含有糖化血红蛋白的试样的前处理方法

专利名称：含有糖化血红蛋白的试样的前处理方法
技术领域：
本发明涉及糖化血红蛋白，特别涉及通过免疫学方法来正确测定糖化血红蛋白 Alc的方法。
背景技术：
血中的血红蛋白与糖结合的糖化血红蛋白(Glycohemoglobin)，特别是血红蛋白 β链N末端的缬氨酸残基被糖化的血红蛋白Alc(以下称作“HbAlc”)，在临床上由于反映了过去1 2个月的平均血糖值，所以作为适于糖尿病诊断或糖尿病过程观察的指标而得到广泛的使用。作为糖化血红蛋白的测定方法，已知的是HPLC法以及免疫学测定法，但是在免疫学测定法中，需要使用对血红蛋白的糖化部位具特异性的抗体。目前清楚的是，血红蛋白β 链N末端的糖化部位并非存在于蛋白质的表面，而是包埋于蛋白质的内部，存在于抗体难于结合的地方。因而，为了使识别该表位(印itope)部位的抗体进行高效率的反应，开发出使该表位部位露出到表面的技术(专利文献1)。作为使表位露出的方法，已知的是通过分别单独使用胍、硫氰酸、或者硫氰酸锂盐；或者通过使用硫氰酸与铁氰化物等氧化剂的组合、离子表面活性剂、非离子性表面活性剂等对含有糖化血红蛋白的试样进行处理的方法(专利文献1 6)。专利文献专利文献1 特开昭61-172064号公报专利文献2 特开平01-155268号公报专利文献3 特开平03-51759号公报专利文献4 特开平06-11510号公报专利文献5 特开2001-3；3442号公报专利文献6 特开2007-163182号公报。

发明内容
然而，关于以往的表位露出化方法，例如，胍处理需要加热处理。硫氰酸是对环境有害的物质。铁氰化物等氧化剂具有容易着色等保存稳定性上的问题。非离子性表面活性剂单独用时存在效果并不充分等问题。因此，本发明的课题在于提供含有糖化血红蛋白的试样的前处理方法以及使用该方法的糖化血红蛋白的免疫学测定法，其处理简便、在保存稳定性以及环境方面不存在问题，并且能够使表位在短时间内充分露出。因此，本发明人在对于糖化血红蛋白的高效且简便的表位露出化方法进行了研究之后，发现如果用含有胍与非离子性表面活性剂和/或亚硝酸盐的溶液来处理含有糖化血红蛋白的试样，则与分别单独使用胍、非离子性表面活性剂以及亚硝酸盐的情况相比，可获得非常优异的表位露出化效果，即使不施加加热处理也可使糖化部分在短时间内高效地露
3出，使糖化血红蛋白的正确的免疫学测定成为可能，从而完成了本发明。即，本发明提供了含有糖化血红蛋白的试样的前处理方法，用于免疫学测定糖化血红蛋白，其特征在于，用含有㈧胍或其盐、与⑶非离子性表面活性剂和/或亚硝酸盐的前处理液，对含有糖化血红蛋白的试样进行处理。并且，本发明提供了含有糖化血红蛋白的试样的前处理液，用于免疫学测定糖化血红蛋白，其特征在于，含有㈧胍或其盐、与⑶非离子性表面活性剂和/或亚硝酸盐。进一步，本发明还提供了含有糖化血红蛋白的试样中糖化血红蛋白的免疫学测定方法，其特征在于，将含有糖化血红蛋白的试样用含有(A)胍或其盐、与(B)非离子性表面活性剂和/或亚硝酸盐的前处理液进行处理，然后用抗糖化血红蛋白抗体进行免疫学测定。根据本发明的前处理方法，通过短时间的简便处理，试样中的糖化血红蛋白中的糖化部分会高效率地露出。因此，如果使用该处理过的试样来进行使用抗糖化血红蛋白抗体的免疫学测定，则使正确地定量糖化血红蛋白成为可能。


图1表示用竞争ELISA法对各试剂的表位露出化效果进行比较的结果。图2表示用竞争ELISA法对本发明试剂的表位露出化效果中pH的影响进行研究的结果。图3表示用竞争ELISA法对本发明试剂的保存稳定性进行研究的结果。图4表示根据使用本发明试剂的夹层ELISA进行的HbAlc浓度测定系以及HbAO 浓度测定系中的校正曲线。图5表示根据免疫色谱法进行的HbAlc的测定方法的概略图。
