专利名称：筛选高亲和力抗体的方法
筛选高亲和力抗体的方法本发明报告了基于抗体的热力学参数确定高亲和力抗体的方法，特别是基于过渡 态的热力学评估结合熵，例如标准缔合结合熵(associationbinding entropy, AS°|aSS )
和在抗原结合步骤过程中的熵负荷。
背景技术：
产生具有卓越的抗原特异性和超乎寻常的抗原复合体稳定性的高亲和力抗体是 诊断和治疗抗体开发的主要目标。关于蛋白质-蛋白质相互作用的热力学分析，最常用的技术是量热法测定 (Chaires, J. B. , Annu. Rev. Biophys. 37(2008) 135-51 ；Perozzo, R.等 人’ J. Recept. Signal Transduct. Res. 24(1-2) (2004) 1-52 ；Li, L.等 A, Chem. Biol. Drug Des. 71(6) (2008)529-32 ；Liang, Y.，Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai)40(7)(2008)565-76 ； Thielges，M. C.等人，Biochemistry 47 (27) (2008) 7237-47)。反应量热确定所需的样品量 高，例如至少125μ g/ml的抗体浓度和至少150 μ 1的样品体积。此外，反应量热法需要高 的样品纯度且不耐受任何样品杂质或样品异质性，样品缓冲液直接影响获得的热力学参数 的结果。反应量热法仅能够解析平衡热力学。表面等离振子共振(SPR)仪器测量(Roos, H.等人，J. Mol. Recognit. 11(1-6) (1998) 204-10 ；Van Regenmorte 1, Μ. H.等人，J. Mol. Recognit. 11 (1-6) (1998) 163-7 ； Gunnarsson, K. , Curr. Protoc. Immunol, 第 18 章，(2001)Unit 18. 6 ；Drake, Α. W.等 人，Anal. Biochem. 328 (1) (2004) 35-43 ；Kikuchi, Y.等人，J. Biosci. Bioeng. 100 (3)
(2005)311-7)允许以高通量方式快速测定温度依赖性动力学谱(参见例如，Canziani, G.A.等人，Anal. Biochem. 325(2) (2004)301-7 ；Safsten, P.等人，Anal. Biochem. 353(2)
(2006)181-190 ；Leonard, P.等人，J. Immunol. Methods 323 (2) (2007) 172-9)。ffassaf. D.等人(Anal. Biochem. 351 (2006) 241-253)报道了利用表面等离振子共 振微阵列高通量亲和排列抗体。Roos, H.等人，J. Mol. Recognit. 11 (1998) 204-210中报道 了利用生物传感技术进行蛋白质相互作用的热力学分析。发明概述本发明提供了利用温度不依赖性抗原复合体稳定性选择高亲和力抗体的方法，特 征是焓驱动的抗原缔合，负的熵负荷和在抗原解离过程中大的熵改变。本发明的第一个方面是从结合抗原的多个抗体中选择抗体的方法，所述方法包括 下列步骤-基于抗原的分子量优化表面等离振子共振测定中的信号应答，从而在测定的温 度范围内保持Rmax值恒定，-实施动力学筛选步骤，包括根据通式(I)基于表面等离振子共振测定计算抗原 复合体稳定性(I)抗原复合体稳定性=(I"[BL (RU)-SL (RU)/BL (RU)])BL表示设置在抗原注射终点不久前的结合晚期(Binding Late)参照点，SL表示 设置在复合体解离期终点不久前的稳定性晚期(lability Late)参照点，
