专利名称：用于检测抗-hiv抗体的生物传感器的制作方法
用于检测抗-HIV抗体的生物传感器本发明提供了生物传感器，其能够基于经遗传修饰的变构酶与具有微电极网络的基质的组合使用而检测生物样品中的抗-HIV抗体。该生物传感器的一个好处在于其高度灵敏性，检测简便性以及便携性。
背景技术：
感染性疾病的精确诊断是临床和兽医医药领域中的关键要素。目前，投入了大量精力用于改善现有的测试，从而出现了新的检测方法(Kuiken等人，2003. Curr. Opin. Biotechnol.，14 :641-646)，并发现了新的策略以确保以更高的灵敏性、安全性和有效性尽早检出感染(Iqbal 等人，2000. Biosens. Bioelectronics.，15 :549-578, Dominguez EA, 1993.J.Clin. Microbiol. ,31 :2286-2290 ；Lennette EH and Smith,1999. Laboratory Diagnosis of Viral Infections, Informa Health Care)。在过去 20 年中，人类免疫缺陷病毒(HIV)是研究得最多的病毒之一，并且是开发新的直接或间接分析方法的主要靶标 (McDougal, 2001. AIDS Rev. 3 :183-193)，依赖于使用病毒作为靶标或针对它的抗体。在第一种情况下，可以通过抗原 ELISA(Schiipbach 等人，2000. Int J. Antimicrob. Agents, 16 :441-445)或通过聚合酶链式反应(PCR) (Marie Louie, 2000. CMAJ, 163 :301-309 ； Elnifro 等人，2000. Clin. Microbiol. Rev.，13 :559-570 ；Ballagi-Pordany, 1993. Vet. Res Commun. ,17 :55-72 ；Niesters,2004. Clinical Microbiology Infect. ,10 :5-11 ；Hjelle and Busch，1989. Arch Pathol. Lab Med 113 :975-980)来检测病毒成分(例如核酸或蛋白)。间接方法证明抗病毒抗体的存在，最常见的类型是抗体-ELISA、Western印迹 (Steckelberg and Cocker ill, 1998. Mayo Clin. Proc. ,63 :373-380)或其它免疫测定法 (Branson, 2007. Clin. Infect. Dis. ,45 :S221_S225)。在缺少足够的医疗设施的地理区域尤其需要允许迅速检测的可利用的移动平台的可能性。在这个意义上，生物传感器似乎是传统分析方法的有前景的替代物(Amano and Cheng, 2005. Anal. Bioanalysts. Chem, 381 156-164 ；Bobby Pejcic 等人，2006. Analyst，131 :1079-1090) 变构酶可用作有效的生物成分，因为其活性由于活性位点外的靶肽的特异性识别(被针对这些肽的特异性抗体识别)而被调控(Villaverde，2003. FEBS Lett.，554 :169-172)。变构传感器可以这样构建 从酶和病原体的肽抗原正确选取允许位点，进行蛋白插入工程化。可以在酶测定中并在简单的勻质测定的较短反应时间后跟踪变构反应。这提供了进行迅速分子诊断和超迅速感染疾病诊断的令人兴奋的可能性。在适合用作变构传感器的不同酶中(Vil Iaverde，2003. FEBS Lett.，554 169-172)，大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶(β-D-半乳糖苷水解酶，EC 3. 2. 1. 23)是非常方便的。