具体实施例方式本发明的含有糖化血红蛋白的试样为糖化血红蛋白测定用的被检试样，可举出例如血液、红血球成分等。在此，作为糖化血红蛋白，优选血红蛋白β链被糖化的糖化血红蛋白，特别优选HbAlc。此外，利用本发明方法而露出的表位部位为血红蛋白的糖化区域，例如血红蛋白 β链的糖化N末端区域，更优选含有血红蛋白β链的N末端缬氨酸被糖化的肽的区域。本发明的前处理用前处理液中含有(A)胍或其盐、与(B)非离子性表面活性剂和 /或亚硝酸盐。根据本发明，通过将成分(A)与成分(B)合用，与分别单独使用成分(A)或者成分(B)的情况相比，可获得非常优异的表位露出化效果。作为成分(A)胍，尽管可使用胍本身，但是从表位露出化效果方面考虑而特别优选使用胍盐。作为胍盐，优选胍盐酸盐。从表位露出化效果以及抗体的反应性方面来考虑， 胍的使用浓度优选lmol/L 6mol/L，特别优选2. 5mol/L 3. 5mol/L。作为成分(B)非离子性表面活性剂，可举出聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、 烷基苷、烷酰基-N-甲基葡糖酰胺、(烷基氨基甲酰基)甲基吡喃葡萄糖苷、烷基吡喃葡萄糖苷、脱氧胆酸酰胺类、皂角苷等。更具体地，可举出聚氧乙烯C6-Cm烷基醚、聚氧乙烯C6-C24烷基苯基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯醚、聚氧乙烯C6-C24脂肪酸酯、蔗糖C6-C24脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐C6-C24脂肪酸酯、C6-C24烷基苷、C6-C24烷酰基甲基葡糖酰胺、(C6-C24烷基氨基甲酰基)甲基吡喃葡萄糖苷、C6-Cm烷基吡喃葡萄糖苷、N，N-双[3-(D-葡萄糖酰氨基)丙基]-3，12- 二羟基胆留烷-24-胺、皂角苷。从表位露出化效果方面以及抗体反应性方面来考虑，非离子性表面活性剂的使用浓度优选0. 5%，特别优选0. 2% 1. 5%。作为成分⑶亚硝酸盐，可以举出亚硝酸钠、亚硝酸钾等亚硝酸的碱金属盐。从表位露出化效果方面以及抗体反应性方面来考虑，亚硝酸盐的使用浓度优选 lmmol/L 50mmol/L,特另Ij优选 5mmol/L 15mmol/L。非离子性表面活性剂与亚硝酸盐可分别单独使用，也可合用，但是从缩短处理时间、提高定量性方面来考虑，更加优选合用。此外，关于本发明前处理液中的成分(A)与成分(B)的含有比(质量比)，从表位的露出化效果以及抗体的反应性方面来考虑并不特别限定，上述各成分的浓度范围，即， (A)的浓度范围可为1 6mol/L，⑶非离子性表面活性剂的浓度范围可为0. 1 5%，并且(B)亚硝酸盐的浓度范围可为1 50mmol/L。本发明的前处理液优选使用含有前述成分(A)以及(B)的水溶液。并且，该水溶液的PH优选4. 0 9. 0，更优选4. 5 7. 0。对于这些pH的调整，也可添加适宜的缓冲剂。 作为缓冲剂，可使用柠檬酸、邻苯二甲酸、醋酸、琥珀酸、卡可基酸、马来酸、咪唑、三甲基吡啶、磷酸、Johnson-Lindsay等的通用缓冲剂；2-吗啉乙磺酸(以下称作“MES”)、二 O-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(以下称作“Bis-Tris”)、哌嗪-N，N，_ 二 O-乙烷磺酸) (以下称作“PIPES”)等的Good缓冲剂。在使用本发明的前处理液来处理含有糖化血红蛋白的试样时，可向含有糖化血红蛋白的试样溶液中添加前处理液并搅拌。温度优选15°C-50°C，更优选20°C-4(TC。处理时间优选30秒 30分，更优选1分钟 5分钟。含有糖化血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白，通过前述处理，糖化部位高效率地露出。因此，关于该处理试样，如果进行使用抗糖化血红蛋白抗体的免疫学测定，则可正确定量含有糖化血红蛋白的试样中糖化血红蛋白的含有量。本发明方法中的糖化血红蛋白测定方法可采用通常的免疫测定方法中的任意一种。在此，作为免疫测定方法，可举出夹层ELISA法、竞争ELISA法、免疫色谱法、乳胶凝集法、竞争乳胶凝集法等。以下，将HbAlc的测定作为示例来进行说明。例如，用夹层ELISA法进行测定时，可将纯化的HbAlc作为标准品，用以下方法进行HbAlc定量。即，在固定有抗HbAlc抗体的ELISA板上，添加用本发明的前处理液处理过的样品试样并进行反应之后，与酶标记的抗血红蛋白抗体(以下称作“抗Hb抗体”)进行反应，从显色后的吸光度变化，可特异性地定量试样中存在的HbAlc。在用乳胶凝集法进行测定时，可将纯化HbAlc作为标准品，用以下方法进行定量。 