-选择具有大于95%复合体稳定性的抗体，-在171、211、251、291、331和37°C，通过表面等离振子共振确定温度依赖性 动力学数据，-计算过渡态热力学性质，-基于温度依赖性增加的抗原复合体缔合速率常数Ka[l/Ms]，以及保留的或降低 的抗原复合体解离速率常数kd[l/s]选择抗体。在该方面的一个实施方案中，-基于表面等离振子共振测定和利用热力学筛选计算所述抗体的热力学性质，来 产生温度依赖性动力学数据，所述热力学筛选是在17°C用107nM、在21°C用78nM、在25°C用 70nM、在用64nM、在33°C用58nM和在37°C用53nM的抗体浓度来实施的，和/或-热力学性质是焓驱动的AHc^ass抗原复合体缔合期和低于10J/K女mol的结合 熵 AS。Jass^ / 或-用解离期选择抗体，所述解离期表现出负的或接近零的解离活化能 (EadiSS[kJ/mol])、负的解离焓(AIPtdiSS [kj/mol])和大的负解离熵(ASIdisS [kj/ mol])ο本发明的一个方面是生产抗体的方法，包括下列步骤a)提供多个细胞，优选是杂交瘤细胞或B细胞，每种细胞都表达抗体，b)在不同的温度和不同的抗体浓度下，通过表面等离振子共振确定所述抗体与各 抗原结合的时间依赖量，c)基于等式(II)至(XIII)，(II)AG° = ΔΗ° _T*AS°(III) AG° =-R*T*lnKD(IV)InK11 =-1/T*( Δ H。/R)/斜率-(Δ S。/R)/截距(V)R*T*lnKD = ΔΗ° T0_T*AS° T0+AC° p (T-T0)—Τ* Δ Cp° 1η(Τ/Τ0)(VI) ka =。禪町)(VII) lnka/T = -1/T * (ΔΗ。$/Ε)/斜率 ++ lnkb/Α)織距(VIII) ka = A*e-WK*T(IX) Inka = InA/ 截距-(l/I^Ea/R) / 斜率(χ) Icd = (kb*T/A)*e(-·。揮町)(XI) lnkd/Τ = -1/T * (AH。$/R)/斜率 + (ASI/R + InkeZA)/截距(XII) kd = A*e-WK*T(XIII) Inkd = InA/ 截距-(l/I^Ea/R) / 斜率用b)中确定的时间依赖量至少计算热力学参数⑴标准缔合结合熵(AS0Iass),(ii)标准解离结合熵(AS0Idiss)，(iii)标准结合熵(AS° )，(iv)自由(free)标准结合焓(AG° )，
(ν)标准解离自由结合焓(AG0Idiss)，(Vi)标准缔合自由结合焓(AG0Iass),(vii)-T Δ S。，(viii)解离速率常数kd，(ix)平衡结合常数KD，和(χ)缔合速率常数Ka，d)选择生产这样的抗体的细胞，所述抗体具有至少两种下列的i)低于10J/K * mol的标准缔合结合熵，ii)100J/mol * K或更高的绝对标准解离结合熵，iii)100J/mol * K或更高的绝对标准结合熵，e)在适合所述抗体表达的条件下，通过培养所述选定的细胞生产抗体，并从细胞 和/或培养基中回收所述抗体。在一个实施方案中，方法包括一个或多个下列额外的步骤-在a)之后和b)之前al)培养a)的细胞，并提供培养上清液，所述培养上清液 分别含有由所述细胞表达的抗体，-在d)之后和步骤e)之前dl)从所述选定的细胞中分离编码所述抗体的核酸， 基于所述分离的核酸提供另一种核酸，所述另一种核酸编码所述抗体的嵌合的、CDR移植 的、T细胞表位缺失的和/或人源化的变体，提供在表达盒中含有所述修饰的核酸的表达质 粒，和用所述表达质粒转染CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞或PER. C6细胞。