该蛋白在IacZ基因中编码，由4个亚基组成，每个亚基是116353 Da，通过非共价键合连接在一起(Jacobson等人，1994. Nature，369 :761-766)。其具有水解乳糖和一些合成类似物的能力。最近描述了使用大肠杆菌的β-半乳糖苷酶NF795gpC的方法，该酶被固定在活化的琼脂糖上，以通过测定由于变构酶的作用转化ONPG底物而产生的颜色的强度来检测-HIV ^KW (Ferraz ^A, 2007. Enzyme and Microbial Technology, 41 (4) :492_497)。在本发明中，使用了对-氨基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(PAPG)，该底物导致形成对-氨基苯酚(一种电活性产物)，以开发基于微电极网络的新传感器平台。相对于!^erraz 等人Q007)描述的方法，本发明的重要技术优势在于所描述的酶与微电极网络的组合提供了灵敏性更高的的新传感器，从而增加了检测被HIV病毒感染的人员的效率。在此意义上，本发明提供了 “检测被HIV病毒感染的人员，，这一问题的方案，其改善了诊断该感染性疾病的速度和特异性，同时提供了便携式检测系统，该系统不需要如上所提及的现有系统所需的高成本的检测器或专业化人员。本发明的解释本发明提供了生物传感器，其用于基于经遗传修饰的变构酶(β -半乳糖苷酶)与具有微电极网络的基质的组合使用而检测生物样品中的抗-HIV抗体。变构酶根据其空间构象不同而具有不同的比活性。所述构象通过酶与特定变构效应子的结合而被改变。当抗-HIV抗体通过肽与酶结合时(这是对原始变构酶的修饰)，3D构象发生正(positively) 改变，影响活性位点的性能，刺激酶的活性。本发明提供的生物传感器的关键点在于使用变构酶底物，其产物是电活性的，例如，在适合于变构酶的PH范围内可以在微电极不同材料上被氧化的分子。该生物传感器的另一个优点是其高度灵敏性，能够检测痕量的产物。产物浓度是存在于生物样品中的与锚定于原始变构酶中的肽结合的抗-HIV抗体的量的间接度量，这是因为，如前文所述，抗-HIV抗体(作为变构效应子)的结合促进了酶活性。因此，本发明结合了两项技术上的突破，其允许检测血清样品中的HIV感染。使用了经遗传修饰的变构半乳糖苷酶，该酶响应于抗-HIV抗体的存在。还使用了用于将微电极网络制成电化学信号转导器的微技术，所述电化学信号是由酶反应产物产生的，并且由如下所述的简单系统来检测。因此，本发明的第一个方面描述了一种生物传感器，其包括a.至少通过添加被抗-Hiv抗体识别的肽而修饰的变构酶；b.包含具有微电极网络的基质的转导器；和c.电化学信号的检测器。术语“变构酶”是指这样的酶其活性由一个或数个变构位点调节。变构位点是与酶活性位点不同的位点，其与效应子(被称作变构效应子)以可逆和非共价方式结合。所述效应子的结合会改变酶的三维结构并影响活性位点的构型，从而在本发明中，增加酶活性。添加到变构酶中的肽应该被由于感染HIV病毒而由人或动物生物体产生的任意抗-HIV抗体识别。所定义的肽的序列对应于免疫系统产生的抗体所识别的蛋白的序列，该蛋白被称作抗原，被抗体识别的序列被称作表位。这些表位以高度特异性相互作用与其抗体结合，这允许抗体鉴别并仅结合其独特抗原。因此，添加到变构酶中的肽对应于HIV病毒蛋白的表位，通常是被膜蛋白例如gp41或gpl20，但不排除其它可能的抗原表位。另外，构成本发明的生物传感器的一部分的变构酶的修饰可以包括在N-末端和/ 或C-末端区域添加核苷酸或氨基酸(经修饰的或未经修饰的)(例如终止密码子)，以及在其序列的内部位点进行核苷酸或氨基酸(经修饰的或未经修饰的)的任意删除或添加。生物传感器将生物天然成分与物理化学组合起来。在本发明中，生物传感器由三部分构成生物感应器(biological sensor)、转导器和检测器。本发明的生物传感器的转导器是将酶产物的出现转化为信号的部件。转导器是由微电极网络构成的基质，其将生物化学反应转化为可定量的电信号。微电极是研究电化学过程的有力的和灵活的工具。