即，通过使抗HbAlc抗体在作为不溶性载体的乳胶粒子上敏化，并且与用本发明前处理液处理过的样品试样以及抗Hb单克隆抗体进行接触，从而使抗体敏化乳胶粒子介由试样中的HbAlc彼此交联，产生凝集，因此从该凝集度的变化可特异地定量该HbAlc。在用竞争乳胶凝集法进行测定时，可将纯化HbAlc作为标准品，用以下方法进行定量。即，通过使HbAlc的β链N末端的糖化肽，例如糖化6残基肽(f-VHLTPE(序列号 1))在作为不溶性载体的乳胶粒子上敏化，并且与用本发明前处理液处理过的样品试样以及抗HbAlc抗体进行接触，对于f-VHLTPE敏化乳胶粒子与抗HbAlc抗体的凝集反应，样品试样中的HbAlc显示出竞争阻碍，从该竞争阻碍的变化可特异地定量样品试样中的HbAlc。作为乳胶凝集法等中的抗体敏化乳胶粒子的乳胶粒子，只要是在利用乳胶凝集反应的免疫学凝集反应以及凝集阻止反应中一般使用的微粒子载体，就没有特别地限制，但是优选可在工业上大量生产的有机类微粒子。作为这样的有机类微粒子，可举出例如苯乙烯、氯乙烯、丙烯腈、醋酸乙烯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯等的乙烯类单体的均聚物或共聚物；苯乙烯-丁二烯共聚物、甲基丙烯酸酯-丁二烯共聚物等的丁二烯类共聚物等。此外， 在这样的有机类微粒子中，还可优选使用结合有羧基、伯氨基、氨基甲酰基、羟基、醛基等官能团的反应性有机类微粒子。上述乳胶粒子中，从抗原或抗体的吸附性优异，可长期稳定地保持生物学活性方面来考虑，优选聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物等的聚苯乙烯类乳胶粒子。对于乳胶粒子的形状不作特别限制，但是希望其平均粒径充分大，以可肉眼或者光学地检出作为乳胶粒子表面蛋白质与测定对象物质的凝集反应的结果所产生的凝集体。 作为优选的平均粒径为0. 02 1. 6 μ m,特别优选0. 03 0. 5 μ m。对于使抗HbAlc抗体在乳胶粒子上敏化的方法并不作特别限定，可使用公知的方法。例如，可举出物理吸附到乳胶粒子表面的方法、共价结合到具有官能团的乳胶粒子表面上的方法、以及通过免疫学结合而敏化方法等。用免疫色谱法进行测定时，因为血红蛋白的β链N末端未被修饰的血红蛋白 AO (以下称作“HbAO”)与HbAlc可同时测定，所以特别适宜。例如，如图5所示，使用将抗 HbAO抗体以及抗HbAlc抗体各自固定到分别的部位(A线与B线)的免疫色谱支持体。将用本发明的前处理液处理的含有HbAlc的样品滴落到样品垫上。滴落的试样由于毛细管现象而展开，到达A线时仅试样中的HbAO反应，到达B线时仅试样中的HbAlc反应。其它血红蛋白未反应而移动至垫末端。如果用免疫色谱阅读器测定A线与B线的色浓度、反射强度以及吸光度等，则可分别定量试样中的HbAO与HbAlc。在此，将HbAO的定量值设为A、 HbAlc 的定量值设为 B 时，还可用 HbAlc ) = (B/(A+B)) X 100，求得 HbAlc )。在此，作为HbAlc抗体，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，例如可使用专利文献(特开昭61-172064号公报、特开平6-66796号公报)中记载的抗体等。实施例以下列举实施例来更加详细地说明本发明。实施例1 (表位露出效果的比较)(I)材料与方法(1)纯化HbAO以及纯化HbAlc的制备使用人红血球溶血液，通过非专利文献(Melisenda J. McDonald等，JBC, 253 (7), 2327-2332,1978)记载的使用Bio_Rex70 (Bio-Rad公司)的离子交换色谱法，纯化HbAO以及HbAlc，用于以后的实验。(2)各种肽以及糖化血红蛋白的制备通过使用肽自动合成装置的Fmoc法来合成以及纯化各序列的肽。各肽的纯度用HPLC确认为95%以上。另外，用质量分析装置(MALTI-T0F)确认分子量与理论值相同。 用专利文献(特开昭61-172064号公报)记载的方法来合成以及纯化糖化肽。即，使各序列的肽与葡萄糖在无水吡啶中反应来合成糖化肽，用HPLC进行纯化。用质量分析装置 (MALTI-T0F)确认各糖化肽的分子量与理论值相同，即与各肽的分子量加上162所得的分
