专利名称：生物相容和可光固化的聚合物的制作方法
技术领域：
本发明总的涉及用于进行生物测定的固体基体，更具体地涉及测定珠(微珠)及其用于进行多重生物测定的方法。本发明具体涉及采用微体积样品的多重生物测定，例如蛋白质和核酸分析。本发明还涉及可光固化的环氧组合物例如那些包含EPON SU-8环氧树月旨(Hexion Specialty Chemicals)、EP0N1002F 环氧树脂(Hexion Specialty Chemicals) 以及其它双官能或多官能环氧树脂的环氧组合物。优选的根据本发明显示明显较好性能的可光固化的组合物进一步包括含羧基单体，例如丙烯酸、2-羧基乙基丙烯酸、4-乙烯基苯甲酸、3-丙烯酰氨基-3-甲基-1-丁酸、或者甲基丙烯酸缩水甘油酯，等等。所述可光固化的组合物可用于流延薄膜或者制造珠、磁珠或者含镍条形码的磁珠。所得的各种薄膜、珠、 磁珠或者含镍条形码的磁珠可用于广泛的临床或者生物应用中。
背景技术：
由于目前的基因组学和蛋白质组学研究产生大量数据，因而需要能以极小体积的样品迅速筛选大量核酸和蛋白质的技术。微点阵、DNA芯片和蛋白质芯片已经引起浓厚的商业兴趣。这些测定通常通过下面方法在平面的生物芯片平台上进行在χ-y方向经由机械印制将而将固体支持物上的DNA排列和固定化于显微镜载玻片上，通过压电喷墨或者通过在芯片上直接合成DNA。然而，机械接触印制不是很适宜的，因为其每接触一次印制一个点，这导致点与点或者批次与批次之间的相对大的印制变异、不一致的点形态、错印和载玻片表面变形，所有这些对于DNA微点阵分析都是不适宜的。此外，将小体积的液体样品分配在相对大的芯片表面常常遭遇样品量不足或者在芯片表面上分配不均的问题。这些问题可导致反应不完全或者反应时间极长。微珠技术潜在地克服了微分析技术的多个问题并提供了对各探针更好的质量控制，在分析中组装各种类型和数量的探针的灵活性，以及无需机械印制进行分析的便利性。 现有的微珠方法包括(1)将可光谱辨识的荧光团、荧光半导体量子点引入球形珠或颗粒， 以及( 将条形编码的彩色(吸收)条纹或者黑色和白色条带引入金属棒。荧光和条形码带珠均通过反射或发射构型的光学检测来鉴别。反射构型的问题是(1)难以在适当的位置设置采集光学，尤其是当珠大小为微米尺寸时更是如此，以及( 光采集效率差和条形码对比度低，尤其是当微珠在微流动系统中时更是如此。流动散射光，这干扰光反射或发射检测。而且，荧光珠、光谱范围以及可光谱辨识的标签的可能数目常常限制代码变异的潜在数目。常常需要许多激光源来激发不同的荧光标签。此外，编码记号的有效性另需要严重关注，因为引入的编码元件有时会丢失，光褪色，或者光谱干扰分析信号。在多金属(Au、Pt、 Nijg等)彩色微棒的情形中，编码方案遭遇到制造困难，并且基于不同金属材料的色彩数目是有限的。许多ID或2D条形码通过其特异的图像图案得到识别。光学成像法用于识别这些条形码图案。尽管高速相机可用于捕捉条形码图像，但是图案识别是个缓慢费时的过程。常常需要特别的软件来逐区地分析图像。因此，短时间内鉴别成百上千的珠以改善流通量是困难的。下面的专利文件披露了一些显示某些上述缺陷的系统。2004年8月10日颁布的美国专利6，773，886 (其全部内容并入本文作为参考)披露了一种条形码形式，其包括30-300nm直径乘400-4000nm的多层多金属棒。这些棒通过电沉积至氧化铝模具中来建造；而后除去氧化铝剩下这些小的多层物体。该系统可具有以至多7种不同金属编码的至多12个区，其中所述金属具有不同的反射率因此依据金属类型在光学显微镜中呈现较亮或较暗，而测定读数依靠来自目标物的荧光，探针的鉴别根据条形码的亮暗图案。2003年10月7日颁布的美国专利6，630，307(其全部内容并入本文作为参考)披露了半导体纳米晶体用作条形码，其中各半导体纳米晶体产生独特的发射谱。这些特征发射如果在可见光光谱区内可作为颜色观察到，或者可解码以提供关于特定波长的信息，在所述波长处观察到离散的跃迁。2004年5月11日颁布的美国专利6，734，420 (其全部内容并入本文作为参考)披露了鉴定系统，其包括多个与标签相关的可鉴别元件和分析器，所述标签包括用于响应激发能量而产生波长/强度谱的标记，所述分析器用于根据相关标签的波长/强度谱鉴别出元件。2002年2月沈日颁布的美国专利6，350，620公开了一种产生微载体的方法，使用载体的形状、尺寸和颜色作为图像条形码用于鉴定。该专利公开了一种包括条形码的鉴定系统，条形码通过光刻法形成在基体上，然后使用镍板将条形码热压至珠的表面上以形成微饼样颗粒。条形码图案可通过图像识别系统分类。美国公开US2005/0003556 Al (其全部内容并入本文作为参考)公开了一种使用光学图形学的鉴定系统，所述光学图形学例如条形码或者点矩阵条形码和基于彩色信息信号的彩色信号用于产生亲和反应探针珠。彩色图案以光学反射模式进行解码。美国公开US2005/0M4955(其全部内容并入本文作为参考)披露了一种微托盘， 其包括设计用于单个粘附细胞平板培养的小的平坦表面，细胞平板培养区设计成保护细胞，并成型设计为允许或者改善流通操作。微托盘优选以易于鉴别的方式图案化，并使其尺寸适于单个细胞(与它在尺寸上相容)。需要的是这样的数字编码微珠，其提供高的对比度和高的信噪比检测，并且允许要求较小体积的流体和快速测定的平行和高通量生物分析，例如以下的生物分析蛋白质、 病原体、基因表达、单核苷酸多态性、基于核酸的组织分型、细胞或染色体整理，以及转录
■i並曰O条形码微珠或者微球通常通过光刻法制造。成千上万的微珠或者微图案可在微玻片、玻璃或者硅片上合成。适于制造微珠的材料包括光敏性光聚合物或者所谓的光刻胶，例如EPON 1002F或SU-8牌环氧树脂。起始材料可以是单体或者聚合物，并在UV或者光子暴露之后得到交联聚合物。尽管光聚合物普遍用于半导体工业中，但是许多半导体工业光聚合物不是生物相容的，因为在这些材料的表面上难以固定化生物分子例如蛋白质、寡核苷酸或者细胞，若存储要求长期稳定性的话更是如此。当前的光致抗蚀剂的其它有关问题包括高的自荧光、脆性和针对形成多层而言差的粘附性。更重要的是，因为微珠悬浮于反应溶液中，所以期望所有的表面都是生物反应性的。因此，整个微珠应具有相同的表面化学性质，不同于单面表面例如玻璃上的膜。EPON SU-8环氧树脂(Hexion Specialty Chemicals)是感光性树脂，其已经在微电子机械系统(MEMS)中用于制造高纵横比结构。将包含SU-8树脂、光致产酸剂(photo acid generator)例如三苯基锍六氟锑酸盐、和溶剂例如Y - 丁内酯或者环戊酮的溶液涂覆至各种基体上，预烘焙以蒸发溶剂，根据溶液的固体含量使得固体感光性膜达几百微米厚。通过将膜经遮光模暴露于UV辐射，将图案转至光致抗蚀剂。通过随后浸入显影剂溶液来形成遮光模的高分辨三维负图像。由于SU-8的表面具有环氧基团，因而其具有疏水性质并对许多要求特定官能团的生物应用给予限制。这些限制包括在表面润湿、生物污垢和有限的生物附着中的挑战。仍然需要改善上述环氧树脂的生物相容性。
发明内容
