专利名称：捕获粒子的制作方法
捕获粒子 对相关申请的交叉引用本申请要求2008年9月26日提交的题目为“用于对粒子进行聚集、引导和分类的微润方宠(Microvortex for focusing，guiding and sorting of particles)，，的美国专利申请61/100，420的优先权，将其全部内容并入本申请作为参考。
背景技术：
微流体装置(microfluidic device)可用于微量全分析系统(μ TAS)或实验室芯片(LOC)系统，这是因为这些装置能够对小样品体积进行分析且可被开发为低成本的高度平行的系统。具体地，这些系统可用于其中对粒子进行处理操作的生物和临床应用，所述处理操作为例如对粒子样品(例如细胞和胶体)进行浓缩、检测、分类和聚集。与使用外部能量例如光能、磁力、电力、介电电泳、声能等的有源操作(active manipulation)相比，通过诸如水力聚焦、尺寸过滤和沉降等技术对流动通过微流体装置的粒子进行无源操作(passive manipulation)是相对简单的。无源操作不依赖于外部能量来源而可利用装置中微通道的几何形状和通过这些通道的流动条件来进行。相反地，主动操作将使用外部能量来源且可能需要将供能组件整合到微流体装置中。
发明内容
本申请描述了涉及在具有凹槽的微流体装置中基于亲和性对粒子进行捕获的技术。当本申请提及凹槽时，本申请包括例如长的窄通道(例如通过延伸到较大通道的壁中而形成且由较大通道的壁所限定的通道)。在一个方面，用于捕获悬浮于流动通过微通道的流体中的粒子的方法包括使包含待捕获的粒子的流体流动通过微通道且经过由微通道的壁表面限定的凹槽；使至少一些所述粒子与设置在微通道的一个或多个壁上的吸附物(adherent)接触；和捕获至少一些与吸附物接触的粒子。在一个方面，微流体装置包括微通道，所述微通道包括入口，位置距所述入口一定距离的出口，其中流体由入口流向出口，和限定到微通道的壁表面中的凹槽，所述凹槽包括顶部(apex)和两个端部，每个端部与所述顶部相连，所述凹槽被定向成使流体朝向所述顶部而流动通过所述端部；和涂布于至少一个壁的用于选择性附着所需分析物的吸附物。实施方案可单独或以各种组合形式包括一个或多个以下特征。在一些实施方案中，所述吸附物被设置在凹槽被限定在其中的壁的表面上。在一些实施方案中，所述凹槽被限定在所述微通道的壁中。在一些情况下，所述凹槽延伸到所述壁中。在一些实施方案中，所述凹槽和多个其它凹槽被限定在所述壁的表面中，从而由于流体流动通过所述多个其它凹槽而在流体中形成相应的微涡旋(microvortices)。在一些实施方案中，使流体流动通过凹槽包括使流体流动通过包括顶部和两个端部的凹槽，每个端部与所述顶部相连，所述凹槽被定向成使流体朝向所述顶部而流动通过所述端部。在一些情况下，所述顶部和所述两个端部被限定在呈V形的表面中。所述凹槽的尺寸可以是3 μ m至70 μ m。 在一些实施方案中，使流体流动包括使流体以2. 4cm/min至6. Ocm/min的平均流
速流动。在一些实施方案中，所述粒子为癌细胞且所述吸附物为用于与所述癌细胞结合的抗体。在一些情况下，方法还包括对所捕获的癌细胞进行培养。在一些实施方案中，由于流体流动通过凹槽而在流体中形成微涡旋。在一些实施方案中，所述吸附物是抗体。在一些实施方案中，所述吸附物为适体(aptamer)。在一些实施方案中，所述入口被配置为接收包含分析物的流体。在一些实施方案中，所述顶部和所述两个端部形成V形。在一些实施方案中，所述凹槽的跨度小于所述微通道的宽度。在一些实施方案中，所述两个端部各自与所述顶部等距离。在一些实施方案中，使所述凹槽对称地形成在所述壁的表面中，从而使所述顶部位于通过微通道中心的轴线上且所述两个端部被设置成与所述顶部等距离。