专利名称：抗人α9整合素抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗人α 9整合素抗体及其用途。更具体而言，本发明涉及特异性识别人α 9整合素的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及人抗体；产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞；上述单克隆抗体的制备方法；上述杂交瘤细胞的制备方法；含有上述抗人α 9整合素抗体的治疗剂；含有上述抗人α 9整合素抗体的诊断剂；及抑制人α 9整合素活性的化合物的筛选方法等。
背景技术：
细胞与细胞外基质之间的粘附，通过整合素所代表的跨膜的细胞粘附蛋白而进行。整合素是以α链和β链为1 1的异二聚体来构成，迄今为止已发现18种α链、8 种β链，它们的组合中至少M种已得到鉴定。已知各整合素分别识别特异性细胞外基质 (配体)。而且已逐步明确，作为含有整合素的跨膜细胞粘附蛋白的作用，不仅在于使细胞与细胞外基质粘附、固定，而且还将来自细胞外基质的信息转换为细胞内信号，负责调节细胞增殖、运动、细胞死亡、分化等。根据相对于配体的特异性和功能，将整合素分类为亚家族，划分为胶原受体；层粘连蛋白受体；识别纤连蛋白、玻连蛋白等中所含的Arg-Gly-Asp(RGD)序列的RGD受体； 只存在于白细胞中的白细胞特异性受体。α 4整合素和α 9整合素，均不属于上述这些亚家族而被称为α 4整合素亚家族。作为与α 4和α 9整合素相结合的配体，已知有骨桥蛋白(osteopontin，以下简称为“0ΡΝ” )、纤连蛋白的EDA部位、前肽-血管性血友病因子(pp-vWF)、组织型转谷氨酰胺酶(tTG)、第XIII凝血因子以及血管细胞粘附分子(VCAM-1 =Vascular Cell Adhesion Molecule-1)等。而且，作为α 4整合素特异性识别的配体已知有纤连蛋白的CS-I区、Mad CAM-Ka 4β 7)等。另一方面，作为a 9整合素特异性识别的配体，已知有肌腱蛋白C、纤溶酶等。作为一种细胞外基质(ECM Extracellular matrix)的OPN是分子量约41kDa的分泌型磷酸化酸性糖蛋白，是一种被认为在乳汁、尿、肾小管、破骨细胞、造骨细胞、巨噬细胞、活化T细胞、肿瘤组织等之中广泛表达的分子。分子中央部位具有细胞粘附序列GRGDS 并在人OPN中具有SVVYGLR序列，在小鼠OPN中具有SLAYGLR序列，紧随其后具有凝血酶酶切位点，通过GRGDS序列与RGD受体的整合素粘附，通过SVVYGLR序列或SLAYGLR序列与 α4(α4β1)禾口 α9(α9β1)整合素粘附。研究发现α4β1和α9β1双方存在下述方式上的差异α4β1与未被凝血酶切断的OPN(非切断型0ΡΝ)和被凝血酶切断的N末端片段(切断型0ΡΝ)这两者结合，而 α9β 1只与切断型OPN结合。α4与α9整合素以及β 1的整合素亚单位的氨基酸序列是公知的，登记在 GenBank上。而且已知这些整合素在种类之间氨基酸序列的相似性高。W002/081522中公开了利用OPN缺失小鼠或OPN的中和抗体而基于抑制OPN功能的风湿性关节炎、肝炎的治疗效果。而且，在该公报中还公开了作为α 4整合素、α 9整合素的识别序列的SVVYGLR序列对炎症性疾病发病很重要，OPN的受体在免疫活性细胞等之中表达，与炎症性疾病相关。专利文献1 :W002/08152
发明内容