本发明涉及用于生物测定的用含羧基官能性单体改性的基于环氧化物的基体。所述基体可以是单独的膜或者粘附于其它固体表面、微珠、微珠上的涂层的膜等，其尤其适用于呈现生物分子例如多核苷酸、多肽和其它生物物质如细胞、脂质、多糖等。本申请所用的 “多肽”包括蛋白质、寡肽和较短的肽列，而“多核苷酸”包括单链和双链DNA和RNA链以及较短的寡核苷酸列。用于本发明用途的官能性单体包括例如丙烯酸或者甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA) 那些，将其引入基于环氧化物的感光性配制物中。所得的聚合物表面包含环氧或者羧基官能团，这可容易地与寡核苷酸末端的氨基共价反应。优选的环氧树脂包括-.2,2-二 (对-缩水甘油基氧基苯基)丙烷与2，2-二(对-羟基苯基)丙烷的缩合产物及其类似异构体(也称为4，4，-(1-甲基乙叉)双酚与2，2，-[(1-甲基乙叉)双G，l-亚苯基氧基亚甲基)] 二(环氧乙烷)的聚合物)，其可以以EPON 1002F获得；或者双酚-A线性酚醛清漆的多官能的缩水甘油基醚衍生物(平均具有约8个的环氧基官能团)，其可以以EPON SU-8(包含或不包含苯氧基树脂，例如hChemRez PKHB-100、PKHH、PKCP-80)获得。在本发明的又一方面，由感光性配制物(例如包含EPON 1002F环氧树脂的那些) 制得的膜、珠、磁珠、含镍条形码的磁珠等用包含官能性单体例如丙烯酸或者甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)的涂布溶液进行后处理，用UV光辐照或者通过化学接枝或者交联反应进行改性。对所得改性的膜、珠、磁珠和含镍条形码的磁珠在临床或者生物应用中的性能进行评价。在本发明的又一方面，EPON 1002F环氧树脂的低吸收或荧光背景和在感光性配制物中混入官能性单体的加工便利性的组合是尤其值得强调的。在本发明的又一方面，聚氧亚烷基胺(例如Jeffamine 或者改性Jeffamine (Huntsman Corp.)可与含环氧基的EPON SU-8或者EPON 1002F的化学偶联，因此，羧基或者氨基可在光刻后工艺之后合成。 在本发明的又一方面，微珠由感光性配制物制得，所述感光性配制物包括至少一种具有低的吸收或荧光背景的环氧树脂和至少一种光致产酸剂的混合物，其具有或不具有在至少一种适当溶剂中的官能性单体或树脂、填料、微米或纳米颗粒、添加剂、润湿剂或表面活性剂。适当的环氧树脂包括那些具有低的吸收或荧光背景的环氧树脂，并包括选自下组的那些:EP0N1001F、102F、1004F、1007F、1009F、2002 和 2005，其中特别优选 1002F。
优选用于本发明的光致产酸剂是三芳基锍六氟锑酸盐。优选用于本发明的溶剂是环戊酮或者Y - 丁内酯。各种含羧基单体可用于本发明，其中优选的单体选自下组丙烯酸或者丙烯酸 2-羧基乙酯、3-丙烯酰氨基-3-甲基-1- 丁酸和4-乙烯基苯甲酸。作为本发明的又一方面，可发生于未改性环氧聚合物的表面润湿、生物污垢和有限的细胞附着中的许多问题可通过表面涂覆、等离子体处理、接枝聚合和化学改性得到减轻。尤其有用的是聚乙二醇(PEG)与环氧树脂例如SU-8的表面的共价连接以增大其生物相容性和无污垢性质。其它官能性单体可用于本发明实践，包括含磺酸单体例如2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸、4-乙烯基苯磺酸等。其它适用于本发明的官能性单体包括含环氧基或者硫杂环丙烷的单体，例如甲基丙烯酸缩水甘油酯、4-缩水甘油基氧基苯乙烯等。根据本发明，将感光性配制物流延至适当的支持物例如聚酯膜、玻璃、有机硅片上，然后通过本领域已知的方法制成薄膜、珠、磁珠或者含镍条形码的磁珠。所得的薄膜、珠、磁珠或者含镍条形码的磁珠可通过本领域已知的方法用包含官能性单体或者聚合物树脂的涂布溶液进行后处理，所述方法包括高能辐射接枝或者交联 (例如UV、电子束、X射线)、化学接枝和热固化。其它适用于本发明的官能性单体包括包含羟基、环氧基、硫杂环丙烷、羧基、磺酸、 单烷基胺或二烷基胺、季铵基团、或者这些官能团的任意组合的那些官能性单体。官能性聚合物树脂也可以是聚胺例如聚乙烯亚胺或者聚氧亚烷基胺(如 Jeffamine 牌聚胺)，或者双官能或多官能环氧化合物或树脂，或者这两种类型官能度的组合。所述官能性聚合物树脂可同时包含羧基或磺酸官能团以及氨基或铵官能团。官能性聚合物树脂可以是用氨基和羧基基团封端的聚乙二醇。官能性聚合物树脂可以是用酸酐例如琥珀酸酐改性的聚氧亚烷基胺。涂布溶液可包含多糖例如葡聚糖、羧基甲基纤维素、壳聚糖等。官能性聚合物可同时包括螯合基团(例如亚氨基二乙酸)以及环氧或者氨基官能团。通过下面方法将聚(丙烯酸)接枝到SU-8环氧树脂表面上将单体溶液例如丙烯酸置于完全固化的SU-8环氧表面的表面上，然后暴露于UV下以引起在SU-8环氧表面上形成聚(丙烯酸)层。丙烯酸在SU-8环氧表面上的接枝通过FI1R、染料吸光度和荧光测量得到确认。
SU-8环氧树脂的脆性、非特异性的生物分子吸附、可见光波长区的高荧光性以及差的细胞附着限制了其在生物分析装置中的应用。由EP0N1002F感光性环氧树脂(ΕΡ0Ν 1002F环氧树脂与三芳基锍六氟锑酸盐混合)形成的结构的荧光10倍低于类似的SU-8环氧树脂微结构的荧光。EP0N1002F环氧树脂在可见光波长区的吸收也显著低于SU-8环氧。根据本发明的另一方面，官能性单体例如丙烯酸或者甲基丙烯酸缩水甘油酯 (GMA)可加入到包含EPON 1002F或SU-8光聚合物的感光性配制物中。针对生物分子固定化，所得的含官能团的基体的性能向膜、珠、磁珠、含镍条形码的磁珠等提供改善的稳定性。根据本发明的另一方面，由包含EPON 1002F的感光性配制物制备的基体用包含官能性单体例如丙烯酸或者甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)的涂布溶液进行后处理，用UV光辐照，或者通过化学接枝或者交联反应进行改性。所得的基体提供具有改善的临床和生物应用性能的改性薄膜、珠、磁珠或者含镍条形码的磁珠等。本发明微珠可以进行数字编码，如提供高的对比度和高的信噪比光学检测以促进珠的鉴别的图像所表示。该图像通过具有这样图案的物理结构实现，所述图案部分地是对光基本上穿透的(例如透明的、半透明的、和/或透光的)和部分地是对光基本上不透明的 (例如反射光的和/或吸收光的)。透射光的图案得到确定(例如，通过扫描或者成像)，因而可译出在编码珠上的图像所表示的代码。在一种实施方案中，编码珠包括具有一系列交替的透光和不透光部分的主体，其中相对的位置、宽度和间距比拟ID或2D条形码图像(例如，一系列代表“0”代码的窄缝 (例如5微米宽)和代表“1”代码的宽缝(例如10微米宽)，或者反之)。为了译出图像， 对主体的交替透光和不透明部分进行光扫描(以类似于条形码扫描过程的方式)或者成像 (例如用CCD传感器)，从而确定由透射光所确定的图像所表示的代码。在另一种实施方案中，编码珠包括具有一系列交替的透光和不透光部分的主体， 其中相对的宽度条形编码图像(例如，一系列代表“0”代码的窄缝和代表“1”代码的宽缝， 或者反之)。当该珠用光束照射时，基于透射峰的“总强度”或者来自隙缝的透射峰的“带宽”，可通过线扫描相机、帧取样器和数字信号处理器可确定数字条形码是0还是1。在另一种实施方案中，具有一系列窄带和宽带的条形码图案提供清楚的信号和0 和1的区分。隙缝在托盘(pallet)上的位置将决定哪个比特(bit)是最低有效比特(LSB) 和最高有效比特(MSB)。LSB将置于更靠近托盘的边缘以使其区别于位于另一较远端的 MSB。在另一种实施方案中，向编码珠提供反射性薄膜(例如，向编码珠镀或者涂覆金属薄膜，或者提供金属薄膜的中间层)以提高用于解码的图像识别的对比度和光学效率。