本发明的另一个方面是用于从多个抗体中选择温度不依赖性抗原结合抗体的方 法，例如，用于治疗性处理，从而用低于10J/K * mol的标准缔合结合熵(AS0Iass)选择抗 体。在该方面的一个实施方案中，用至少下列2种选择抗体a)低于10J/K * mol的标准缔合结合熵(AS°|aSS ),b) I00j/mol * κ或更高的绝对标准解离结合熵(AS°|diss)，c)100J/mol * K或更高的绝对标准结合熵(AS° )。在根据本发明的方法的一个实施方案中，标准缔合结合熵(AS0Iass)低于5J/K 女mol。在另一个实施方案中，标准缔合结合熵(AS0Iass )低于0J/K rnol。在另一个实 施方案中，绝对标准解离结合熵(ASIdiss )是125J/mol * K或更高。在另一个实施方案 中，绝对标准解离结合熵(ASc5IcUss )是I50j/mol * κ或更高。在另一个实施方案中，绝 对标准结合熵)是125J/mol * K或更高。在另一个实施方案中，绝对标准结合熵 (AS° )是 150J/mol * K 或更高。在本发明的一个实施方案中，方法的特征是用-50kJ/mol或更低的自由标准结合 焓)选择抗体。在另一个实施方案中，本发明方法的特征是用标准解离自由结合焓 (AG0Idiss)比标准缔合自由结合焓(AGIass)的比例来选择抗体，所述比例大于2. 3。 在另一个实施方案中，方法的特征是用以下的-τ △ S。值选择抗体
a) -80k J/mo 1 或更低，或b)+40kj/mol 或更高。本发明的另一个方面是用于从多个抗体中选择温度不依赖性抗原结合抗体的方 法，例如用于药物组合物，包括这样的步骤，所述步骤是用随着温度增加而保持在相同数量 级，或降低至多两个数量级的解离速率常数kd(l/s)选择抗体。本发明的另一个方面是用于从多个抗体中选择温度不依赖性抗原结合抗体的方 法，例如用于药物组合物，包括这样的步骤，所述步骤是用随着温度增加而保持恒定或降低 的平衡结合常数kD (M)选择抗体。在根据本发明的方法的一个实施方案中，温度范围是从13°C至37°C。本发明的另一个方面是用于从多个抗体中选择温度不依赖性抗原结合抗体的方 法，例如用于药物组合物，包括步骤i)确定温度-依赖性动力学数据，ii)计算过渡态(TS)热力学性质，和iii)基于热力学行为选择抗体。在根据本发明的方法的一个实施方案中，特征是所述热力学行为是温度依赖性 增加的抗原复合体缔合速率常数ka[l/Ms]，和保持的或降低的抗原复合体解离速率常数 kd[i/s]。在另一个实施方案中，所述热力学行为是焓驱动的AHc^ass抗原复合体缔合期， 和低于ioj/κ女mol的结合熵ASc^asso在另一个实施方案中，用解离期选择抗体，所述解 离期表现出负的或接近零的解离活化能(EadiSS[kJ/mol])、负的解离焓(AHIdiSS [kj/ mol])和大的负解离熵([kj/mol])。在另一个实施方案中，通过表面等离振子共振确定温度依赖性动力学数据，并包 括动力学筛选步骤和热力学筛选步骤。在一个实施方案中，所述动力学筛选步骤包括基于 表面等离振子共振测定根据通式(I)计算抗原复合体稳定性(I)抗原复合体稳定性=(I"[BL (RU)-SL (RU)/BL (RU)])BL表示设置在抗原注射终点不久前的结合晚期参照点，SL表示设置在复合体解 离期终点不久前的稳定性晚期参照点。在另一个实施方案中，方法包括基于抗原的分子量 优化表面等离振子共振测定中的信号应答的步骤，从而在测定的温度范围内保持ILx值恒定。在根据本发明的方法的一个实施方案中，特征是所述通过表面等离振子共振测定 包括下列步骤a)通过结合在固体支持表面上的捕获分子将抗体固定在所述固体支持表面上，b)提供包含抗原的溶液，c)将含有已知浓度的抗原的溶液流经固体支持表面，从而允许抗原与固定化抗体 的缔合，d)将不含抗原的溶液流经固体支持表面，从而允许抗原从固定化抗体上解离，e)在步骤C)和d)的过程中监控与固体支持表面结合的抗原的时间依赖量，并收 集结合数据，其中用不同浓度的抗原重复步骤c)和d)至少1次，和f)通过将e)中获得的结合数据拟合到预定模型中，计算动力学和/或热力学参 数，所述预定模型是基于等式(II)至(XIII)用于抗原和固定化抗体之间相互作用的模型。