发明要解决的课题目前，已知有各种癌、炎症性疾病、传染病(感染症)、自身免疫性疾病和骨病的治疗药，希望开发出具有进一步改善的治疗效果的癌、炎症性疾病、传染病、自身免疫性疾病和骨病的预防药和/或治疗药等。迄今为止，本发明人等，着眼于整合素尤其是α9整合素，进行了各种研究，结果发现α 9整合素的特异性抑制抗体具有癌抑制效果和抗炎症效果，制备了产生5种单克隆抗体的杂交瘤细胞(1K11、21C5、24I11、25B6 和 28S1)(分别作为 FERM BP-10510、FERM BP-10511、FERM BP-10512、FERM BP-10513 和 FERM BP-10832 保藏于茨城县筑波市东 1 丁目1番地1、中央第6 (邮政编码305-8566)、独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(保藏日期最初4个为2006年2月15日，最后一个为2007年5月四日))。在这种情形下，进一步需求药效优良的单克隆抗体或者替代性单克隆抗体。解决课题的方法本发明人等，为了开发出药效优于前述5种单克隆抗体的抗体或者替代性单克隆抗体，进行了精心研究，成功制备出产生新型单克隆抗体的杂交瘤细胞，从而完成了本发明。S卩，本发明提供下面所述的抗人α 9整合素抗体、其单克隆抗体、产生其的细胞、 含有上述抗体的治疗剂、抑制α 9整合素活性的化合物的筛选方法等。(1) 一种抗人α 9整合素抗体，其含有序列号1 12中任一个氨基酸序列。(2) 一种抗人α 9整合素抗体，其含有序列号1、3、5、7、9或11的氨基酸序列。(3) 一种抗人α 9整合素抗体，其含有序列号1、3、5、7、9和11的氨基酸序列。(4) 一种抗人α 9整合素抗体，其含有序列号2、4、6、8、10或12的氨基酸序列。(5) 一种抗人α 9整合素抗体，其含有序列号2、4、6、8、10和12的氨基酸序列。(6) 一种抗人α 9整合素抗体，其含有作为重链的互补性决定区(⑶RH)中的氨基酸序列的序列号1 6中任一个氨基酸序列、作为轻链的互补性决定区(CDRL)中的氨基酸序列的序列号7 12中任一个氨基酸序列。(7)如上述⑴ (6)中任一项所述的抗人α 9整合素抗体，其抑制人α 9整合素与α 9整合素的配体的结合。(8)如上述⑴ (7)中任一项所述的抗人α 9整合素抗体，其为单克隆抗体。(9)如上述⑴ ⑶中任一项所述的抗人α 9整合素抗体，其为嵌合抗体。(10)如上述(1) (8)中任一项所述的抗人α 9整合素抗体，其为人源化抗体。(11)如上述⑴ ⑶中任一项所述的抗人α 9整合素抗体，其为人抗体。(12) 一种抗人α 9整合素抗体，其由保藏号FERM ΒΡ-10830或FERMBP-10831所标记的杂交瘤细胞产生。
(13) 一种癌、炎症性疾病、传染病、自身免疫性疾病或骨病的治疗剂，其作为有效成分含有上述(1) (1 中任一项所述的抗人α 9整合素抗体。(14) 一种癌、炎症性疾病、传染病、自身免疫性疾病或骨病的治疗剂，其作为有效成分含有上述(1) (1 中任一项所述的抗人α 9整合素抗体和抗人α 4整合素抗体两
者ο(15) 一种癌、炎症性疾病、传染病、自身免疫性疾病或骨病的诊断剂，其作为有效成分含有上述(1) (1 中任一项所述的抗人α 9整合素抗体。(16) 一种细胞，其产生上述(1) (1 中任一项所述的抗人α整合素抗体。(17) 一种杂交瘤细胞，其标记为保藏号FERM ΒΡ-10830或FERM ΒΡ-10831。(18) 一种抑制α 9整合素活性的化合物的筛选方法，其特征在于，使用含有α 9整合素的氨基酸序列的肽。发明效果基于本发明，提供新型抗α整合素抗体。本发明的抗α 9整合素抗体，显示出优良的抑制α 9整合素功能的作用，并且发挥对癌(例如癌细胞的增殖、转移)、炎症性疾病 (例如，风湿性关节炎、变形性关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维症、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化症、炎症性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩氏病等))、传染病(例如肝炎)、自身免疫性疾病(例如，系统性红斑狼疮、多发性肌炎、自身免疫性甲状腺疾病、肾小管间质性肾炎、重症肌无力症)和骨病(例如骨质疏松症)等的治疗效果。并且，含有本发明的抗α 9整合素抗体和抗α 4整合素抗体这两者的医药组合物，发挥进一步得到改善的癌、炎症性疾病等的治疗效果。本发明的抗体能够在病理学上测定α 9整合素在细胞、组织中的表达，因此， 还能够作为诊断药使用。