一种可供选择的实施方案可通过适当地更改上述方法而包括金属层作为夹于两个聚合物层之间的层。在该实施方案中，对于珠的两个暴露平面表面可使得其表面状况相同，以提供类似的表面涂覆和固定化条件。另一实施方案是用聚合物或者官能性分子例如羧化生物素或者抗生蛋白链菌素涂覆珠；因此，整个珠具有相同的分子固定化状态。在另一种实施方案中，可配置编码珠的主体以使其具有至少两个在相对几何和/ 或大小上不同的正交横截面。进一步，所述横截面的几何形状可以是对称或不对称的，和/ 或规则或不规则形状。在一种实施方案中，所述编码珠的最长正交轴小于1mm。在本发明的另一方面，微流体装置包括微流通道，所述微流通道依尺寸制造并进行配置以引导编码珠每次通过解码时前进一个编码珠。解码区包括代码检测器(光扫描仪、CXD传感器，等等)，其检测透过各编码珠的透射光的图案用于译出其上的图像所表示的代码。微流体装置的流通通道具有内部横截面，该内部横截面的几何形状依尺寸制造并成型，以在编码珠的特定横截面对准微流通道的横截面时接收和允许编码珠通过，由此针对解码区呈现呈特定取向的编码珠。在一种实施方案中，流通通道的内部横截面的几何形状依尺寸制造并成型，以在编码珠的最小横截面对准微流通道(例如，编码珠的长轴对准流通通道的轴)时接收和允许编码珠通过。微流体装置可包括超过一个的微流通道，从而提供编码珠在平行通道中的解码。在本发明的另一方面，微流体装置包括微流通道，所述微流通道依尺寸制造并进行配置以引导编码珠每次通过解码时前进一个编码珠。解码区包括代码检测器(光扫描仪、CXD传感器，等等)，其检测透过各编码珠的透射光的图案用于译出其上的图像所表示的代码。微流体装置的流通通道具有内部横截面，该内部横截面的几何形状依尺寸制造并成型，以当编码珠的特定横截面对准微流通道的横截面时接收和允许编码珠通过，由此针对解码区呈现呈特定取向的编码珠。在一种实施方案中，流通通道的内部横截面的几何形状依尺寸制造并成型，以当编码珠的最小横截面对准微流通道(例如，编码珠的长轴对准流通通道的轴)时接收和允许编码珠通过。微流体装置可包括超过一个的微流通道，从而提供编码珠在平行通道中的解码。在本发明的另一方面，微流体装置包括鞘流系统(sheath flow system)，以使得珠平稳且稳定地流经光学检测区。鞘流系统包括一个携带条形码珠的核心流和两个鞘流， 所述鞘流位于核心流外周的两侧或者附近或者周围，将核心流拉成恰当的尺寸。高得多速度的鞘流可通过真空、重力或者压力推进或者拉引。通过该方法，编码珠将自身排成行，在核心流通通道中可靠地、无摇摆或者翻转地流经检测区。通过调整核心流和鞘流的相对流速，编码珠可靠地在流动系统中流动，因此其可通过光学系统准确地进行解码和检测。在本发明的另一方面，光学检测系统包括至少一个照明光源用于条形码照明和荧光检测。荧光激发光源的波长取决于荧光团的选择。例如，用于条形码检测的线扫描CCD 相机连续地提供65，000次扫描/秒速率的扫描。通过恰当地调整流速，每个珠均将在照明区扫描几次。光子检测器例如光子倍增管具有迅速的检测速率，例如IOOMHz。可以在高速流动系统中快速地检测条形码和荧光珠。珠的鉴别可以与其它性质和/或特征相关。在本发明的另一方面，编码珠用生物和/或化学物质涂覆或者固定化，作为特异性捕集物或探针来影响期望的生物测定或者鉴定应用。可应用多个珠来进行多重生物测定。例如珠可用选自下组的物质进行官能化蛋白质、核酸、小分子、有机物、无机物、和它们的组合，使得用微体积样品在均相或异相媒介中进行多重测定成为可能。在本发明的又一方面，配置和构造生物分析系统使其使用本发明编码珠用于进行生物分析。微流系统包括微流体装置，以促进高通量均相或异相分析。微流体装置的检测区包括反应检测器(例如荧光检测器、吸收检测器、化学发光检测器，等等)用于检测在编码珠上发生的反应的结果。在一种实施方案中，配置并使微流系统的测定适合下面测定的高通量分析免疫测定、基因表达、单核苷酸多态性(SNP)诊断学、基于DNA的组织分型、或者转录谱。
在本发明的又一方面，大量数字磁珠可分布于平面表面上，用相机同时检测。平面表面可在显微镜玻片上或者在微量板的底部，所述微量板可以是临床诊断中的标准高通量形式；各板具有96、384或者1，536个患者样品。每个珠的代表数字信号例如“0”和“ 1”的条形码图案通过图像处理得到确定。在本发明的又一方面，数字条形码珠具有顺磁性，即，当将它们置于磁场中时它们具有磁性，但是当从磁场移出时不保留任何残余磁性。磁珠允许在微量板中洗涤用外部磁铁收集珠，并当移去磁场时再悬浮珠。多个数字磁珠允许在单个孔中进行多重测定。在本发明的又一方面，提供数字磁性微珠分析系统，其包括a.具有多个孔的微量板；b.沉降于微量板的各孔的底部的至少一个数字磁珠；c.位于微量板之上或者之下的光学检测器，其对该至少一个磁性微珠进行成像；以及d.用于处理至少一个磁性微珠的图像图案的图像处理软件。在一种实施方案中，孔数为约96、384或者1536孔。在本发明的又一方面，在显微镜和相机下同时拍得条形码图像和荧光图像。因此， 整个珠实验可在微量板中进行，而无需将珠移出。在本发明的又一方面，提供微珠分析系统，其中光学检测器可检测传感化学产生的光学信号和微珠上的条形码图像。在本发明的又一方面，数字磁性微珠包括第一层；第二层；和介于第一层和第二层之间的中间层，所述中间层具有限定于其上的编码图案，其中所述中间层部分是对光基本上穿透的和部分是对光基本上不透明的，表示对应于各微珠的代码。在本发明的又一方面，所述中间层包括限定编码图案的一系列交替的基本上透光部分和基本上不透光部分。透光部分和/或不透光部分之间的相对位置、宽度和/或间距表示二进制代码。基本上不透光部分包括遮光材料。各微珠的主体具有Imm以下的最长正交轴。在本发明的又一方面，数字磁珠的第一层和第二层用选自下组的物质进行官能化蛋白质、核酸、小分子、化学物质、以及它们的组合。在本发明的又一方面，透光部分由穿过中间层的隙缝定义，而不透光部分由光反射性物质和/或光吸收性物质定义。该隙缝包括具有第一宽度的隙缝和具有第二宽度的隙缝，并且其中第一宽度表示二进制代码中的“0”，而第二宽度表示二进制代码中的“1”。第一宽度为约ι 10微米，而第二宽度为约1 50微米，并且其中所述第一宽度窄于所述第二宽度。二进制代码可通过图像处理软件解码。
为了更完全地理解本发明的范围和本质以及优选的用途模式，应参照下面的具体说明(参考附图进行阅读)。在附图中，同样的附图标记在所有附图中表示同样或者类似的部分。图1示例说明了根据本发明的一种实施方案制备用于生物测定的透射光测定珠 (LITAB)的方法(a)在管中的多个LITAB，(b)用于生物测定的LITAB，以及(c) LITAB的照片。图2(a)是根据本发明的一种实施方案的LITAB的顶视图；图2(b)是沿图2(a)中线A-A的截面图；图2(c)是圆片上的10位条形码珠的顶视图；图2(d)显示条形码珠的传达的数字信号，表示0010110101。图3示例说明了表示透过LITAB中的缝隙的图案的光的光学信号脉冲。图4(a)示例说明了根据本发明的一种实施方案的微流体装置；图4(b)示例说明了包括鞘流系统的微流体装置。图5示例说明了包括根据本发明的一种实施方案的微流体装置的生物分析系统。图6示例说明了形成根据本发明的一种实施方案的珠的步骤。图7示例说明了作为夹于两个聚合物层之间的层的金属层，其可向分子固定化提供相同的表面化学。图8示例说明了根据本发明的另一种实施方案的微流体装置。图9示例说明了条形码微珠的显微图像。图10示例说明了边缘检测技术用于在图像中勾勒物体的用途。图11示例说明了用分界线分开分离的各珠。图12示例说明了使各微珠对齐主轴的方法，并且该灰度图像转化为矩阵，其包含