微电极的优点是多样的，例如其体积小，可用于不同环境下，以非常小的体积运行以及其检测痕量浓度的多种元素的能力。微电极网络通常是并联的微电极的联合。它们具有微电极的优点，还具有另一个非常重要的优点，例如功率扩大，其中总电流是各单个微电极的电流之和。微电极网络可以呈现为有序的微电极网络，或随机网络，以及其它排列，例如微带。本发明的实施例2提及了制备微电极中所使用的系统，指明了微盘的量，其直径及其在基质中的有序排列。存在于网络中的微电极的量影响观测到的电流的总体大小。因此，增加网络元件的数目会引起所记录的电流的增大，因为通过每个微电极收集的电流是加成的。这允许使用灵敏性较低的设备，这可以减少设备设计和必要的部件的成本。但是，比构成基质的元件数目(因为可以说，越多越好)更重要的是尽力确保微电极彼此行为的独立性，从而它们不会彼此互相遮蔽。这是通过将微盘移开一最小距离而实现的，所述最小距离由参数例如实验时间和涉及的物质的扩散系数来决定。分子迁移的距离可通过下式进行大概的估计d = (Dx t)的平方根，其中d是迁移距离(m)，D是待研究的分子的扩散系数(m2 fht是实验的持续时间(S)。在本发明中，由于处理时间很长，可能会认为网络微电极的扩散层完全重叠，从而装置的运行方式几乎与宏电极一样，其区域将是被微电极网络占据的表面。但是，由于检测我们的应用的产物的形成机理起始于为0的初浓度，并且遍布溶液空间均勻产生，所以使用微电极网络保留了相对于传统宏电极而言更高的灵敏性的优势。电化学检测的原理是使用工作电极进行被分析的物质(变构酶与底物的反应产物)与电传导体(conductor)之间的电荷转移。该电荷转移(其是被检测的)是由于当施用相对于参考电极的恒定电位时，工作电极上的产物的氧化或还原。电化学反应涉及与辅助电极相等且相反的电荷转移，在研究酶反应产物的行为时不将其考虑在内。在本发明中，如实施例中所描述，使用了以下电极——工作电极微电极网络；——参考电极Ag/AgCl电极(3M KCl)；——辅助电极玻璃碳棒。本发明中描述的各种类型的参考和辅助电极的使用不限制其它电极的使用，所述其他电极旨在检测由反应产物产生的电化学信号，所述反应产物是由其它部分中描述的修饰的变构酶活性而产生的。电化学信号的检测器可以是电流计的或电量计的。电流测定法和电量测定法之间的区别在于电流测定法测定的是分析物的氧化或还原所产生的电流，其可以是部分的或总的。另一方面，电量测定法测定的是总电荷，即电流对时间的积分(the integral of the current in time)。这使得电量测定法更加灵敏，因为电荷总是随时间线性增加，而电流可能在任何时刻增大或减小。也可以使用其它类型的检测器，例如电位计的、电导计的或电容计的检测器。
在优选的实施方式中，本发明的生物传感器中包含的变构酶是半乳糖苷酶。该酶涉及显示出本发明的变构酶特征的任意天然或人工的半乳糖苷酶。 β -半乳糖苷酶是具有水解酶活性的酶，其催化β -半乳糖苷水解为单糖。该酶由LacZ基因编码，并且包括通过非共价键连接在一起的4个亚基。β -半乳糖苷酶具有水解乳糖和一些主要用于酶测定中的合成类似物的能力。在另一个优选的实施方式中，添加到变构酶中的肽是HIV病毒的跨膜糖蛋白gp41 的表位。HIV的外层是衍生自细胞膜的脂被膜。病毒跨膜糖蛋白gp41和被膜糖蛋白gpl20 从该外层中延伸出来，从而允许HIV与靶细胞通过识别区域而结合。在该区域中存在表位序列，其与免疫应答产生的抗体结合。HIV感染在其表面中具有被糖蛋白gp41和gpl20识别的序列的细胞，通过这种方式病毒与细胞膜结合。在另一个优选的实施方式中，生物传感器由选自SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的修饰的变构酶组成。第一个序列属于酶NF795gpC，第二个属于酶HisNF795gpC的序列。已经通过在NF795gpC的氨基末端添加组氨酸尾巴和烟草蛋白酶的切割位点而构建了后一种酶。