抗人乳头状瘤病毒第一抗体固着于试纸一 端，于试纸另一端加入抗人乳头状瘤病毒第二抗体和细胞裂解物溶液，在溶液测向流经试 纸表面前，便与抗人乳头状瘤病毒第一抗体形成一固着复合体而可被加以侦测。
22.根据申请专利范围第19项之方法，以抗人乳头状瘤病毒第一抗体固着于重直流系 统之膜表面，并依序加入抗人乳头状瘤病毒第二抗体和细胞裂解物溶液，当溶液流经重直 流快速测试系统时，与抗人乳头状瘤病毒第一抗体形成一固着复合体而可被加以侦测。
23.根据申请专利范围第19项之方法，复合体流经微流体系统，可在其表面被侦测到。
24.根据申请专利范围第17项之方法，细胞裂解物溶液中各式之人乳头状瘤病毒蛋 白，与抗人乳头状瘤病毒抗体进行反应前，被包被于固态表面。
25.根据申请专利范围第M项之方法，细胞裂解物溶液中各式之人乳头状瘤病毒蛋 白，被包被于转渍膜之固态表面。
26.根据申请专利范围第M项之方法，细胞裂解物溶液中各式之人乳头状瘤病毒蛋 白，被包被于微孔盘之固态表面，抗人乳头状瘤病毒抗体则预先标记上筛选出的侦测试剂， 该试剂包括酵素共轭之生物素和奈米金颗粒，及其上述组合群构成；侦测试剂表达的固态 表面上，形成由各式人乳头状瘤病毒蛋白和抗人乳头状瘤病毒抗体所组成的复合体，表示 样本中含有各式人乳头状瘤病毒蛋白之表达。
27.根据申请专利范围第17项之方法，抗人乳头状瘤病毒抗体在与含有各式人乳头状 瘤病毒蛋白之细胞裂解物溶液进行反应前，先包被于固态表面，以侦测样本中人乳头状瘤 病毒之感染。
28.根据申请专利范围第27项之方法，抗人乳头状瘤病毒抗体在与细胞裂解物溶液进 行反应前，被包被在蛋白芯片之固态表面上。
29.根据申请专利范围第27项之方法，抗人乳头状瘤病毒抗体在与细胞裂解物溶液进 行反应前，被包被在微流体系统之固态表面上。
30.根据申请专利范围第17项之方法，侦测固态表面上之复合体，可进一步侦测含有 抗人乳头状瘤病毒抗体之标记蛋白侦测试剂之表达、细胞裂解物溶液中各式蛋白之表达、 第二抗体与抗人乳头状瘤病毒抗体产生键结，及其上述组合群构成，其中第二抗体之种类 依抗人乳头状瘤病毒抗体而异，抗人乳头状瘤病毒抗体亦可与临床检体中，来自各式人乳 头状瘤病毒型中的多种人乳头状瘤病毒蛋白产生键结。
31.根据申请专利范围第30项之方法，由筛选出之试验方法，分析侦测试剂是否表达， 包括以试剂之颜色改变作为直接定性分析、以酶联免疫吸附试验分析仪、流式细胞仪基因 芯片扫描器、和等读取数据，以及其组合群。
32.根据申请专利范围第31项及第1项之方法，进一步包括在固态表面上包被一抗体， 以侦测细胞蛋白，并比较临床样本中，细胞蛋白和多种人乳头状瘤病毒蛋白之表达量。细胞 蛋白是由下列族群中所筛选出，诸如pl6INK4a，E2F，Ki-67 (MIB-I), MYC蛋白，CDK4，周期 素-A，周期素-B，周期素-E，端粒酶-TERC，MCM2蛋白，T0P2A蛋白，热休克蛋白40 (HSP40)，热 休克蛋白60 (HSP6tl)，热休克蛋白70 (HSP7tl)，CA9/MN蛋白，层粘连蛋白5，层粘连蛋，brn-3a， CDK N2蛋白，拓朴异构酶2A，微粒体维持蛋白_2，微粒体维持蛋白_4，微粒体维持蛋白-5， 生长素蛋白，VEGF蛋白，p53，RB, p27(kipl)，和p21 (waf)，以及其组合群。