像素值。图13显示珠图像转化为作为像素值函数的灰度强度。图14示例说明了根据每个微珠中存在的条形码的宽度确定数字代码。图15示例说明了不同表面官能团的效果对蛋白质固定化具有不同的响应性。图16示例说明了在不同浓度的抗山羊小鼠IgG PE下改性EPON 1002F的荧光强度，所述改性EPON 1002F具有或者不具有用甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的PKHB-100，具有或者不具有聚乙二醇二甲基丙烯酸酯。图17示例说明了可用于实施本发明的环氧树脂的光酸催化机制。图18示例说明了丙烯酸酯类单体光接枝至环氧树脂的表面上。图19示例说明了丙烯酸酯的自由基聚合。
具体实施例方式本说明针对当前预期实施本发明的最佳模式。该说明是出于示例说明本发明的一般原理的目的，而不应理解为限制性的。通过参考所附权利要求最佳地确定本发明的范围。出于示例说明本发明原理而不是进行限制的目的，下文中参照呈托盘形的微珠和参照生物分析描述本发明。然而，应理解在不脱离本发明的范围和精神下，本发明同样适用于其它总体几何形状的微珠，并且可应用于其它需要基于珠的识别性进行鉴定的应用。为了便于下面的讨论，本发明的微珠称之为LITAB，其代表透射光测定珠。编码珠在本发明的一方面，微珠进行数字编码，如提供高的对比度和高的信噪比光学检测以促进珠的鉴别的图像所表示。该图像通过具有这样图案的物理结构实现，所述图案部分地是对光基本上穿透的(例如透明的、半透明的、和/或透光的)和部分地是对光基本上不透明的(例如反射光的和/或吸收光的)。透射光的图案得到确定(例如，通过扫描或者成像)，因而可译出在编码珠上的图像所表示的代码。可设计各种条形码图案例如圆形、正方形等形状，只要其表示“ 1，，或者“0”并能被解码器识别。在一种实施方案中，编码珠包括具有一系列交替的透光和不透光部分的主体，其中相对的位置、宽度和间距比拟ID或2D条形码图像(例如，一系列代表“0”代码的窄缝 (例如约1 5微米宽)和代表“1”代码的宽缝(例如约1 10微米宽)，或者反之，以形成二进制代码)。图2示例说明根据本发明的一种实施方案的编码珠LITAB 11。该LITAB 11具有呈平托盘或者圆盘形状的主体25。可配置编码珠的主体以使其具有相对几何形状和/或尺寸不同的至少两个正交横截面。进一步，横截面的几何形状可以是对称或者非对称的，和/或规则或者不规则形状。在此具体的实施方案中，所有3个正交轴具有不同的长度，并且所有3个正交横截面的几何形状是对称的且具有规则形状。图2 (a)显示平面几何形状比拟对称拉伸的卵形。图2(b)说明示出纵(或最长)轴的横截面。提供一系列的穿过主体25的宽缝和窄缝23和M，所述主体25可由基本上不透光材料(例如，反射性或者吸收性材料)制成或用其涂覆。宽缝和窄缝23和M分别表示逻辑“1”和“0”，或者反之， 全体表示二进制代码(每个缝隙代表一个比特)。在该实施方案中，该代码类似于条形码。 窄缝的宽度可为5微米，而宽缝M的宽度可为10微米。对于总体尺度为100 X 50 X IOym 至20(^111\10(^111\2(^111的1^几48，可在圆盘上提供至少约10条缝隙以编码10比特至 12比特或更多，从而允许1，024至4，096或更多的独特代码。在一种实施方案中，编码珠的最长正交轴小于1mm。尽管示例说明的实施方案显示间隔的窄缝和宽缝的图案，但是在不脱离本发明的范围和精神下也可能采用宽度恒定的缝隙的图案，所述宽度恒定的缝隙以相邻缝隙之间窄和宽的间距间隔，从而表示1和0。图2 (c)显示在圆片上的10位LITAB。缝隙尺度为IOym 和20μπι，分别表示“1”和“0”。图2(d)显示单个珠在电脑屏幕上的透射峰。当珠用光束照明时，基于透射峰的“总强度”或者来自缝的透射峰的“带宽”，可通过线扫描相机和数字信号处理器确定数字条形码0或1。基于该图，可根据峰宽而容易地鉴别条形码图案。该珠显示代表0010110101的10位条形码。为了解码图像，用光扫描主体的交替的透光和不透光区(类似于条形码扫描过程的方式)或者对其成像(例如，用CCD传感器)，从而确定由透射光确定的图像表示的代码。 出于示例说明，图3显示表示穿过图2(a)的LITAB11中的缝23和M的透射光的检测的一系列信号脉冲。该信号脉冲对应于穿过LITAB 11的纵轴的透射光与被遮挡的光的对比。 各信号脉冲的宽带表示在LITAB 11的代码中的“1”或“0”。在具体实例说明的实例中，较宽的脉冲表示1而窄的脉冲表示0。LITAB 11上的缝隙的相对位置决定哪个比特是最低有效比特(LSB)或者最高有效比特(MSB)。在一种实施方案中，最低有效比特位于靠近LITAB 11的一边缘或一端，以使其区别于位于相反的边缘或端的最高有效比特。解码信号脉冲的概念类似于传统条形码的解码。在另一种实施方案中，将LITAB的尺寸定制和配置为150 X 50 X 10 μ m，或者按比例较小的，缝宽为约2.5μπι。在这样的LITAB上的每个代码可由至多14条缝隙(或者比特)组成，以允许16，384个独特代码。应注意到，在可供选择的实施方案中，基本上透光区并不需要穿过LITAB主体的整个厚度的缝隙。缝隙可以用基本上透明或半透明材料完全或者部分填充，但与不透光区相比其提供基本上的透光性。例如，LITAB可以具有覆盖有遮光材料(例如，反射材料、或者反光或吸光染料)的透明主体，其具有界定使透明主体暴露的缝隙的开口。成像在该LITAB 上的光会在未被遮光材料覆盖的区(即，缝隙)透射穿过主体的光，和在覆盖区对光进行遮蔽。还应注意的是，在本发明概念的上下文中，基本上不透光的区并不需要完全遮蔽光的透射。它可以是通过基本上吸收光或者基本上反射光而基本上遮蔽光的区。设计概念是通过依赖基本上透光区和基本上不透光区之间的光透射的高对比实现光学成像的高对比度。与现有技术中实施的反射性或者发射性条形码成像相比，本发明可通过参照被遮蔽的光来检测透射光从而在光学图像中实现高得多的对比度。还有，在本发明的上下文中，透光性和不透光性是针对来自使用的预期光源的光的特定频率而言。例如，不透光区可基本上遮蔽UV光但是可以基本上透过UV带之外的光。类似地，透光区可以基本上透过UV光， 但是可以基本上遮蔽UV带之外的光。在另一种实施方案中，可以向编码的LITAB提供反射性薄膜或者涂层(例如， LITAB表面镀有或者涂覆有金属薄膜，或者提供金属薄膜的中间夹层，或者用光吸收性染料涂覆)，从而改善透射光与被遮蔽/反射的光之间的对比以及用于解码的图像识别的光学效率，这将进一步在下文中讨论。LITAB 11可采用薄膜成形中使用的常规方法在洁净室微制造设备中制造。LITAB 11的结构可使用下面方法获得，所述方法可包括常规的光刻法、印制、丝网遮蔽法、固化、显影(developing)、蚀刻(例如化学蚀刻、离子蚀刻和/或其它移除方法)、镀覆、用方块形花纹装饰(dicing)和本领域中熟知用于该类型结构和有关材料的其它方法步骤。此处省去这些方法的步骤细节，因为它们可涉及在半导体和/或微结构加工中熟知的常规图案化和光刻步骤。在本文提及的那些具体步骤和材料之外的具体制造步骤和有关材料当单独看来时不是本发明的一部分。