如实施例所示，对应于SEQ ID NO 2的序列的酶不显示酶NF795gpC的活性的降低。此外，所选的变构酶可以包括在N-末端和/或C-末端区域添加核苷酸或氨基酸(经修饰的或未经修饰的)，以及在其序列的内部位点进行核苷酸或氨基酸(经修饰的或未经修饰的)的任意删除或添加。本发明的另一个方面是使用生物传感器来检测生物样品中的抗-HIV抗体。术语“生物样品，，是指单一样品，其可以来自生理液体，例如血液、血浆、血清或尿液和/或来自生物体的任意细胞组织。为了检测生物样品中的抗-HIV抗体，需要添加变构酶的合适的底物，其允许按照下一段中描述的方法中指定的方式间接测定与经修饰的变构酶结合的抗体的浓度。在本发明的另一个方面，提供了用于检测抗-HIV抗体的方法，其包括a.提取生物样品；b.将来自(a)中的生物样品与本发明的生物传感器接触；c.向来自(b)中的样品和生物传感器中加入变构酶的底物；d.记录步骤(C)中产生的电化学信号。取决于生物样品的类型，将需要对生物样品进行不同的处理以使本方法的后续步骤有效进行。这些处理包括增强该方法的有效性所需的稀释。温育需要在对于酶活性而言的最适培养基中进行，即具有调整至最适条件的PH 的培养基，其中酶是有活性的，并且使用的缓冲液保持在该范围内。应该以样品的最适稀释度(使检测的灵敏性更强的稀释度)、适宜浓度的经修饰的变构酶进行温育，并且持续时间为抗-HIV抗体与添加到酶中的肽进行结合所需的时间。在本发明的实施例5中描述了上述温育条件，其中来自感染了 HIV的患者的血清样品的稀释度是1/320或1/60，酶浓度是 ang/L，温育时间是至少45分钟。在涉及酶的化学反应即酶反应中，在起始阶段酶所作用于其上的分子被称作底物，酶将底物转化为不同的分子即产物。底物与酶的活性位点结合，并且形成酶-底物复合物。底物被酶的作用转化为产物并从活性位点释放，活性位点继而空出来，可以接受另一个底物。添加的底物浓度必须不超过抑制酶作用的浓度。如前文所述，抗-HIV抗体与添加到变构蛋白中的肽的结合刺激酶活性，促进底物与酶的活性位点的结合。结合的抗体的数目越多，能够转化的底物的数量越多。在此步骤中添加的底物应该是这样的底物其来自于酶反应的产物是电活性的。术语“电活性的产物”是电活性化学物质，即在溶液中的经过之前从非电活性化学物质(底物)发生的化学反应而形成的化学物质。这种电化学物质可以被氧化或还原，从而产生电子流。通过相关部分中描述的检测技术进行该电子流的记录。在本发明的实施例中，电活性产物是对-氨基苯酚(PAP)，当被氧化时，其产生电子流。在优选的实施方式中，变构酶的底物选自0呢6(邻-硝基苯基-0-0-吡喃半乳糖苷)、CPRG (氯代苯基红- β -D-吡喃半乳糖苷)、FDG (氟脱氧葡萄糖，也称作荧光素二 - β -D-吡喃半乳糖苷)或PAPG (对-氨基苯基-β -D-吡喃半乳糖苷)。本发明的另一个方面是用于检测抗-HIV抗体的试剂盒，其包含本发明的生物传感器。在优选的实施方式中，所述试剂盒包括变构酶底物。在本发明的更优选的实施方式中，试剂盒中包含的变构酶底物选自0呢6(邻-硝基苯基-0-0_吡喃半乳糖苷)、 CPRG (氯代苯基红- β -D-吡喃半乳糖苷)、FDG (氟脱氧葡萄糖，也称作荧光素二 - β -D-吡喃半乳糖苷)或PAPG (对-氨基苯基-β -D-吡喃半乳糖苷)。在本说明书和权利要求书的通篇，词语“包含”及其变体不是意在排除其它技术特征、添加物、组分或步骤。对于本领域技术人员而言，会呈现本发明的其它客体、优点和特征，部分来自说明书，部分来自本发明的实施。通过解释的方式提供了以下附图和实施例， 并且不是意在限制本发明。