子量相同。(3)肽结合蛋白以及糖化肽结合蛋白的制备在上述⑵中制备的肽或者糖化肽中，关于将C末端合成为半胱氨酸(C)的肽(例如，VHLTC(序列号2)，f-VHLTC)，按照如下与载体蛋白结合。S卩，将按照5mg/mL的浓度溶解在含有0. 15mol/L NaCl的20mmol/L pH7. 2磷酸缓冲液(以下称作“PBS”)中的肽(VHLTC) 或者糖化肽(f-VHLTC)与按照5mg/mL的浓度溶解于纯化水中的马来酰亚胺活化卵清蛋白 (OVA) (PIERCE公司制)按照1 1进行混合之后，在室温下边缓慢旋转边进行2小时温育， 用 PBS 透析而使用(VHLTC-OVA，f-VHLTC-OVA)。(4)抗血红蛋白抗体、抗HbAlc抗体以及抗HbAO抗体的制备抗血红蛋白抗体是使用将上述(1)中的纯化HbAO作为免疫原通过常规方法制作的小鼠单克隆抗体。抗HbAlc抗体是使用按照专利文献(特开昭61-172064号公报)记载的方法制作的小鼠单克隆抗体。即，将在上述⑵中合成的糖化肽(f-VHLTPEEKYYC(序列号3))与血蓝蛋白((keyhole limpet hemocyanin，以下称作KLH)结合，将其作为免疫原。 关于杂交瘤细胞的筛选，选择在抗原固相化ELISA中与纯化HbAlc反应而与纯化HbAO不反应的细胞株。抗HbAO抗体是使用将在上述(3)中制备的肽结合蛋白(VHLTC-0VA)作为免疫原，按照常规方法制作的小鼠单克隆抗体。此时，关于杂交瘤细胞的筛选，选择在抗原固相化ELISA中与纯化HbAO反应而与纯化HbAlc不反应的细胞株。关于抗HbAO抗体，将对前述筛选中选择的细胞株进行克隆，将产生HbAO单克隆抗体的杂交瘤细胞保藏于独立行政法人产业技术综合研究所(2008年11月观日，日本茨城县筑波市东一丁目1番地1中央第6)。保藏编号如下所示。抗体编号85201保藏编号FERMBP-11187(5)样品处理方法将人红血球按照1 50的比率与各处理液混合，在25°C下处理10分钟。之后，将该混合液用 1% BSA-0. 05% Tween20-PBS (以下称作 “1% BSA-PBST")稀释至 4 倍(HbAlc 浓度64 μ g/mL)、40 倍(HbAlc 浓度6. 4 μ g/mL)、或者 400 倍(HbAlc 浓度0. 64 μ g/mL)的各浓度，供给后述的竞争ELISA。(6)竞争 ELISAa.将在上述(3)中制备的f-VHLTC-OVA用PBS稀释至1 μ g/mL的浓度后，按照 50 μ L/孔分别注入到96孔板上，在4°C下静置一夜。b.用0. 05% Tween20-PBS (以下称作“PBST” )按照400 μ L/孔洗涤3次后，按照 100 μ L/孔分别注入封闭液(1% BSA-PBST)，在室温下静置1小时。c.用PBST洗涤3次后，按照25 μ L/孔分别注入在上述(5)中制备的样品液。d.接着，按照25 μ L/孔分别注入用1 % BSA-PBST稀释至0. 5 μ g/mL的抗HbAlc 抗体，在室温下静置1小时。
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e.用PBST洗涤3次后，按照50 μ L/孔分别注入用1 % BSA-PBST将 HRP-GtF (ab，)2-Anti-Mouse Ig's (Biosource公司制)稀释5000倍的溶液，在室温下静置 1小时。f.用PBST洗涤3次后，分别注入(50 μ L/孔)含有邻苯二胺盐酸盐的显色液(将邻苯二胺盐酸盐(东京化成公司制)以ang/mL、将过氧化氢以0. 02%浓度溶解于pH5. 0的柠檬酸缓冲液(以下称作“0PD显色液”))，在室温下静置10分钟。g.按照50 μ L/孔分别注入0. 75mol/L硫酸使反应停止后，用平板阅读器来测定 492nm的吸光度。(7)阻碍率的计算根据下式，从在上述(6)中求得的吸光度来计算阻碍率，作为各试剂的表位露出化效果的指标。