应注意的是，尽管本文公开可通过示例针对某些层或结构非限制性地提及具体的涂覆、成形、图案化、沉积或者其它方法，但是可以在不脱离本发明的范围和精神下用其它方法代替。可以存在中间层或插入层、涂层或者其它结构以及相关的方法步骤，它们尽管未在本文示出或讨论，但是在不脱离本文公开的本发明范围和精神下可包括在内。例如，可存在缓冲层、底漆层(primer layer)、种衣层(seed layer)、胶黏层、涂层、 罩面漆(surface finish)或其它结构。在不脱离本发明的范围和精神下可实现其它变化。参照图6(a) (d)，在制造LITAB的方法的实施方案中，Ti层52(例如IOOnm)通过电子束蒸发而沉积在基体50例如洁净的玻璃片(例如约Imm厚)上。Ti用作导电种衣层以及替代隔离层。可使用一层聚合物材料来形成LITAB 11的主体25。例如，感光性光聚合物(例如，本领域中已知的SU-8等)可用于生成LITAB 11。聚合物材料层21旋涂在 Ti层52上，使用标准的光刻规程在该层中形成缝隙23和M。例如，可使用界定所期望的宽缝和窄缝图案的光掩模(未示出)和LITAB主体25的平面形状，通过UV光辐射刻画出缝隙23和24。可在单一基体上形成LITAB 11的排列，各自具有不同的缝隙图案，代表不同的代码。光掩模还可界定LITAB主体排列的周边，使得LITAB主体在刻画缝隙的光刻过程结束时彼此分离。由于SU-8是透明的，因此将电子束蒸发器用于在基体50上支承的SU-8 层21上沉积金属层，例如金(Au，0. Ιμπι)顶层22(也可参见图1(b))。最后，通过用含氢氟酸(HF)的蚀刻溶液溶解替代Ti层52，使各LITAB主体25 (示于图2(b))与下层的基体50 脱离。按此方式，LITAB上的金图案通过将光反射(导向暴露的侧面和与SU-8层21邻近的侧面)而遮蔽光，未被金层覆盖的缝隙透过光。由于金层22遮蔽光而开口缝隙透过光， 因此LITAB “条形码”提供高的光学信号以及在检测透射光时提供高的光学对比度。
通过适当修改上述方法，可供选择的实施方案可包括金属或者反射性非金属层作为夹于两个聚合物层之间的层。在该实施方案中，对于两个暴露的LITAB平面表面，可使得表面状况相同，从而提供类似的表面涂覆和固定化条件，这将在下文中讨论。如前述实施方案那样，金属薄层提高了透射光检测的信号对比率。图7显示LITAB 80的可供选择的实施方案，其可包括金属层81作为夹于两个 SU-8层82之间的中间层。这两个SU-8层在权利要求中称为第一层和第二层。在金属层81 上制造条形码图案。例如，在金属层81中形成不同宽度和/或间距的缝隙84。在示例说明的实施方案中，SU-8层82是封闭层层(即，没有缝隙)。形成LITAB 80的方法可包括首先形成第一 SU-8层82，然后形成金属层81，之后在其中蚀刻缝隙84。在金属层81上形成第二 SU-8层82(例如，通过旋涂和固化)，其填充缝隙84。作为选择，缝隙84可首先用另一透明材料填充，然后形成所述第二 SU-8层82。在该实施方案中，对于两个暴露的LITAB平面表面，可使得表面状况相同，从而提供类似的表面涂覆和固定化条件。其它的实施方案是用聚合物或者官能性分子例如羧化生物素或者抗生蛋白链菌素涂覆LITAB ；因此，整个珠具有相同的分子固定化状态。数字磁件微珠如根据下面针对微流系统的进一步讨论将是显然的，为了便于生物测定，可将顺磁性材料植入LITAB中(例如，作为LITAB中的中间层)，并夹于聚合物膜的第一层和第二层之间。由于顺磁性材料对于磁场具有相对小的和正的磁化系数，因此LITAB可通过外加磁场而固定化在期望的位置处，并且当移去外加磁场时LITAB可移动。顺磁性材料包括镁、 钼、锂、铝、镍和钽。然而，对于现有技术中存在的磁珠和条形码珠，未曾将磁性材料引入条形码微珠中。这是因为磁性材料(其固有地是深棕色的)与反射性条形码不相容，而反射性条形码需要交替的深色和白色线。应注意的是，在LITAB上的顺磁性涂层也可起到遮光材料的作用，因此反射性层不是必需的。即使在顺磁性材料的存在下，本发明仍然允许基于透射光的解码。LITAB 的合成例如，LITAB的特性可与用于生物测定目的的其它性质和/或特征相关。在本发明的另一方面，编码的LITAB用生物和/或化学物质进行涂覆或者固定化，作为特异性捕集物或探针以影响期望的生物测定或者鉴定应用。多个珠可应用于进行多重生物测定。例如， 该珠可用选自下组的材料进行官能化蛋白质、核酸、小分子、有机物、无机物以及它们的组合，从而使得使用微体积样品在均相或异相媒介中进行多重测定成为可能。图1示例说明了制备生物测定用LITAB的实施方案。如图1(a)中所示，LITAB 11允许对微体积样品进行多重均相生物测定。将对应于不同代码14的LITAB 11的混合物引入管13内的小体积生物样品12中。而后可容易快速地对LITAB进行光学解码。在一种实施方案中，图1(b)显示一个用核酸探针15官能化的LITAB 11，其用于目标杂交16 和荧光检测17。几种材料可用于珠的固定化。在一种实施方案中，可用微点阵中所用的共价DNA结合剂涂覆LITAB。探针珠随后在溶液中与互补的寡目标杂交，所述互补的寡目标在其5’端携带共价结合的Cy5荧光团。图1(c)是用视频显微镜捕捉的LITAB(尺寸 200ymX100ymX20ym)图像。LITAB材料必须具有与水或者预计使用的溶液类似或者低于其的密度。因此，LITAB 11可均勻地悬浮于用于反应的水溶液中。将LITAB材料配置为具有与液体媒介大致相同的密度，使得珠能够适宜地漂浮于媒介中。此外，该材料必须是足够坚固的以能抵抗混合和类似过程中的剪切应力引起的变形。如上所述，LITAB 11的主体可以由感光性光聚合物例如SU-8感光性聚合物制成。微流系统中的LITAB在本发明的另一方面，微流体装置包括微流通道，该微流通道依尺寸制造并进行配置以引导编码LITAB每次通过解码时前进一个编码LITAB。解码区包括代码检测器(光扫描仪、CCD传感器，等等)，其检测透过各编码LITAB的透射光的图案用于译出其上的图像所表示的代码。微流体装置的流通通道具有内部横截面，该内部横截面的几何形状依尺寸制造并成型，以在编码LITAB的特定横截面对准微流通道的横截面时接收和允许编码LITAB 的通过，由此针对解码区呈现呈特定取向的编码LITAB。在一种实施方案中，流通通道的内部横截面的几何形状依尺寸制造并成型，以在编码LITAB的最小横截面对准微流通道(例如，编码珠的长轴对准流通通道的轴)时接收和允许编码LITAB通过。微流体装置可包括多于一个微流通道，从而提供编码LITAB在平行通道中的解码。图4(a)示例说明了微流体装置31的实施方案，其设计用于译出LITAB11的代码。 微流体装置包括微流通道32，微流通道32具有矩形的内横截面，该矩形内横截面依尺寸制造并成型，从而以特定期望的取向容纳单个LITAB1K在下面情形中LITAB 11的纵轴沿着流通通道的轴，并且LITAB 11的平面表面通常与该通道的壁同中心)以使其流动通过该通道中的特定点。例如，流通通道可通过蚀刻形成在基体中(例如参见图8)。携带LITAB 的溶液流动通过微流通道32，由此引起LITAB流动通过微流通道32 (例如，在溶液的层流液流中)。微流通道22的入口是渐缩的，从而引导LITAB使其纵轴与通道的轴对齐。换言之，渐缩的通道入口几何形状是依尺寸制造并配置，以使内横截面的尺度小于LITAB 11纵轴的尺度。在另一种实施方案中，微流通道的横截面可以是轴对称的(例如，直径足够大得以容纳LITAB 11的宽度的圆形)。