图1显示了在0. 37V的恒定电位在微电极网络中观察到的瞬间电流。溶液中电流的测定是在仅包含0. 25mg. πιΓ1的底物⑴、仅包含2 μ g. πιΓ1的β -半乳糖苷酶(A)或包含底物(0. 25mg. ml-1)与酶(2 μ g. ml-1) ( ·)的Z缓冲液中进行的。图2显示了在温育1小时之后，在0. 37V测定的瞬间电流。将最终稀释度1/60的血清与抗-HIV抗体一起温育。底物浓度是感染的血清 (■)或未经感染的血清(a)中的0. 25mg. ml—1和2 μ g. m”HisNF795gpC ；以及，感染的血清 (A)或清洁的血清(A)中的0. 86μ g.mPHisNFTgSgpC。还在含有血清但不含HisNF795gpC 的对照(·)中测定了所产生的瞬间电流。图3显示了向微电极网络上施以0. 37V20分钟后，通过的总电荷。信号对应于与抗-HIV抗体的阳性血清(■)或阴性血清(a)在温育45分钟后，与0. 25mg. ml—1底物接触的HisNF795gpC的活性。
实施例以下通过本发明人进行的一些测试来解释本发明，其中描述了抗-HIV抗体的检测。
实施例1重组β -半乳糖苷酶HisNF795gpC的克隆、表达、纯化和活性测定组氨酸标记的重组β -半乳糖苷酶HisNF795gpC(其呈递HIV的被膜蛋白gp41的表位B)的构建是基于通过PCR在NF795gpC的氨基末端添加组氨酸尾巴和烟草蚀刻(Etch) 病毒的蛋白酶的切割位点(其允许除掉组氨酸)O^errer-Miralles等人，2001. J. Biol. Chem 276 :40087-40095)。将通过PCR(聚合酶链式反应)获得的DNA带克隆进入pNF795gpC 的独特的限制性位点NcoI和EcoRI (源于母体载体pJLA602 Gchauder等人，1987. Gene, 52 :279- ),从而产生载体pHisNF795gpC。所述质粒在噬菌体ApL和pR强启动子控制下编码经修饰的酶，所述强启动子又被热敏感性调节子CI857抑制。使用标准方法在大肠杆菌MC4100中产生蛋白HisNF795gpC(i^errer-Miralles等 Λ, 2001. J. Biol. Chem 276 :40087-40095)。然后通过离心浓缩细胞并重悬于Z缓冲液，Z 缓冲液中加入了 500mM NaClUOmM咪唑、2πιΜβ-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂混合物片剂(完全不含 EDTA，来自 Roche Applied Science)。使用 PBS 锭剂(Invitrogen)制备 Z 缓冲液， 以得到浓度为0. IM的PBS并补充ImM MgSO4和20mM KCl。以电阻率不低于18ΜΩ cnT1的去离子水制备溶液。在实验之间使用漂白剂将材料进行清洁处理。使用PH计(METR0HM 827 实验室PH计)监控溶液的pH并进行温度控制。超声和离心之后，将上清液导入经过相同的缓冲液平衡的镍柱(ImlHiTrap螯合 HP柱，GE Healthcare)。然后以相同的缓冲液清洗所述柱子，以10_300mM的咪唑梯度提取蛋白。纯化过程中不使用组氨酸尾巴之后包括的蛋白酶切割靶标，因为认为这没有必要，这是由于蛋白的酶活性不受添加组氨酸尾巴的影响。在ELISA微量板中通过β -半乳糖苷酶小型化活性测定法O^errer-Miralles等人，2001. J. Biol. Chem 276 =40087-40095)检测含蛋白的级份，使用邻-硝基苯基β -D-吡喃半乳糖苷作为底物。将收集的蛋白级份针对缓冲液Z进行透析。用分光光度法通过在 260和^Onm的测定估计蛋白浓度。通过公开的Miller法的变体方法(Ferrer-Miralles 等人，2001. J. Biol. Chem 276 :40087-40095)测定酶活性。实施例2微电极网络的表征之前在其它地方已经描述了本研究中使用的薄层微电极网络(Ordeig等人 2006b.Electroanalysis, 18 :247-252, Ordeig 等人 2006c.Electroanalysis,18 573-578)。这些网络由1 个直径为ΙΟμπι的微盘组成，排列于正方网格内，中心间的距离为100 μ m。