在一些实施方案中，所述两个端部中的一个被设置成比所述两个端部中的另一个距所述顶部近。在一些实施方案中，所述顶部偏离沿微通道中心延伸的轴线。在一些实施方案中，所述凹槽被设置成使所述凹槽的一个端部在另一个端部前接收流体。在一些实施方案中，所述凹槽为限定在所述微通道的壁中的多个凹槽中的一个， 所述多个凹槽中的每个具有顶部和两个端部。在一些实施方案中，所述多个凹槽被设置成凹槽列。在一些实施方案中，所述装置还包括形成在所述凹槽列附近的其它凹槽列。在一些实施方案中，所述凹槽列中的凹槽的顶部和两个端部在相应的平面上与所述其它凹槽列中的凹槽的顶部和两个端部对齐，所述相应的平面垂直于通过所述微通道的轴线。在一些实施方案中，所述其它凹槽列偏离所述凹槽列。在一些实施方案中，凹槽由微通道向外突出的尺寸为3μπι至70μπι。可具体实施本申请描述的主题以实现一个或多个以下优点。本申请描述的技术可提高无源操作的潜力和促进在微流体环境中捕获悬浮于流体中的粒子例如悬浮于缓冲液中的细胞。形成在微流体装置的微通道中的凹槽可引起螺旋形流动，所述螺旋形流动在流动通过通道的流体中形成微涡旋。所述微涡旋可用于增加轴向流动通过通道的粒子朝向通道壁的横向移动，这使粒子更频繁地与壁相互作用和与壁结合。与包含不具有凹槽的微通道的微流体装置相比，当悬浮于缓冲液中的细胞流动通过具有凹槽的微通道时，细胞-基板相互作用可得以增加。这接下来可提高装置的捕获效率。另外，本申请描述的无源微流体流体操作技术可取消对外部能量来源的需要，因此可降低能量消耗和制造成本，特别是当将微流体装置放大到高度平行的μ TAS或LOC系统或这两者时。所述装置可以是透明的， 这取决于对制造材料的选择。样品和试剂的消耗体积由于所述体积所流动通过的尺寸是微米级的而可得以减小。因此，也可降低样品和试剂的成本。所描述的技术适用于捕获和培养活细胞。实施本申请一个或多个技术方案的细节请参见附图和以下描述。本申请其它特征、方面和优点基于说明书、附图和权利要求书而将变得显而易见。
图1示出了具有凹槽的微流体装置的实施方案。图2A-2D示出了在具有平坦的壁的微通道中和在具有形成在壁中的凹槽的另一种微通道中的粒子流动路径。图3A-3C示出了示例性凹槽。图4A-4C示出了形成图1的微流体装置的示例性方法。图5示出了实施例微流体装置在不同流速时的捕获效率。图6示出了对掺杂在全血中的癌细胞的捕获效率。图7示出了高通量微流体装置的实施方案，其具有的列为箭尾形(herringbone) 图案。图8示出了对所捕获的细胞进行培养的微流体装置的实施方案。图9A-9C为显微照片，其示出了所捕获的细胞在玻璃基板上的生长。图10示出了对用具有凹槽的微流体装置捕获的细胞上的EpCAM表达和对照细胞上的EpCAM表达进行的分析。图11A-11E示出了使用微流体装置从前列腺癌患者中捕获的循环肿瘤细胞。图12示出了健康供体对照。图13示出了使用具有凹槽的微流体装置从患者样品中捕获的CTC。图14A-14D示出了对具有凹槽的微流体装置中的CTC进行的Wright-Giemsa染色。图15示出了对具有不同凹槽尺寸的两种微流体装置进行的比较。各幅附图中相同的标号和标记表示相同的元件。
具体实施例方式本申请描述了在具有凹槽的微流体装置中基于亲和性对粒子进行捕获的方法、装置和系统。可对形成在微流体装置中的微通道进行处理以捕获悬浮于流动通过通道的流体中的粒子。可将所述微流体装置的粒子捕获效率定义为在通道中捕获的粒子数目与流动通过通道的粒子总数的比例。如下所述，使凹槽形成为延伸到微通道的壁中以在流体中形成这样的流动模式，所述流动模式促进悬浮于流体中的粒子和通道壁的内表面之间的相互作用。所增加的相互作用可增加通道中捕获的粒子数目，因此尤其提高微流体装置的粒子捕获效率。所述效率可通过调整微流体装置的结构特征(包括例如装置基板(substrate) 材料、通道和凹槽尺寸等)来进一步提高及基于粒子类型和粒子悬浮于其中的流体类型通过调整流体流动参数例如流速来进一步提高。图1示出了使用软平板印刷技术(soft lithography techniques)制造的所述微流体装置的实施例。如下所述，粒子在微流体装置的微通道中如下捕获在微通道的壁中形成凹槽，在微通道壁的内表面上涂布吸附物，和使悬浮于流体中的粒子流动通过微通道。