LITAB每次一个地通过解码区。针对解码区安置的解码系统包括光源和光学传感器。在图4(a)的示例性实施方案中，光源可以是二极管激光器33(波长650nm)，具有50X 物镜34，光学传感器可以是高速光子检测器35和数字读出电子器件36。作为选择，面光源 (例如，具有足够大的点尺寸的激光束)可用于射出光线以同时覆盖LITAB 11上的编码图案(所有的缝隙)，并且面光学传感器例如CCD传感器可用于同时对整个编码图案和穿过其的透射光成像。作为选择，线扫描相机可用于光学传感器。随着LITAB通过解码区，来自激光器33的光透射通过，通过光子检测器检测光强度，并使用阈值检测直接转化为1和0(无需模拟数字转化)，由此简化了电子器件要求。 缝隙在LITAB上的位置决定了哪个比特是最低有效比特(LSB)或者最高有效比特(MSB)。 LITAB在受限的微通道中微小的取向变异不会显著影响光学检测和作为结果的解码的效率。可沿着微流通道32提供多于一个的具有单独的解码系统的解码区，其可用于检测超静定性(redundancy)。进一步，所述解码系统可包括多于一组光源和光学传感器。例如，可配置两组光源和光学传感器，使正交光路通过微流通道32。如果微流通道的横截面是轴对称的(例如圆形横截面)，使得LITAB 11可基本上绕着流动轴转动，该解码系统将是有用的。正交轴解码光学将改善与至少一种解码轴相关的缝隙取向。通过使用和控制牵引流动的外部真空排气管线或推进流动的外部压力供应器，可对微流通道的流速进行调整。例如，调整最佳流速(例如0. 1-10 μ 1/s)从而确保运输过程中LITAB的完整性。使用微控制器或者数字信号处理器，数字读出电子器件36 (MHz-GHz)可控制线扫描相机，其在触发和门控时收集来自光学传感器35的数据。数字处理器读取表示光强度的 1和0的流(例如以100μ S的间隔)，并根据1和0之间的间距进行快速图案识别以确定缝宽序列。配置LITAB 11使其以约10-30毫米/秒的速度移动，从而读出仅需要约7毫秒每个LITAB。100，000个LITAB (10毫秒每个LITAB)的读出通过量将需要约16分钟每个测定。数据处理步骤可使用数字信号处理软件通过算法完成，所述数字信号处理软件包括快速有效处理各种图案的c-code软件。该软件的细节不在此处讨论，因为给定本文讨论的函数和过程，本领域技术人员能开发出这样的软件。电磁场(未示出)可置于解码区，邻近微流通道32，从而暂时固定化LITAB 11用于解码，尤其是如果使用线扫描相机解码LITAB 11的话。通过打开电磁场，可将包含顺磁性材料的LITAB 11固定化在流动液流中，并通过关闭电磁场来允许LITAB 11向下流过通道。微流体装置31具有至少两个优点(1)其使得LITAB的精确定中心成为可能，从而建立了水力照明的基础；以及(2)其降低了贯穿流动液流的LITAB堆积的可能性。如果假定在200 μ 1溶液中有1，000个LITAB，则在微流通道中珠之间的平均间距是约10mm。具有确保LITAB可流畅地流入微流通道32的适当的LITAB浓度对于光学检测是重要的。这与标准的圆柱形流动细胞的光学检测(例如目前用于例如荧光细胞成像等应用中的流动细胞计数技术)相当。图4(b)示例说明了微流体装置的另一种实施方案，其包括鞘流系统70以使珠平稳和稳定地流经光学检测区。该鞘流系统包括一个核心流71 (其携带条形码珠7 和鞘流 72，鞘流72位于核心流71的外周的一侧或者附近或者周围，将核心流71拉成期望尺度。 将珠混合于容器76内的溶液中，容器76具有漏斗77以将珠送入核心流中。为了避免珠堵塞，可以提供轻微的珠搅动。因为珠容器可以相对于核心流而言是相当大的，所以微管可用作宏观容器和微观核心流之间的界面。速度高得多的鞘流(其携带液体例如水)可通过真空、重力或者压力推进或者拉引。通过调整核心流和鞘流的相对流速，核心流的宽度75可针对珠尺度进行最佳化。通过该方法，珠将自身排成行，在核心流通通道中可靠地、无摇摆或者翻转地流经检测区。图8示例说明了微流体装置的另一实施方案，其提供整体发明系统和方法的另一透视图。微珠荧光检测在本发明的又一方面，配置和构造生物分析系统使其用于使用本发明编码珠进行生物分析。微流系统包括微流体装置，以促进高通量均相或异相分析。微流体装置的检测区还包括反应检测器(例如荧光检测器、吸收检测器、化学发光检测器，等等)用于检测在编码珠上发生的反应的结果。在一种实施方案中，配置并使微流系统的测定适合下面测定的高通量分析免疫测定、基因表达、单核苷酸多态性(SNP)诊断学、基于DNA的组织分型、或者转录谱。参照图5，微流系统的一种实施方案主要包括图4中示出的微流体装置31和微流通道32的解码区的上游的检测器区。反应检测系统16位于检测区。当用捕获探针固定化可鉴别LITAB时，光学标签可用于检测阳性或阴性反应。该标签可以是荧光标签、化学发光标签、或者吸收标签。在一种实施方案中，反应检测系统16 可包括荧光检测器，其测量来自珠上的标签材料的荧光信号。图5显示将LITAB 11混合物引入微流通道中用于荧光检测。当检测到正的荧光信号时，它表明阳性反应。反应检测系统16包括光源41、滤光器42和检测器43。光源的选择取决于荧光团。例如，红色二极管激光器(665nm)和小型氩激光器G88nm)或者氦激光器可以是用于Picogreen和Cy 5. 5 荧光团的光源。滤光器42除去混合在荧光中的反射的激发光(例如，Picogreen :525nm滤光器和Cy5. 5 :694nm滤光器)。Cy 3和Cy5是最常用的荧光染料；可分别用绿光(530nm) 和红光(635nm)激发。通常将光电倍增管作为检测器43来测量荧光强度。电磁场(未示出)可置于反应检测区，邻近微流通道32，从而暂时固定化LITAB 11用于反应检测。通过打开电磁场，可将包含顺磁性材料的LITAB 11固定化在流动液流中，并通过关闭电磁场来允许LITAB 11向下流过通道。在反应检测之后，通过在下游译出LITAB上表示的代码来鉴别LITAB。可提供控制器(未示出)来控制和协调与反应检测系统相关联的解码系统操作，该解码系统说明如下。 当荧光检测器对具体的LITAB检测到正的荧光信号(阳性反应)时，触发解码系统。可控制流速(例如，通过来自这两个区的反馈)和/或可选择反应检测区与解码区之间的距离， 使得一个LITAB通过反应检测区基本上与另一个LITAB通过解码区平行进行。进一步，可选择和控制流速和/或这两区之间的距离，从而当一个LITAB存在于反应检测区而另一个存在于解码区时在这两区之间不存在居间的LITAB。本发明的一些方面涉及LITAB技术的用途及其在如下的高通量筛选应用免疫测定、抗原、抗体、病原体、基因表达、核酸杂交、癌症诊断学、单核苷酸多态性(SNPs)等。基于 LITAB的生物测定可广泛地用于生命科学工业、药物发现、临床实验室测试和药物基因组学。例如，多重生物测定可用于测量化合物与疾病靶标之间的亲和力用于药物发现和研发， 和帮助医师开出恰当药物治疗的处方以匹配患者的独特基因组成，以及检测基因变异。本发明的一些方面涉及LITAB用于提供有成本效益的自动化人白细胞抗原(HLA) 分型(HLA-TYPER系统)的用途。HLA-TYPER设计为通过杂化将扩增的等位基因捕获在数字条形码珠上，以及(iii)检测扩增的等位基因(即，鉴定微托盘的条形码和定量受激珠发出的荧光信号)。