首先，使用乙醇清洁电极，然后通过施用OV至2V连续电位脉冲针对Ag/AgCl(3M KCl)进行电化学激活。然后在ImM亚铁氰化钾中通过循环伏安法表征电极。在不同的扫描速率分析限制性电流(例如在Ordeig等人，2006a. Analyst, 131 :440-445中描述的那样)， 允许阐明在实验全程过程中的任意给定时间的网络的活性微盘数目。在每次测定之后重复该操作，以确定微电极的钝化程度。虽然电极的性能通常受到存在于所用的悬浮液中的其它蛋白的吸附的影响，但是有可能在清洁的电解质溶液中在每次电化学激活循环之后完全恢复网络的最初行为。实施例3微电极网络中的对-氨基苯酚(PAP)电化学
通过对-氨基苯酚PAP的氧化间接进行抗-HIV抗体的检测，PAP是由β -半乳糖苷酶从4-氨基苯基- β -D-吡喃半乳糖苷PAPG产生的(Niwa等人，1993. Anal. Chem, 65 1559-1563 ；WolIenberger 等人，1994. Analyst, 119 :1245-1249)。该方法的优点在于 PAP 在中等电位(大约0.3V，针对Ag/AgCl(3M KCl))时被可逆地氧化，并且它实质上不会弄脏(mess up)电极(Salavagione 等人，2005. J. Electroanal. Chem，576 139-145)。但是， PAP 的氧化是根据 EC 机制进行的(Bard and Faulkner, 2000. Electrochemical Methods Fundamentals and Applications, 2nd Edition, John Wiley & Sons, New York),其中发生电子转移的第一个步骤，然后是相关的化学反应，此外，已知其在广阔的PH范围内被水解(Wang等人，1999. J. Electroanal. Chem, 464 :181-186)。此外，我们发现，我们的金电极微弱吸收对-氨基苯酚。这可能是导致文献中出现该物质的扩散系数的数值范围的原因 (Niwa 等人，1993. Anal. Chem, 65 1559-1563，Wang 等人，1999. J. Electroanal. Chem, 464 181-186，Robinson 等人，1990. J. Phys. Chem, 94 :1003-1005)。根据对在我们的微电极网络中获得的限制性电流的分析，我们估计表观扩散系数是(4.45士0.45)x IO-IOm2s-10在本工作的所有计算中我们都使用该数值。在Z缓冲溶液(含ImM PAP的0. IM PBS)中进行测定。根据伏安法，我们决定在随后的PAP的电流计测定实验中使用0. 37V针对Ag/AgCl (3M KCl)的工作电位，因为在该电位时，PAP的氧化仅由扩散控制。根据在IOOmV s—1时测定的限制性电流确定PAP的检测限值。在该扫描速度时，确保网络中的微盘的扩散独立性(Davies and Compton，2005. J. Electroanal. Chem,585 :63-82, Davies 等人，2005. J. Electroanal. Chem 585 :51-62)。 *艮据 Long 禾口 Winefordner (1983)提出的误差传播方法(因为其提供了比IUPAC的3ο方法更现实的结果 (Danzer and Currie,1998. International Union of Pure and Applied Chemistry,70 993-1014))，估计出检测限值为4 μ M。实施例4野生型β -半乳糖苷酶的电化学检测图1显示在工作电位，在20分钟的电极极化时间内，单独的底物或野生型β -半乳糖苷酶都不产生显著的应答。但是，当混合时，迅速出现来自酶活性的ΡΑΡ。对于给定的酶浓度，反应速率与所产生的产物的氧化电流直接相关，在本例中所述产物为ΡΑΡ。电流相对于时间的曲线的最初斜率作为给定底物浓度的速率。如果给出在连续的底物浓度测定的最初速率，则可以获得常数Kn^Pkcat的值。