在一个实施方案中，所述抗体的固定通过物种特异性抗体捕获分子进行。本发明的一个方面是药物组合物，所述组合物包含用本发明的方法生产的抗体在一个实施方案中，通过选择具有大于95%的复合体稳定性的抗体，来实施动力 学筛选中的抗体选择。在另一个实施方案中，基于抗原的分子量优化抗原信号应答。本发明的另一个方面是通过表面等离振子共振选择抗体的方法，其中产生温度依 赖性动力学数据从而计算过渡态(TS)的热力学性质，并基于热力学行为来选择抗体，其中 所述温度依赖性动力学数据的产生是基于表面等离振子共振测定和利用热力学筛选进行 的所述抗体的热力学性质计算，所述热力学筛选是在17°c用107nM、在21°C用78nM、在25°C 用70nM、在29°C用64nM、在33°C用58nM和在37°C用53nM的抗体浓度来实施的。发明详述本发明报告了选择与抗原结合的抗体的方法，特征是产生温度依赖性的动力学数 据从而计算过渡态(TS)的热力学性质，和基于热力学行为选择抗体。已发现基于表面等离振子共振的动力学方法比传统的量热法测定有若干优势-能够进行高通量处理，_低样品消耗，-测量亲和力(affinity)取代亲合力(avidity)，和-使用粗制的细胞上清液或复杂的培养混合物。表面等离子生物传感表面是亲和力基质，用于例如从细胞培养上清液中捕获抗 体。因此，可以使用粗制的和复杂的混合物作为样品。由于相互作用的搭档之一固定在传感 器的表面上，而将第二种化合物注射到流动系统中，因此能够测量平衡和过渡态的热力学， 因为FIA(流动注射分析)系统可以独立的监控复合体的缔合和解离期。利用该技术，能够 计算热力学参数-自由标准结合焓ΔG。，-标准结合焓ΔΗ°，-标准结合熵AS°，和过渡态参数-自由标准缔合焓AG0Iass,
-标准缔合焓 AHQ:j:ass,-标准缔合熵AS0Iass,-活化能Eaass，-自由标准解离能AGIdiss,-标准解离焓AHIdiss,-标准解离熵ASIdiss^-解离能Eadiss。在使用非线性范特霍夫等式(van，t Hoff equation)的情况下，确定ACp值。本发明的一个方面是基于其热力学特征选择抗体的方法。通常，基于SPR的动力学抗体筛选(参见例如，Steukers, M.等人，J. Immunol. Methods 310 (1-2) (2006) 126-35 ；Rich, R. L.等人，Anal. Biochem. 361 (1) (2007) 1-6)后续 第二个步骤为更高解析度的热力学sra分析。
利用本发明方法可以选择抗体，所述抗体在升高的温度下具有至少恒定的或增加 的亲和力，即在升高的温度下至少恒定或增加的抗原复合体稳定性。抗原复合体稳定性是 抗体筛选工艺中的主要选择标准。仅选择原代细胞培养物，所述培养物生产分别在25°c或 37°C下具有高稳定性抗原复合体的抗体。产生生产抗体的细胞培养物，并在一个实施方案中进行高通量分析，其中为了计 算过渡态(TS)的热力学性质，产生温度依赖性的动力学数据。根据本发明方法，基于其热 力学行为进行抗体选择。在该方面的一个实施方案中，选定的抗体的特征是温度依赖性增加的抗原复合体 缔合速率常数Ka[l/Ms]，以及保持的或降低的抗原复合体解离速率常数kd[l/s]。此类抗体 通常特征是焓驱动的AHIass抗原复合体缔合期和负的结合熵ASIass，其在本申请中 表示“熵负荷”。用本发明方法选定的抗体的特征是抗原相互作用机制，表现为在结合平衡 中大的熵改变。