非常多重的扩增技术与HLA-等位基因的基于珠的和自动化的微流检测的组合提供了下面两个优于目前的高分辨HLA分型方法的优点(i)系统是准确的，和(ii)系统通过减少劳力、试剂和消费品的成本而是有成本效益的。当前存在约3000个引物对用于初始低分辨率，以及进行后续的高分辨HLA分型所必需的约1500个引物对。该平台经得起依比例放大，并能允许同时针对成百上千的不同的不确定的等位基因对患者DNA进行高灵敏性和特异性的筛选，而无需麻烦的几个回合的等位基因筛选来提高分辨率。本发明的一些方面涉及LITAB用于鉴定和富集人血液中的循环DNA片段的用途， 该人血液潜伏有与癌症相关的突变。通过与条形码珠上的互补捕获序列杂交，LITAB富集特异性DNA片段，该条形码珠随后流动排序至不同的微孔中。在这些排序的片段中鉴别特异性突变等位基因通过基于PCR的筛选实现，所述筛选使用在各微孔中富集的DNA进行。该方法使得用户错误最小并减少了劳力、试剂和消费品的成本。该平台经得起依比例放大，并能允许针对特异性突变对成千上万的不同DNA片段进行高灵敏性和特异性的筛选。LITAB 系统优于现有技术的优点是其排序可能性能够从高度复杂的基因组DNA混悬物中以平行方式单独选择和富集成千上万的突变DNA小片段。该技术将能使体液中的循环DNA在临床癌症诊断学中成为有力的指示剂。本发明的一些方面涉及LITAB用于鉴别下述基因的用途，该基因的SNP基因型或单倍型与不同的单独药物响应、其它代谢过程或者疾病易感性相关。因此，快速且准确地确定医学相关区的基因型的能力将对理解个体的基因谱对这些过程的作用而言和对预测、预防和个人化医学的发展而言是至关重要的。LITAB技术用于针对医学相关基因的药物遗传学SNP基因分型测定将允许对个体的高通量分子诊断剖析。使用源于公开的乳腺癌1基因BRCAl的cDNA序列(NCBI登录号匪_007四4)的短序列，评价DNA探针与固定化在LITAB上的捕获探针序列的特异性杂交。在本实验中使用两条对应于BRCAl cDNA序列的核苷酸317-346的30bp目标序列。目标 1(野生型)5，CACAGTGTCCTTTATGTAAGAATGATATAA 3，[SEQ ID NO 1]目标 2 (SNP) :5，CACAGTGTCCTTTAcGTAAGAATGATATAA 3，[SEQID NO 2]目标1(野生型)包含野生型(正常)序列。目标2 (SNP)包含突变序列，其具有在331位替换的单个核苷酸多态性(SNP)T — C。该突变导致氨基酸替换，即精氨酸残基代替BRCAl蛋白质的密码子64中的正常的半胱氨酸残基。每个30bp捕获探针与不同编码的珠相连。将两种珠类型与Cy55’标记的含有与目标2 (SNP)突变序列互补的序列的探针在 50°C在溶液QX SSC,0. 1% SDS, poly dA)中共杂交。在杂交后洗涤以除去未结合的探针之后，将珠固定化在玻璃片上，记录共焦荧光图像。对于SNP珠，观察到比野生型珠显著更高的信号( 10X)，这表明SNP探针杂交针对其互补捕获探针而言是特异性的。用碘化丙锭对两种珠类型的对照染色确认了在两种珠上的捕获探针的分布是类似的。这确认了 Cy5 信号的差异是由于标记探针对正确目标的特异性杂交。使用相反系统得到类似结果，其中标记探针由与野生型捕获探针序列互补的DNA序列组成。与现有技术中的基于光学反射或发射的微珠相比，本发明的基于透射的微珠不但提供改善的图像信号对比度(透射光的强度会比反射光(取决于从其反射的表面的性质) 高)，而且还针对高效率信号采集提供更简单的光学配置。当微珠为微米量级(例如，珠的较长轴为Imm以下)并在微流系统中分析时，高光学效率是重要的。本发明编码珠可以通过发展成熟的可靠的半导体加工技术制造。该制造途径也优于现有的方法。因为珠尺寸和编码图案可通过光掩模得到精确控制，因而结构可容易地可靠地成批产生。此外，因为该途径是直接的，所以它不需要额外的复杂化学用于实现编码元件(这却是现有微珠中所要求的)。预期通过改变珠上的透光和不透光区的数目、组合和/或配置，用本发明途径可产生的代码数目可以是大量的。微量板中的LITAB磁珠LITAB是顺磁性的，即，当将其置于磁场中时它们具有磁性，但是当从磁场移出时不保留任何残余磁性。这允许微珠的磁性收集和在移去磁场时珠的再悬浮。数字磁珠的收集和再悬浮可容易且快速地重复任意次数。由于易于操作，磁珠广泛用于高通量自动化操作。常见的机器人自动装置仅仅通过自动夹子将96孔、384孔或者1536孔微量板置于装备有磁针的磁性座上。这能够从珠中洗掉未结合分子，改变缓冲液溶液，或者除去溶液中的任何污染物。例如，在DNA或者RNA测定的情形中，可在杂交之后除去未结合或者非特异性核苷酸。然而在蛋白质测定的情形中，可在抗体-抗原反应之后除去未结合或者非特异性抗体或抗原。分子生物学应用期间常常要求大量的洗涤快速有效且不费力地进行。在微量板中使用磁珠的益处是其代替了用于过滤和纯化操作的昂贵的离心。通过图像处理方法讲行条形码的解码除了解码在微流系统中对齐的微珠之外，还可通过成像处理法解码在载玻片或者微量板的底部上的无规取向的微珠。当珠沉降和分布在微量板的平面表面的底部上时，可用宽取景或者扫描图像相机同时解码多个珠。微量板是高通量临床测定的一种标准形式。 每个孔用于一个样品；每个板对于96孔、384孔和1，536孔分别容纳96、384或者1，536个患者样品。条形码图像和荧光图像均可在常规显微镜或者倒置荧光显微镜上作出。因此， 实验可在微量板中进行，而无需取出珠。尽管通过图像处理解码无规取向的珠比在微流通道中的对齐的珠花费稍长的时间，但是微珠的图像可在稳态中以更好的解码准确度和灵敏度取得。解码准确度对于临床诊断是极其重要的，因为任何错误的鉴定都能导致误诊和错误治疗。数字磁性LITAB分析系统具有用于珠图案照明的光源和用于在微孔的底部捕获微珠图像的光学(XD。扫描装置扫描所有的微孔。C⑶可用于条形码图像和荧光检测。4M 像素的CCD应具有足够的像素来解析珠上的条形码图案。滤光器用于选择激发波长和荧光波长。优选的实施方案是使用两个光源，一个用于透射模式中的条形码照明，另一个用于反射模式中的荧光激发。条形码照明光源可以是白色光，而荧光激发光源需要波长匹配荧光团的吸收。通过测量荧光强度，我们能鉴别哪些珠具有阳性生化反应。通过解码数字条形码图像，我们能鉴别哪种生物探针固定化在该微珠的表面上。使用用Matlab 8. 0写的脚本分析图像，基于来自珠的成像图案对条形码进行解码。图像解码程序由下面4个主要过程组成(1)图像的提高，(2)珠的分割，(3)条形码缝隙的提取，以及(4)条形码的解码。这些过程将在下面章节中解释。(1)图像的提高珠的解码的性能严重取决于图像的质量。解码过程的准确度可通过成像提高得到改善。该图像提高采用图像强度规格化来提供均一的强度背景。非均一的背景常常是由于不均勻的照明。为了获得珠的高图像对比度，应首先通过背景扣除和规格化来产生均勻的背景。(2)珠的分割图像分割的目的是在图像中描绘出珠以用于进一步分析。基本的分割例程是跟踪可在图像中定位该珠的边界例如图像中的线、曲线。我们使用Matlab中的分水岭算法(watershed algorithm)来分离各珠。因为黑色像素的较高密度(由于不透明区域)对应于珠的边缘，所以分水岭变换找到图像中的脊线(ridgeline)并将密度增高的像素包围的表面处理为珠。正常情况下，珠具有恒定的面积，因而各珠在使用它们的面积过滤之后从图像中分离出。此外，珠还基于珠中存在的缝隙(条形码)得以识别。使用结构元素变换和过滤提取缝隙组的轮廓。鉴于缝隙的优良清晰度，图像的背景中的任何噪音得以除去。