图1示出了具有凹槽135和140的微流体装置100，所述凹槽135和140延伸到限定装置100的通道115的壁之一中。在一些实施方案中，微流体装置包括由壁向外延伸的突起物(例如V形突起物)而非延伸到通道115的壁中的凹槽。在一些实施方案中，微流体装置100可包括与下基板110结合的上基板105，所述上基板105和下基板110各自可使用合适的材料来制造。例如，上基板105可使用弹性体例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)来制造且下基板可使用玻璃、PDMS或其它弹性体来制造。可选择地或另外，所述基板可使用塑料例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、环烯烃共聚物(COC)等来制造。通常，就制造上基板和下基板所选择的材料可易于加工(例如易于蚀刻)，可提供有助于使检测容易的光学性质(例如可以是光学透明的)，和可以是无毒的，从而不会负面地影响细胞与基板的附着。另外，所述材料优选不显示自发荧光或显示有限的自发荧光。另外，所述材料可易于官能化，从而使分析物可附着于基板。另外，所述材料可具有机械强度以使微流体装置100 具有强度。如下所述，可将上基板105牢固地固定于下基板110，其中在它们之间形成微通道。 在一些实施方案中，微通道115可具有矩形截面，其包括形成在上基板105中的两个侧壁120和125及上壁130。有关相对位置的术语例如“上”和“下”用于方便说明且表示图中的位置而非所述特征的必要相对位置。例如，可将所述装置定向成使凹槽在通道的底表面上或使通道的中心轴线在垂直方向上延伸。可选择地，微通道115的截面可以是几种形状之一，所述形状包括但不限于三角形、梯形、半月形等。下基板110在与上基板105结合后可形成微通道115的下壁。在一些实施方案中，微通道115包括形成在微通道115的上壁130中的多个凹槽135。可选择地，凹槽135可形成在任何壁中，和/或可形成在微通道115的多于一个壁中。凹槽135可跨越壁的整个长度，或仅跨越壁的一部分。图2A-2D示出了粒子悬浮液流动通过具有平坦的壁的微通道和具有形成在壁中的凹槽的另一种微通道。图2A示出了微流体装置200，其包括具有矩形截面的微通道205。 微通道205的壁不包括凹槽例如就微流体装置100所述的那些凹槽，即壁的表面是平坦的。 包含悬浮于流体中的粒子225的粒子悬浮液220流动通过微通道205。相反地，图2B示出了类似的悬浮液流动通过微流体装置100。当流体流动通过由于将凹槽135在微通道115中排列成列而形成的箭尾形图案时，流体路径中的凹槽135扰乱了流体流动。在一些实施方案中，基于流速和凹槽尺寸(尤其是例如凹槽的大小和凹槽两臂之间的角度)，由于对流体流动的扰乱而在流体中形成微涡旋。微涡旋的成因是凹槽在横向于流体流动主要方向(即轴向)的方向上引起流体流动。 在一些实施方案中，虽然没有形成微涡旋，但凹槽135和140引起足够的扰乱以改变部分流体的流动路径，从而增加壁_粒子相互作用。如图2C所示，当不存在凹槽时，悬浮于流体中的粒子225以基本直线的方式流动通过平坦的微通道205，其中仅在流场边缘附近(例如与微通道205的壁直接相邻)的那些粒子225才可能与微通道205的壁相互作用。相反地，如图2D所示，流动通过箭尾形图案的粒子225的流动路径可被流体中的微涡旋所扰乱，这增加了粒子-微通道壁相互作用的次数。所述微涡旋受形成在微流体装置100的上壁130中的每个凹槽445的结构特征所影响。图3示出了凹槽445的示例性尺寸。