该熵贡献(entropic contribution)来自抗体-抗原复合体解离步骤，其 中发生了解离熵ASc^diss的大的正改变和大的负改变。此外，用本发明方法选定的抗体可 以具有源自抗原解离期的热力学异常，其中在升高的温度下解离速率常数kd[l/s]令人惊 讶的和预料之外的降低。此类抗体的特征由热力学参数表征，例如i)表现出负的或接近零 的解离活化能EadiSS [kj/mol]的解离期，ii)负的解离焓AHc^diSS [kj/mol]，和iii)大 的负解离熵ASc^diss [kj/mol]。需要指出的是这是该效应的完全理论的处理。因此，本发明的方法允许基于热力学参数从大量的高亲和力抗体中选择抗体，所 述参数提供了选定的抗体与抗原的相互作用模式的基础，即，抗体诱导抗原的构象改变或 抗体本身经历了构象改变。因此，方法可用于选择生产具有高的抗原复合体稳定性的抗体 的 细胞。在一个实施方案中，本发明的方法包括动力学筛选步骤和热力学筛选步骤。对于 动力学筛选，在抗原注射终点不久前设置结合晚期(BL)参照点，在复合体解离期终点不久 前设置稳定性晚期(SL)参照点。在一个实施方案中，用X-Y-点示BL和SL数据，X轴 显示结合晚期参照点的应答单位(RU)值，Y轴以应答单位(RU)显示稳定性晚期参照点的 值(示例性的点图参见
图1)。此外，基于BL和SL数据，可以根据通式(I)计算抗原复合体 稳定性抗原复合体稳定性=(1-[BL(RU)-SL (RU)/BL (RU)]) (I)在另一个实施方案中，是通过X-Y点示了 BL和抗原复合体稳定性数据，X轴 以应答单位(RU)显示结合晚期参照点的值，Y轴显示针对复合体稳定性的百分比值(示例 性的点图参见图2)。在一个实施方案中，在25°C实施动力学筛选步骤。在另一个实施方案 中，在37°C实施动力学筛选步骤。在另一个实施方案中，在13°C和42°C之间的一组两个或 多个不同的温度实施动力学筛选步骤。在热力学筛选之前，在一个实施方案中，使用RPMI 1640培养基在100ml旋转培养 瓶中培养单细胞保藏的克隆。在另一个实施方案中，在热力学筛选之前，通过蛋白A琼脂糖 (TM)柱色谱，从上清液中纯化抗体。在一个实施方案中，用于热力学筛选的系统缓冲液是 HBS-EP0在另一个实施方案中，样品缓冲液添加了 lmg/ml羧甲基葡聚糖，以降低非特异性 的传感基质效应。下文可以以抗人PTH抗体的分析作为一个实例，描述本发明的方法。该实例不需理解为对本发明方法的限制，其实际上是为了示例本发明方法的教导而存在的。本申请的 范围叙述在权利要求中。在第一步中，实施杂交瘤上清液的动力学筛选。图1示意了来自549杂交瘤原代 培养物经过多次免疫和融合行动的结合晚期数据和稳定性晚期数据。选择具有充分的抗原 应答(BL)和缓慢的抗原复合体解离(SL)的杂交瘤细胞用于进一步的筛选步骤。例如，使 用编号123、119、499、133和295的细胞进行后续处理(参见图1中的圆圈)，由于不充分的 复合体稳定性抛弃了编号189、263和341的细胞(参见图1中 的方框)。为了便于鉴别具有高抗原应答和高复合体稳定性的抗体，可以使用图表，在所述 图表中，以]表示的获得的复合体稳定性相对于结合晚期应答信号绘制(参见例如图 2)。在一个实施方案中，对于动力学筛选中的抗体选择，选择具有95%或更高的复合体稳定 性的高抗原复合体稳定性结合子。使用基于SPR的测量的大部分出版物不使用抗体捕获系统作为传感器表面呈递 技术。通常，抗体或其片段共价的固定在传感器上。该技术不可以高通量形式使用，因为表 面不适合多目的的抗体呈递，除了其技术上受配体固定的传感器数目限制以外。如果使用捕获系统进行热力学测量，抗体捕获水平随动力学的温度灵敏度而改变 (参见图15)。为了使用用于热力学的抗体捕获系统，绝对需要保证同质的、温度不依赖性 的抗体捕获水平。