图IA是表示分析抗人α 9整合素抗体(Κ33Ν和Μ35Α)的重链的含有互补性决定区(CDR)的可变区的氨基酸序列的结果的图。图中示出了分别采用两个不同序列分析软件分析Κ33Ν和Μ35Α的结果。图IB是表示分析抗人α 9整合素抗体(Κ33Ν和Μ35Α)的轻链的含有互补性决定区(CDR)的可变区的氨基酸序列的结果的图。图中示出了分别采用两个不同序列分析软件分析Κ33Ν和Μ35Α的结果。图2是表示通过人α 9整合素表达细胞(人黑色素瘤细胞G361)和OPN的α 9整合素结合位点的肽(SVVYGLR)研究抗人α9整合素抗体(本发明的2个克隆(Κ33Ν、Μ35Α)、 其它5个克隆(1K11、21C5、MI11、25B6、28S1)和Y9A2)的细胞粘附抑制效果的结果的图。 作为阴性对照使用了人·骨桥蛋白的单克隆抗体(5A1)。图3是表示通过人α 9整合素表达细胞(人黑色素瘤细胞G361)和肌腱蛋白C片段的α 9整合素结合位点的肽研究抗人α 9整合素抗体(本发明的2个克隆(Κ33Ν、Μ35Α)、 其它5个克隆(1K11、21C5、24I11、25B6J8S1)和Y9A2)的细胞粘附抑制效果的结果的图。 作为阴性对照使用了人·骨桥蛋白的单克隆抗体(5A1)。 图4是表示研究新型抗人α 9整合素抗体(Κ33Ν)和Υ9Α2对人α 9整合素表达细胞进行竞争反应的结果的图。
具体实施例方式[发明经过情况]2004年11月，作为α 4整合素抗体的Tysabri (注册商标)(natalizumab)，生物基因艾迪克公司(Biogen Idec Inc.，美国马萨诸塞州)和Elan公司(Elan Corporation, 爱尔兰)以作为多发性硬化症治疗药获得美国食品药品管理局(FDA)的批准。而且， Tysabri (注册商标)在以克罗恩氏病、风湿性关节炎等疾病为对象进行临床开发。此外，所谓P4C2的抗人α 4β 1整合素单克隆抗体得到实验室水平的应用。但是，α 9整合素的抗体中，对人和豚鼠的α 9整合素显示出特异性的被称为Υ9Α2 的单克隆抗体(A. Wang et al.，(1996)Am. J. Respir. ,Cell Mol. Biol. 15，664-672)已供于实验用途，但并未应用于临床。本发明中，通过注意以下方面并深入研究，能够获得药效可望更加优良的人α 9 整合素的新型抗体。(1)人α 9整合素过量表达株的制备为了制备α 9整合素的抗体，向作为小鼠成纤维细胞的ΝΙΗ-3Τ3细胞中导入基因， 建立过量表达人α 9整合素的细胞株，以该细胞作为抗原对小鼠进行免疫。(2)杂交瘤的筛选为了从经由细胞融合所得到的各种杂交瘤中有效地获得只与人α 9整合素发生反应的克隆，使用在CHO-Kl细胞中表达了相同整合素家族的人α 4整合素的细胞，选拔与其它整合素不显示交叉反应性并与亲细胞(CHO-Kl)的细胞表面抗原不反应的克隆，由此有效地获得与人α9整合素发生特异性反应的抑制抗体。[本发明的抗α9整合素抗体]本发明提供一种人α9整合素的单克隆抗体。本发明中，所谓“抗体”是指可以与作为抗原的α9整合素或者其部分肽进行特异性结合的抗体分子整体或其片断(例如， Fab, Fab'、F(ab' )2等片断)，既可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。在本发明中， 优选是指单克隆抗体。而且，本发明中的“抗体”包括嵌合抗体、人源化抗体、人抗体。本发明中，所谓抗体与某蛋白质或其片断“特异性地进行结合”，意思是指该抗体以实质上高的亲和性(高于对其它氨基酸序列的亲和性)与这些蛋白质或其片断的特定氨基酸序列进行结合。