33.测流系统可侦测制备成细胞裂解物溶液的测临床样本中，来自各种人乳头状瘤病 毒型的多种人乳头状瘤病毒蛋白，包括在玻片一端之固态表面包被上抗人乳头状瘤病毒 抗体，该第一抗人乳头状瘤病毒抗体可与来自各式人乳头状瘤病毒型之多种人乳头状瘤病 毒蛋白产生键结，因此能将细胞裂解物溶液中的人乳头状瘤病毒蛋白捕捉至固态表面；在 玻片之另一端包被上第二抗人乳头状瘤病毒抗体，流经玻片之细胞裂解物溶液测流进入 后，与第二抗体反应形成复合体，该第二抗体能与一种或多种人乳头状瘤病毒蛋白产生键 结，因此能侦测临床样本中人乳头状瘤病毒蛋白之表达。
34.一侦测人体中人乳头状瘤病毒感染之试剂盒，包含抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体进行临床样本之免疫试验，并比较样本细胞核与细胞质之染色程度。
35.一侦测人体中人乳头状瘤病毒感染之试剂盒，包含能与人乳头状瘤病毒早期蛋 白产生键结之抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体，将临床样本制备成含有型态不正常与正常细 胞之溶液，进行免疫细胞化学试验。将样本溶液在玻片上平铺为一细胞薄层，对来自各式人 乳头状瘤病毒型之一种或多种人乳头状瘤病毒蛋白进行原位染色。
36.根据申请专利范围第35项之试剂盒，其抗人乳头状瘤病毒抗体，包括抗人乳头状 瘤病毒E7单克隆抗体、浓缩人乳头状瘤病毒E6单克隆抗体、浓缩人乳头状瘤病毒Ll抗体 与抗人乳头状瘤病毒E7单克隆抗体之结合、浓缩人乳头状瘤病毒Ll抗体与浓缩人乳头状 瘤病毒E6单克隆抗体之结合、浓缩人乳头状瘤病毒E6抗体与浓缩E7单克隆抗体之结合， 以及其组合群。
37.根据申请专利范围第35项之试剂盒，其抗人乳头状瘤病毒单克隆抗体用以侦测各 种病程阶段之人乳头状瘤病毒感染，筛选出之病程阶段包括早期人乳头状瘤病毒感染、晚 期人乳头状瘤病毒感染、早期子宫颈细胞病灶、晚期子宫颈细胞病灶、低度鳞状上皮细胞病 变、高度鳞状上皮细胞病变，意义不明的不典型鳞状细胞、子宫颈上皮内赘瘤(第一级子宫 颈上皮内赘瘤，第二级子宫颈上皮内赘瘤，第三级子宫颈上皮内赘瘤)、发展中子宫颈癌、腺 癌多克隆、鳞状上皮细胞癌，以及其组合群。
全文摘要
本发明实施案例，提供方法、单克隆抗体、多克隆抗体、试验和试剂盒，侦测人乳头状瘤病毒感染，包括各式人乳头状瘤病毒型之感染及早期或晚期人乳头状瘤病毒相关性或特异性之蛋白和抗体。在单一试验中，单克隆抗体可侦测高风险及低风险人乳头状瘤病毒型之原致癌基因，且不受限于试验之形式，提供一可专一性侦测侵袭性子宫颈癌之有利工具。本专利发明亦对子宫颈癌之生物标记进行确认，生物标记可配合试验方法，可用于侦测早期癌前病灶或癌症晚期之发展状况。
文档编号G01N33/53GK102066931SQ200980131077
公开日2011年5月18日 申请日期2009年6月12日 优先权日2008年6月13日
发明者郑淑玲 申请人:郑淑玲