图3A和3B示出了形成在微通道115的上壁130上的凹槽135。如图3A所示，对称的凹槽135包括两个臂，所述臂各自跨越第一端部150和顶部145之间的长度(I1)和跨越第二端部155和顶部145之间的长度(I2)。在所示实施方案中，两个臂之间的角度α为 90°。在一些实施方案中，两个臂之间的角度α为10°至170°。图3Β示出了微通道115， 其包括形成在上表面115中的凹槽135。如图3Β所示，凹槽的宽度为w，微通道115的侧壁 120和125的高度为h。，和形成在上壁115上的凹槽135的高度为hg。在一些实施方案中， I1 和 I2 各自为 250ym-400ym，hg* 3μπι至 70μπι，和 h。为 100 μ m。例如，当 h。为 IOOym 时，hg 为 25 μ m0图3C示出了不对称的凹槽140，其包括两个臂，所述臂各自分别跨越第一端部170 和顶部165之间的长度(I3)和跨越第二端部175和所述顶部之间的长度(I4)。在所示实施方案中，两个臂之间的角度β为90°且可以是10°至170°。在一些实施方案中，可将凹槽140制造成使I3与I4的比例为0.5。例如，13为Hlym且I4为282μπι。凹槽140的厚度为35μπι。图15示出了凹槽的高度即hg对粒子捕获的影响。箭尾形图案可如下形成形成箭尾形的列，其中将每个凹槽 设置成与另一个凹槽相邻。另外，列中的所有凹槽可朝向相同方向。在一些实施方案中，各个凹槽之间的距离为 50 μ m。可选择地，凹槽可按彼此之间的任何距离来设置。列可包括任何数目的凹槽，例如 10个凹槽。箭尾形图案可进一步包括由入口到出口依次形成的多个凹槽列。在一些实施方案中，两个相邻的凹槽列可间隔100 μ m。换言之，可将第二列中的第一个凹槽设置成距第一列中的最后一个凹槽100 μ m。该图案可在微通道115的入口和出口之间重复。在一些实施方案中，列中的凹槽或凹槽组可在横向上彼此偏离。例如，如图2B所示，微流体装置100中的凹槽列包括顶部设置在通道中心线右边(朝向下游)的第一组凹槽和顶部设置在通道中心线左边的第二组凹槽。相信上述偏离可进一步增加壁-粒子相互作用。图3A-3C示出的尺寸是示例性的。通常，对凹槽高度的选择可取决于多种因素，这些因素包括通道尺寸、粒子性质(包括大小、密度等)和粒子悬浮液流速。虽然较深的凹槽提供较大的扰乱，但其它因素可限制凹槽高度。例如，至多达到一定程度的限制，凹槽高度可随通道高度成比例增加。通道高度及相应的凹槽高度可取决于粒子_微通道115表面接触面积。通道尺寸的增加可使粒子-微通道115相互作用减少，这是因为可用于粒子进行相互作用的表面接触面积相对于截面流动面积是降低的。另外，可设置通道高度的下限及相应的凹槽高度的下限以防止阻塞。在一些实施方案中，凹槽高度与通道高度的比例可小于1，例如为0. 1至0. 6。在一些实施方案中，所述比例可等于1(例如凹槽高度可等于通道高度)，或可大于1(例如凹槽高度(例如60 μ m)可大于通道高度(例如50 μ m))。另外， 凹槽的形状可不同于“V”形，例如为“U”形、“L”形等。微通道115可例如使用软平板印刷技术来形成在上基板105中。在一些实施方案中，可使负性光刻胶(SU-8，MicroChem, Newton, MA, USA)在硅晶片上以光刻方式形成图案以得到具有两层特征的母版。由此形成的母版可包括SU-8特征，所述SU-8特征形成针对微通道115的特征例如通道截面、通道尺寸等的基础。