研究了经典的Michaelis-Menten型机制下酶的动力学，发现Km和Kcat的值分别是大约3. 15x lO—W Γ1和0. 18s—1。实施例5通过His_NF795gpC检测血清中的HIV抗体由于His-NF795gpC酶的稳定性比野生型酶差，所以在含有(重量/体积)BSA 的Z缓冲液中进行测定。但是，以微电极网络进行酶活性的电化学监控仍然是可行的。在较高的酶浓度时，电流在经过最大值之后下降。由于在低水平的酶时没有电流的下降，所以怀疑当酶浓度过高时存在底物的定量消耗。可能影响传感器以类似方式应答的其它因素是微电极的钝化，其由蛋白的吸附引起，但也可能是由于酶的抑制。虽然不能消除酶的抑制，但是我们认为在本发明的实验条件下这是可以忽略的，而且一般可以通过底物消耗和电极钝化的组合来解释功率损失。
将底物加入到电化学小室中之后，立即记录PAP的氧化电流。在所研究的所有例子中，His-NF795gpC蛋白与阳性血清的温育使活性增强至少56%。在以实际样品进行的测试中，将aiig Γ1的酶与最终稀释度1/60的来自感染了 HIV-I的患者的血清混合物一起温育45分钟。图3显示了主实验的结果，其由以下组成将酶(蛋白HisNF795gpC)与来自感染个体和健康个体的两种不同类型的血清的连续稀释物库一起温育。对于每种情况，进行三次测定，以允许估计平均值和对应的误差条。我们使用标准偏差与95%的置信区间作为误差的度量。抗体的识别在1/320的血清稀释度时是最佳的。从该血清浓度点开始，酶活性的增大未超过该水平。电量测定法是比测定酶反应的最初速率更值得信赖的度量，或者比测定与底物反应20分钟后的电流更值得信赖的度量。电荷测定是更精确的，并且允许以较低浓度的酶和底物进行工作(图2)。用于本实施例的电化学测定中的稳压器是由GPES 4程序控制并连接至安装了 Windows XP的电脑的Autolab PG12。长度为5cm，直径为3mm的玻璃碳棒用作辅助电极， Metrohm Biotrode Ag/AgCl (3M KCl)用作参考电极。所有溶液的温度由连接至恒温水浴的双层壁的小室(double-walled cell)控制。
权利要求
1.生物传感器，其包括a.至少通过添加被抗-HIV抗体识别的肽而修饰的变构酶；b.包含微电极网络的基质的转导器；和c.电化学信号的检测器。
2.根据权利要求1的生物传感器，其中所述变构酶是半乳糖苷酶。
3.根据权利要求1的生物传感器，其中所述肽是HIV病毒的跨膜糖蛋白gp41的表位。
4.根据权利要求1的生物传感器，其中所述修饰的变构酶选自SEQID NO :1或SEQ ID NO :2。
5.根据权利要求1-4任一项的生物传感器用于检测生物样品中的抗-HIV抗体的用途。
6.用于检测抗-HIV抗体的方法，其包括a.提取生物样品；b.将来自(a)中的生物样品与本发明的生物传感器接触；c.向(b)中的样品和生物传感器中加入变构酶的底物；d.记录步骤(C)中产生的电化学信号。
7.根据权利要求6的方法，其中所述变构酶的底物选自ONPG、CPRG、FDG或PAPG。
8.用于检测抗-HIV抗体的试剂盒，其包含本发明的生物传感器。
9.根据权利要求8的试剂盒，其还包含所述变构酶的底物。
10.根据权利要求9的试剂盒，其中所述底物选自ONPG、CPRG、FDG或PAPG。
全文摘要
本发明提供了生物传感器，其能够基于经遗传修饰的变构酶与具有微电极网络的基质的组合使用而检测生物样品中的抗-HIV抗体。该生物传感器的一个益处在于其高度灵敏性，检测简便性以及便携性。
文档编号G01N33/53GK102224253SQ200980142429
公开日2011年10月19日 申请日期2009年9月4日 优先权日2008年9月4日
发明者A·P·维拉弗德科拉莱斯, F·J·德尔坎波, F·X·穆诺斯帕斯库亚尔, N·费雷尔米拉莱斯, O·拉茨卡, R·M·费拉斯科洛米纳 申请人:巴塞罗纳奥托诺马大学, 康斯乔最高科学研究公司