在低温下，热力学测量有两个主要的问题。第一，在低温下，抗体捕获系统的动力 学太缓慢而不能捕获足够的二级抗体进行分析。第二，抗原_抗体相互作用的动力学也减 慢。动力学显示，由于在4°C和irC的缓慢的动力学导致强烈的损失了测定解析度。在完 整的温度范围内未能实现任何平衡。在温度梯度中，Rmax值小且非同质的。随着增加温度， 由于二级抗体更快的缔合速率，捕获的mAb的量同步增加。随着增加温度，抗原动力学也 加速，且抗原Rmax值增加。由于未达到任何平衡，故这些测定的Rmax值更确切的是试错的 (error-prone) 0非同质的传感器性能导致热力学计算的高误差。计算的参数都不能达到 95%显著性。因此，需要优化实验使用的温度梯度以及传感器表面的制备。已发现，主要通过 抗体捕获系统的温度依赖性滴度，利用优化的温度梯度和调试的注射时间，来优化传感器 的性能，使得在完整的运行过程中Rmax值是恒定的。图15中比较了结果。Rmax平均值是 35RU+/-3RU。在> 30°C的温度下达到平衡。本文使用的最低温度是15°C。表1比较了 关于平衡的(线性范特霍夫)、缔合期的(Eyring和Arrhenius)和解离期的(Eyring和 Arrhenius)热力学参数计算，利用传统测定与优化测定进行比较。表1 在非优化和优化形式中相互作用的热力学
权利要求
1.从多个抗体中选择抗体的方法，所述方法包括下列步骤-基于抗原的分子量优化表面等离振子共振测定中的信号应答，从而在测定的温度范 围内保持Rmax值恒定，-实施动力学筛选步骤，包括基于表面等离振子共振测定根据通式(I)计算抗原复合 体稳定性(I)抗原复合体稳定性=(I"[BL (RU)-SL (RU)/BL (RU)])BL表示设置在抗原注射终点不久前的结合晚期参照点，SL表示设置在复合体解离期 终点不久前的稳定性晚期参照点，-选择具有大于95%复合体稳定性的抗体，-在171、211、251、291、331和37°C，通过表面等离振子共振确定温度依赖性动力 学数据，-基于等式(II)至(XIII)，计算过渡态热力学性质，-基于温度依赖性增加的抗原复合体缔合速率常数Ka[l/Ms]，以及保持的或降低的抗 原复合体解离速率常数kd[l/s]选择抗体。
2.权利要求1的方法，特征是-所述热力学性质是焓驱动的AHc^ass抗原复合体缔合期和低于10J/K * mol的结合 熵 AS。Jass^ / 或-用解离期选择抗体，所述解离期表现出负的或接近零的解离活化能(fedissDa/ mol])、负的解离焓(AH。|diss [kj/mol])和大的负解离熵(AS。|diss [kj/mol])。
3.用于从多个抗体中选择温度不依赖性抗原结合抗体的方法，例如，用于治疗性处理， 其中用低于10J/K女mol的标准缔合结合熵(AS0Iass)选择抗体。
4.权利要求3的方法，特征是用至少下列2种选择抗体a)低于10J/K* mol的标准缔合结合熵(AS°|aSS ),b)100J/mol * K或更高的绝对标准解离结合熵(AS0Idiss)， C) 100J/mol K或更高的绝对标准结合熵(Δ S° )。
5.权利要求3或4的方法，特征是标准缔合结合熵(AS0Iass)低于5J/K * mol。
6.权利要求3-5的任一项的方法，特征是标准缔合结合熵(AS0Iass)低于0J/K*mol ο
7.权利要求3-6的任一项的方法，特征是绝对标准解离结合熵(AS0Idiss)是125J/ mol -k K或更高。
8.权利要求3-7的任一项的方法，特征是绝对标准解离结合熵(AS0Idiss)是150J/ mol -k K或更高。
9.权利要求3-8的任一项的方法，特征是绝对标准结合熵(AS°)是125J/mol女K 或更高。
10.权利要求3-9的任一项的方法，特征是绝对标准结合熵(AS°)是150J/mol女K或更高。