母版上SU-8特征的高度 (3 μ m-100 μ m)可用表面面形测定器(surface profilometer)[例如 Dektak ST System Profilometer(Veeco Instrumentslnc. , Plainview NY)]测量。然后，所述母版可用作模具，可将PDMS预聚物倾到在所述模具上且使PDMS预聚物在65°C的常规烘箱中固化24小时。当所倾到的PDMS预聚物固化时，形成包括微通道115的上基板105。可从模具中取出固化的上基板110，且例如通过氧等离子体处理来与下基板105结合以形成微流体装置 100。可选择地，可使用其它类型的结合，例如使用双面密封剂、在压力下进行物理夹紧和保持等。在一些实施方案中，基板可通过化学键而牢固地结合在一起，然后可通过在施加机械力下使所述键断裂而分开。图4A-4C示出了微流体装置100的形成，所述微流体装置100包括使用PDMS制造的上基板405和使用玻璃制造的下基板410。包括微通道415的上壁和侧壁的上基板405 可使用先前描述的技术来形成。可选择地或另外，上壁可包括多个凹槽440，每个所述凹槽形成为不对称的“V”形。在一些实施方案中，对称的凹槽440和不对称的凹槽445可散布在箭尾形图案中。每个凹槽进一步包括顶部445和两个端部450和455。另外，微通道415 包括两个侧壁420和425。为了构建用于捕获所需生物分析物的微流体装置400，将吸附物460设置在微通道115的内表面上。具体地，对内表面进行表面修饰。在一些实施方案中，如图4B所示，可将吸附物460混合在溶液中且流动通过微通道415。当所述溶液流动通过微通道415时，吸附物460与通道415的内表面结合且由此设置在通道415的内表面中。除使吸附物流动通过微通道115外，还可使用其它技术来设置吸附物。例如，在使用塑料基板的实施方案中，吸附物可在使上基板和下基板结合前例如如下设置在基板上 进行紫外(UV)照射处理以改变表面性质，从而使分析物与发生改变的表面结合。在下基板为玻璃的实施方案中，玻璃可在使玻璃基板与上基板结合前例如通过溅射、气相沉积、堆积纳米粒子单层等来进行官能化。
如图4C所示，可将吸附物460设置在微通道415的全部内表面上。可选择地，可将吸附物460设置在微通道415的一个或多个壁中，例如设置在凹槽445形成在其中的壁中。在一些实施方案中，可将吸附物460仅设置在由玻璃制造的下基板410上。在上述实施方案中，可在将吸附物设置在下基板上后使下基板410与上基板405结合。在上述实施方案中，对流体的流速进行选择，从而使因凹槽410而形成的微涡旋朝向下基板410驱动流体中的细胞，这增加了细胞_下基板410相互作用的次数。然后，可使下基板410与上基板 405分开且可对所捕获的细胞进行培养。在一些实施方案中，可对吸附物460进行选择，从而使微通道415可用于通过湿化学技术(wet chemistry techniques)基于亲和性对细胞进行捕获。在上述实施方案中，吸附物460可以是抗体(例如针对EpCAM的抗体)或适体(例如针对表面蛋白的适体)，微通道415的内表面用所述抗体或适体进行官能化。吸附物460的其它实例包括用抗生物素蛋白涂布的表面以通过生物素-抗生物素蛋白连接来捕获扩增的表达生物素的靶标细胞。与可被捕获的细胞相应的吸附物的其它实例示于下表1中。
表 权利要求
1.用于捕获悬浮于流动通过微通道的流体中的粒子的方法，所述方法包括 使包含待捕获的粒子的流体流动通过微通道且经过由微通道的壁表面限定的凹槽； 使至少一些所述粒子与设置在微通道的一个或多个壁上的吸附物接触；知捕获至少一些与吸附物接触的粒子。
2.权利要求1的方法，其中所述吸附物被设置在凹槽被限定在其中的壁的表面上。