Matlab中的分水岭算法适用于黑色和白色图像，因而将该图像转化为黑色和白色图像。(3)条形码缝隙的提取在珠的分割之后，分别地处理各珠以提取条形码。从主图像中提取的各珠的区域被认为亚图像，并逐个进行处理。亚图像显示珠的取向呈无规方向，具有主轴和短轴。计算珠的主轴与图像的χ-轴所成的角度。从珠中提取缝隙在旋转该珠至X-轴之后进行。在珠的旋转之后，除去珠的边界。尽管这些亚图像本质上是2-D的，但是它们仅携带透射强度信息。将该强度值沿着条形码的长度方向(y轴)进行平均。沿着珠的χ-轴方向的强度曲线显示具有两个宽度(窄和宽)的峰，对应于1和0比特。(4)比特的解码为了译出条形码，分析透射强度峰的宽度。最大值一半的线用于计算峰宽。为了提取二进制比特信息，5个像素足以描述珠的窄缝(‘0’)。使用10%的公差将宽度翻译成二进制比特。根据强度峰的上升或下降边缘，我们可鉴定出条形码的最高有效比特(MSB)或者最低有效比特(LSB)。因此，图像处理软件由下面的用于图像解码的步进式过程组成。1.读取图像，转化为如图9中所示的灰度图像。本编程中使用的一些图像处理算法来源于Matlab，由于它们要求灰度图像，所以将图像转化为灰度图像。2.除去背景的不均勻光学照明。为了达到均勻的背景，使用结构元素和图像算术处理各图像。为了进行进一步处理，图像扣除其背景并调整图像的亮度。3.为了分离各珠，需要边缘检测。使用称为“sobel”的边缘检测技术检测边缘。 如图10中所示，检测出边缘。4.为了分离相互接触(touching)的珠，使用过滤技术和分水岭算法。将具有 ‘sobel’过滤的大礼帽(top hat)技术用于淡化珠的所有边界并突出各珠内的缝隙。5.放大缝隙，并将距离转换用于发现分界线。分界线生成要求呈黑色和白色的图像。因此使用阈将各图像转化为黑色和白色。6.假定矩形的条形码缝隙结构元素，进行图像放大。使用图像的距离转换，生成分界线。分水岭算法还要求过滤后的图像的梯度的放大(magnitude)用于处理分界线。7. 一旦生成分界线，则将分界线叠加至已边缘检测的图像上，从而得到所得的分离珠。尽管这些分离珠在边缘处不规则，但是I-D条形码是完整的。8. 一旦各珠在图像中分离成单独的各区，则使用RGB色彩代码或者对各珠进行编号来标记所述各区(图11)。使用Region Pops算法计算各珠的不同参数例如面积、取向角度、像素列表。9.为了各微珠对准主轴(图12)，取得原始的灰度图像并转化为包含像素值的矩阵。由区域性质得到微珠的像素指数列表。用各微珠的像素指数列表代替灰度图像，使其余的像素归零。使用早先算得的各珠的取向角度，使各珠沿主轴旋转。10.如图13中所示，通过对强度和像素数目作图显示微珠图像。分析各强度曲线， 得到微珠中的条形码。平行X-轴作一直线，对于该直线与所述曲线的各交叉点取X值。然后得到连续两个X值之间的差值。可供选择的值是各微珠中的条形码的宽度。通过计算条形码边缘与第一缝隙之间的间距，找出条形码的方向。较长的距离对应于读取条形码的正方向。如果珠在图像中反向显示，则倒转条形码比特。如图14所示，解码结果得到显示。用于LITAB的生物相容的且可光固化的聚合物实施例1根据该实施例，由表1的感光性配制物制得对照聚合物溶液，用8路湿膜涂布器将其流延至洁净的聚酯(mylar)膜上。将膜在通风橱中干燥几小时，然后在45°C的强制通风炉中进一步干燥30分钟，然后用UV辐照(Stratalinker UV Crosslinker，型号1800，254nmUV灯泡，每个8瓦，输出功率 3000微瓦/平方厘米，总剂量300毫焦/平方厘米)100秒， 使用或者不使用光掩模G英寸X4英寸)，然后在65°C后烘焙3分钟。表1包含EPON SU-8作为对照的感光性配制物
权利要求
1.生物测定用基体，其包括至少一种具有低的吸收或荧光背景的环氧树脂和至少一种光致产酸剂的混合物，所述混合物具有含羧基单体。
2.权利要求1的基体，其中所述具有低的吸收或荧光背景的环氧树脂是2，2_二 (对-缩水甘油基氧基苯基)丙烷与2，2_ 二(对-羟基苯基)丙烷的缩合产物以及类似异构体。
3.权利要求1的基体，其中所述具有低的吸收或荧光背景的环氧树脂是4，4’-(1-甲基乙叉)双酚与2，2’ -[(1-甲基乙叉)双G，l-亚苯基氧基亚甲基)]二(环氧乙烷)的聚合物，或者双酚-A及其它相关物质的双酚-A缩合产物的二缩水甘油基醚。
4.权利要求1的基体，其中所述光致产酸剂是三芳基锍六氟锑酸盐。
5.权利要求1的基体，其还包括适当的溶剂。
6.权利要求1的基体，其中所述溶剂是环戊酮或者Y-丁内酯。
7.权利要求1的基体，其还包括官能性单体或者聚合物。
8.权利要求1的基体，其已经进一步用官能性单体或者聚合物进行后处理。
9.权利要求1的基体，其中所述含羧基单体是丙烯酸、丙烯酸2-羧基乙酯、3-丙烯酰氨基-3-甲基-1- 丁酸、或者4-乙烯基苯甲酸。
10.权利要求8的基体，其中官能性单体是含磺酸单体。
11.权利要求10的基体，其中所述含磺酸单体是2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸或者4-乙烯基苯磺酸。
12.权利要求8的基体，其中官能性单体是含环氧基或者硫杂环丙烷的单体。
13.权利要求12的基体，其中所述含环氧基或者硫杂环丙烷的单体是甲基丙烯酸缩水甘油酯或者4-缩水甘油基氧基苯乙烯。
14.权利要求1的基体，其选自膜、珠、磁珠和含镍条形码的磁珠。
15.权利要求14的基体，其涂覆至聚酯膜、玻璃或者有机硅片上。
16.权利要求1的基体，其是微珠。
17.权利要求1的基体，其结合有多肽或者多核苷酸。
18.权利要求1的基体，其结合有多核苷酸。
19.权利要求1的基体，其结合有多肽。
20.权利要求8的基体，其中所述官能性单体是包含羟基、环氧基、硫杂环丙烷基团、羧基、磺酸基团、单烷基胺基团或二烷基胺基团、季铵基团、或者这些官能团的任意组合的任意单体。
21.权利要求8的基体，其包括聚胺。
22.权利要求21的基体，其中所述聚胺是聚乙烯亚胺或者聚醚胺家族，或者双官能或多官能环氧化合物或树脂，或者这两种类型官能化合物的组合。
23.权利要求1的基体，其中所述聚合物树脂同时包含羧基或磺酸官能团以及氨基或铵官能团。
24.权利要求8的基体，其中所述官能性聚合物树脂是用氨基和羧基基团封端的聚乙二醇或者聚丙二醇。
25.权利要求8的基体，其中所述官能性聚合物树脂是用酸酐改性的聚醚胺家族。
26.权利要求25的基体，其中所述酸酐是琥珀酸酐。
27.权利要求1的基体，其还包括多糖。
28.权利要求27的基体，其中所述多糖是葡聚糖、羧基甲基纤维素或者壳聚糖。
29.权利要求8的基体，其中所述官能性聚合物具有螯合基团。
30.权利要求四的基体，其中所述螯合基团是亚氨基二乙酸。
全文摘要
本发明涉及由可光固化的环氧组合物制备的生物测定用基体，所述可光固化的环氧组合物进一步包括含羧基单体例如丙烯酸、2-羧基乙基丙烯酸、4-乙烯基苯甲酸、3-丙烯酰氨基-3-甲基-1-丁酸或者甲基丙烯酸缩水甘油酯，等等。所述可光固化的组合物可用于流延薄膜或者制造珠、磁珠或者含镍条形码的磁珠。所得的各种薄膜、珠、磁珠或者含镍条形码的磁珠可用于临床或者生物应用中。
文档编号G01N33/52GK102246037SQ200980148938
公开日2011年11月16日 申请日期2009年10月8日 优先权日2008年10月8日
发明者侯中仁, 温斯顿.Z.霍 申请人:应用生物代码股份有限公司