11.权利要求3-10的任一项的方法，特征是用-50kJ/mol或更低的自由标准结合焓(AG0 )选择抗体。
12.权利要求3-11的任一项的方法，特征是用标准解离自由结合焓(AG0Idiss)与标 准缔合自由结合焓(AG0Iass)大于2. 3的比例来选择抗体。
13.权利要求3-12的任一项的方法，特征是用以下的-TΔ S。值选择抗体a)-80kJ/mol或更低，或b)+40kj/mol或更高。
14.用于从多个抗体中选择温度不依赖性抗原结合抗体的方法，包括用随着温度增加 而保持在相同数量级，或降低至多两个数量级的解离速率常数kd(l/s)选择抗体的步骤。
15.用于从多个抗体中选择温度不依赖性抗原结合抗体的方法，包括用随着温度增加 而保持恒定或降低的平衡结合常数kD(M)选择抗体的步骤。
16.权利要求3-15的任一项的方法，特征是温度范围从13°C至37°C。
17.用于从多个抗体中选择温度不依赖性抗原结合抗体的方法，包括步骤i)确定温度-依赖性动力学数据， )计算过渡态(化)热力学性质，和iii)基于热力学行为选择抗体。
18.权利要求17的方法，特征是所述热力学行为是温度依赖性增加的抗原复合体缔合 速率常数ka[l/Ms]，和保持的或降低的抗原复合体解离速率常数kd[l/s]。
19.权利要求17或18的方法，特征是所述热力学行为是焓驱动的AHc^ass抗原复合 体缔合期，和低于10J/K * mol的结合熵AS°:j:ass0
20.权利要求17-19的任一项的方法，特征是用解离期选择抗体，所述解离期表现出负 的或接近零的解离活化能(EadiSS[kJ/mol])、负的解离焓(AHIdiSS [kj/mol])和大的 负解离熵(AS°|diss [kj/mol])。
21.权利要求3-20的任一项的方法，特征是通过表面等离振子共振确定温度依赖性动 力学数据，并包括动力学筛选步骤和热力学筛选步骤。
22.权利要求21的方法，特征是所述动力学筛选步骤包括基于表面等离振子共振测定 根据通式(I)计算抗原复合体稳定性(I)抗原复合体稳定性=(1-[BL(RU)-SL(RU)/BL(RU)]),BL表示设置在抗原注射终点不久前的结合晚期参照点，SL表示设置在复合体解离期 终点不久前的稳定性晚期参照点。
23.权利要求21或22的方法，特征是方法包括基于抗原的分子量优化表面等离振子共 振测定中的信号应答的步骤，从而在测定的温度范围内保持Rmax值恒定。
24.权利要求21-23的任一项的方法，特征是所述通过表面等离振子共振测定包括下 列步骤a)通过结合在固体支持表面上的捕获分子将抗体固定在所述固体支持表面上，b)提供包含抗原的溶液，c)将含有已知浓度的抗原的溶液流经固体支持表面，从而允许抗原与固定化抗体的缔合，d)将不含抗原的溶液流经固体支持表面，从而允许抗原从固定化抗体上解离，e)在步骤c)和d)的过程中监控与固体支持表面结合的抗原的时间依赖量，并收集结 合数据，其中用不同浓度的抗原重复步骤c)和d)至少1次，和f)通过将e)中获得的结合数据拟合到预定模型中，计算动力学和/或热力学参数，所 述预定模型基于等式(II)至(XIII)用于抗原和固定化抗体之间的相互作用。
25.权利要求对的方法，特征是通过物种特异性抗体捕获分子固定所述抗体。
26.权利要求17-25的任一项的方法，特征是通过用大于95%的复合体稳定性选择抗 体，来实施动力学筛选。
27.权利要求21-26的任一项的方法，特征是基于抗原的分子量优化抗原信号应答。