3.权利要求1的方法，其中所述凹槽被限定在所述微通道的壁中。
4.权利要求3的方法，其中所述凹槽延伸到所述壁中。
5.权利要求1的方法，其中所述凹槽和多个其它凹槽被限定在所述壁的表面中，从而由于流体流动通过所述多个其它凹槽而在流体中形成相应的微涡旋。
6.权利要求1的方法，其中使流体流动通过凹槽包括使流体流动通过包括顶部和两个端部的凹槽，每个端部与所述顶部相连，所述凹槽被定向成使流体朝向所述顶部而流动通过所述端部。
7.权利要求6的方法，其中所述顶部和所述两个端部被限定在呈V形的表面中。
8.权利要求7的方法，其中所述凹槽的尺寸为3μπι至70μπι。
9.权利要求1的方法，其中使流体流动包括使流体以2.4cm/min至6. Ocm/min的平均流速流动。
10.权利要求1的方法，其中所述粒子为癌细胞且所述吸附物为用于与所述癌细胞结合的抗体。
11.权利要求10的方法，所述方法还包括对所捕获的癌细胞进行培养。
12.权利要求1的方法，其中由于流体流动通过凹槽而在流体中形成微涡旋。
13.一种微流体装置，其包括 微通道，所述微通道包括 入口，位置距所述入口一定距离的出口，其中流体由入口流向出口，和限定到微通道的壁表面中的凹槽，所述凹槽包括顶部和两个端部，每个端部与所述顶部相连，所述凹槽被定向成使流体朝向所述顶部而流动通过所述端部；和涂布于至少一个壁的用于选择性附着所需分析物的吸附物。
14.权利要求13的装置，其中限定在壁表面中的凹槽由微通道向外突出。
15.权利要求13的装置，其中所述吸附物为抗体。
16.权利要求13的装置，其中所述吸附物为适体。
17.权利要求13的装置，其中所述入口被配置为接收包含分析物的流体。
18.权利要求13的装置，其中所述顶部和所述两个端部形成V形。
19.权利要求13的装置，其中所述凹槽的跨度小于所述微通道的宽度。
20.权利要求13的装置，其中所述两个端部各自与所述顶部等距离。
21.权利要求13的装置，其中使所述凹槽对称地形成在所述壁的表面中，从而使所述顶部位于通过微通道中心的轴线上且所述两个端部被设置成与所述顶部等距离。
22.权利要求13的装置，其中所述两个端部中的一个被设置成比所述两个端部中的另一个距所述顶部近。
23.权利要求13的装置，其中所述顶部偏离沿微通道中心延伸的轴线。
24.权利要求13的装置，其中所述凹槽被设置成使所述凹槽的一个端部在另一个端部前接收流体。
25.权利要求13的装置，其中所述凹槽为限定在所述微通道的壁中的多个凹槽中的一个，所述多个凹槽中的每个具有顶部和两个端部。
26.权利要求25的装置，其中所述多个凹槽被设置成凹槽列。
27.权利要求26的装置，所述装置还包括形成在所述凹槽列附近的其它凹槽列。
28.权利要求27的装置，其中所述凹槽列中的凹槽的顶部和两个端部在相应的平面上与所述其它凹槽列中的凹槽的顶部和两个端部对齐，所述相应的平面垂直于通过所述微通道的轴线。
29.权利要求27的装置，其中所述其它凹槽列偏离所述凹槽列。
30.权利要求13的装置，其中凹槽由微通道向外突出的尺寸为3μ m至70 μ m。
全文摘要
用于捕获悬浮于流动通过微通道的流体中的粒子的方法和系统可包括使包含待捕获的粒子的流体流动通过微通道且经过由微通道的壁表面限定的凹槽，从而由于流体流动通过凹槽而在流体中形成微涡旋；在流体中形成微涡旋后，使至少一些所述粒子与设置在微通道的一个或多个壁上的吸附物接触；和捕获至少一些与吸附物接触的粒子。
文档编号G01N33/53GK102227637SQ200980147313
公开日2011年10月26日 申请日期2009年9月25日 优先权日2008年9月26日
发明者梅梅特.托纳, 许佳贤, 香农.斯托特 申请人:通用医疗公司