阻碍率(％) = [ (A-B) /A] X 100A 空白样品的吸光度B 添加样品时的吸光度(II)结果(1)各试剂的露出效果的比较作为前处理液，使用3mol/L胍盐酸盐、1 %聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯 (Tween20)、10mmol/L亚硝酸钠的各水溶液；6mol/L胍盐酸盐与2%聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯的1 1的混合液(胍+聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯)；6mol/L胍盐酸盐与 20mmol/L亚硝酸钠的1 1的混合液(胍+NaNO2) ；2%聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯与 20mmol/L亚硝酸钠的1 1的混合液(聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯+NaNO2)；以及5mmol/ L的MES缓冲液(pH6. 0)，按照上述(I) (5)对样品进行处理之后，用竞争ELISA来比较露出化效果。其结果是，如图1所示，可清楚看出胍+聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、以及胍 +NaNO2比单独使用胍具有更显著的露出化效果。另一方面，聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、 亚硝酸钠以及MES缓冲液单独使用，以及聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯+NaNO2几乎没有露出效果。由此可获得如下启示，通过将聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯或者亚硝酸钠添加至胍盐酸盐水溶液中，表位露出效果会变得显著高。(2)表面活性剂的种类作为前处理液，使用将各种非离子性表面活性剂以终浓度1%、0.5%或者0.25% 添加至3mol/L胍盐酸盐水溶液中所得的试剂，对样品进行处理后，用竞争ELISA对各试剂的表位露出化效果进行比较。其结果是，如表1所示，可清楚看出与单独使用胍盐酸盐的试剂相比，添加了各表面活性剂的试剂具有显著高的表位露出效果。由此可获得如下启示，通过将非离子性表面活性剂添加至胍盐酸盐水溶液中，表位的露出效果会变高。表 权利要求
1.一种含有糖化血红蛋白的试样的前处理方法，用于免疫学测定糖化血红蛋白，其特征在于，用含有(A)胍或其盐、与(B)非离子性表面活性剂和/或亚硝酸盐的前处理液，对含有糖化血红蛋白的试样进行处理。
2.根据权利要求1所述的前处理方法，其中，胍或其盐的使用浓度为1 6mol/L，非离子性表面活性剂的使用浓度为0. 1 5 %，亚硝酸盐的使用浓度为1 50mmol/L。
3.一种含有糖化血红蛋白的试样的前处理液，用于免疫学测定糖化血红蛋白，其特征在于，含有㈧胍或其盐、与⑶非离子性表面活性剂和/或亚硝酸盐。
4.根据权利要求3所述的前处理液，其中，胍或其盐的使用浓度为1 6mol/L，非离子性表面活性剂的使用浓度为0. 1 5 %，亚硝酸盐的使用浓度为1 50mmol/L。
5.一种含有糖化血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的免疫学测定方法，其特征在于， 用含有(A)胍或其盐、与(B)非离子性表面活性剂和/或亚硝酸盐的前处理液，对含有糖化血红蛋白的试样进行处理，接着进行使用抗糖化血红蛋白抗体的免疫学测定。
6.根据权利要求5所述的测定方法，其中，胍或其盐的使用浓度为1 6mol/L，非离子性表面活性剂的使用浓度为0. 1 5 %，亚硝酸盐的使用浓度为1 50mmol/L。
全文摘要
本发明提供了含有糖化血红蛋白的试样的前处理方法以及使用该方法的糖化血红蛋白的免疫学测定方法，其处理简便、在保存稳定性以及环境方面不存在问题，并且能够使表位在短时间内充分露出化。一种含有糖化血红蛋白免疫学测定用的糖化血红蛋白的试样的前处理方法，其特征在于，采用含有(A)胍或其盐、与(B)非离子性表面活性剂和/或亚硝酸盐的前处理液，对含有糖化血红蛋白的试样进行处理。
文档编号G01N33/48GK102246036SQ20098014984
公开日2011年11月16日 申请日期2009年12月10日 优先权日2008年12月11日
发明者宫崎修, 田久保耕平, 藏下俊祐 申请人:积水医疗株式会社