28.用于生产抗体的方法，包括下列步骤a)提供多个细胞，每种细胞都表达抗体，b)在不同的温度和不同的抗体浓度下，通过表面等离振子共振确定与各抗原结合的所 述抗体的时间依赖量，c)基于等式(II)至(XIII)，(II)= ΔΗ° -T*AS°(III)AG° =-R*T*lnKD(IV)InK11= _1/Τ*( Δ H° /R)/斜率-(Δ S。/R)/截距(V)R*T*lnKD= ΔΗ° T0_T*AS° T0+AC° ρ (T-T0)-Τ* Δ Cp° 1η(Τ/Τ0)(VI)ka = (kb*T/A)*e(-AG°_*T)(VII)lnka/T = -1/Τ * (AH。J/R)/斜率 + (AB°i*R + InkbZA)/截距(VHDka = A*e-Ea/E*T(IX)Inka = InA/ 截距-(l/T*Ea/R) / 斜率(X)kd = (kb*m)*eWi/R*T)(XI)lnk/Γ = -1/Τ * (ΔΗΙ/R)/斜率 + (AS0JZR + Inke/A)/截距(XH)kd = A*e-Ea/E*T(XIII) Inkd = InA/ 截距-(1/I^Ea/R) / 斜率 用b)中确定的时间依赖量至少计算热力学参数 ⑴标准缔合结合熵(AS0Iass),(ii)标准解离结合熵(AS°:j:diss)，(iii)标准结合熵(as°)，(iv)自由标准结合焓(AG°)，(V)标准解离自由结合焓(AGQ|diss)，(vi)标准缔合自由结合焓(AG0Iass),(vii)-TAS°，(viii)解离速率常数kd，(ix)平衡结合常数KD，和(x)缔合速率常数Ka，d)选择生产这样的抗体的细胞，所述抗体具有至少两种下列的i)低于10J/K女mol的标准缔合结合熵，ii)100J/mol* K或更高的绝对标准解离结合熵，iii)100J/molK或更高的绝对标准结合熵，e)在适合所述抗体表达的条件下，通过培养所述选定的细胞生产抗体，并从细胞和/ 或培养基中回收所述抗体。
29.权利要求观的方法，包括一个或多个下列额外的步骤-在a)之后和b)之前al)培养a)的细胞，并提供培养上清液，所述培养上清液分别 含有由所述细胞表达的抗体，-在d)之后和步骤e)之前dl)从所述选定的细胞中分离编码所述抗体的核酸，基于 所述分离的核酸提供另一种核酸，所述另一种核酸编码所述抗体的嵌合的、CDR移植的、T 细胞表位缺失的和/或人源化的变体，提供在表达盒中含有所述修饰的核酸的表达质粒， 和用所述表达质粒转染CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞或PER. C6 细胞。
30.药物组合物，包含权利要求1- 的任一项的方法生产的抗体。
全文摘要
本发明报告了用于生产抗体的方法，包括步骤a)提供多个杂交瘤细胞，每种细胞都表达抗体，b)在不同的温度和不同的抗体浓度下，通过表面等离振子共振确定所述抗体与各抗原结合的时间依赖量，c)基于等式(II)至(XIII)，用b)中确定的时间依赖量至少计算热力学参数(i)标准缔合结合熵式(A)，(ii)标准解离结合熵式(B)，(iii)标准结合熵(ΔS°)，(iv)自由标准结合焓(ΔG°)，(v)标准解离自由结合焓式(C)，(vi)标准缔合自由结合焓式(D)，(vii)-TΔS°，(viii)解离速率常数kd，(ix)平衡结合常数KD，和(x)缔合速率常数Ka，d)选择生产这样的抗体的杂交瘤细胞，所述抗体具有至少两种下列的i)低于10J/K＊mol的标准缔合结合熵，ii)100J/mol＊K或更高的绝对标准解离结合熵，iii)100J/mol＊K或更高的绝对标准结合熵，e)在适合所述抗体表达的条件下，通过培养所述选定的细胞生产抗体，并从细胞或/和培养基中回收所述抗体。
文档编号G01N21/55GK102132143SQ200980133062
公开日2011年7月20日 申请日期2009年8月25日 优先权日2008年8月27日
发明者普罗夫 L·范, M·施拉伊姆尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司