在此，所谓“实质上高的亲和性”，是指基于所需测定装置或者方法可使该特定氨基酸序列与其它氨基酸序列有区别地测定出来的程度上的高的亲和性；典型的是指下述结合亲和性结合常数(Ka)至少为lOl1，优选至少为IO8Mi更优选为IO9Mi进一步再优选为IOiqM-1UO11M-1UO12M-1或其以上，例如最高为101 .1或其以上。本发明中，“单克隆抗体”是指对抗原有高度特异性，识别单一抗原的单克隆抗体。本发明中，所谓“抗体片断”是指全长抗体(whole antibody)的局部，其为抗原结合区或者可变区。例如，抗体片断包括Fab、Fab'、F(ab'片断。这些抗体片断能够通过抗体的木瓜蛋白酶消化、胃蛋白酶消化等通常公知的方法制备。上述所谓“嵌合抗体”是指采用基因工程学技术将本发明中所得到的抗人α 9整合素抗体的恒定区改造成具有与人的抗体相同的恒定区的人·小鼠·嵌合抗体(参照欧州专利公开公报ΕΡ0125023)。所谓“人源化抗体”，是指采用基因工程学技术将本发明中所得到的抗人α 9整合素抗体的H链(重链)和L链(轻链)的互补性决定区(CDR)以外的一级结构改造成对应于人的抗体的一级结构的抗体。所谓“人抗体”，是指使用导入了人的抗体产生相关的基因的转基因动物制备的单克隆抗体(参照欧州专利公开公报ΕΡ0546073)。更具体而言，本发明首先提供了与迄今为止所制备的抗人α 9整合素抗体不同的抗人α 9整合素抗体。本发明的优选方式的抗体含有序列号1、3、5、7、9或11的氨基酸序列。更优选的抗体，是具有选自于由序列号1、3、5、7、9和11的氨基酸序列所构成的组中的氨基酸序列中的2个以上、3个以上、4个以上、5个以上或者6个的抗人α 9整合素抗体。另外，本发明的其它方式的抗体，含有序列号2、4、6、8、10或12的氨基酸序列。更优选的抗体，是选自于由序列号2、4、6、8、10和12的氨基酸序列所构成的组中的氨基酸序列中的2个以上、3个以上、4个以上、5个以上或者6个的抗人α 9整合素抗体。本发明中，特别优选的抗体是由保藏号FERM ΒΡ-10830或FERM ΒΡ-10831所标记的杂交瘤细胞产生的抗人α 9整合素抗体。下面，详细说明抗α 9整合素单克隆抗体的制备，但该抗体的制备并不限于此。[α 9整合素(抗原)]本发明中，作为抗原使用的α 9整合素，可以是⑴来自人、其它哺乳动物的表达 α 9整合素的所有细胞或存在这些细胞的所有组织的蛋白质；(2)将编码α 9整合素的基因 DNA、优选cDNA导入细菌、酵母、动物细胞等细胞株中而得以表达的重组蛋白质；还可以是 ⑶合成蛋白质。另外，本发明的α 9整合素，还包括与各种哺乳动物的α 9整合素的氨基酸序列、 特别优选与人α9整合素的氨基酸序列(序列号13)具有实质上相同的氨基酸序列的多肽。在此所谓“具有实质上相同的氨基酸序列的多肽”，是指只要具有与天然型α 9整合素、特别优选来自人的α 9整合素实质上相同的生物学的性质即可，可以是具有该氨基酸序列中的多个氨基酸、优选1 10个氨基酸、特别优选1 多个(例如，1 5个、1 4 个、1 3个、1 2个)的氨基酸被取代、缺失和/或被修饰的氨基酸序列的突变多肽，以及具有该天然型α 9整合素、特别优选来自人的α9整合素的氨基酸序列中被加成有多个氨基酸、优选为1 10个氨基酸、特别优选1 多个(例如，1 5个、1 4个、1 3个、 1 2个)氨基酸的氨基酸序列的突变多肽。并且，还可以具有取代、缺失、修饰及加成中的多个的突变多肽。本发明的α9整合素、尤其是来自人的α 9整合素，除了基因重组技术之外，还可通过适当使用诸如化学合成法、细胞培养方法等本技术领域中公知的方法或其修饰方法来制备。另外，作为突变多肽的制备方法，例如，可以举出合成寡核苷酸介导点突变法 (缺口双链法gapped duplex)、通过亚硝酸或亚硫酸处理随机导入点突变的方法、通过 Bal31酶等制备缺失突变体的方法、盒式突变(cassette mutagenesis)法、接头分区法、错误掺入(misincorporation)法、错配引物(mismatch primer)法、DNA片段合成法等。另外，本发明的α9整合素还包括该α9整合素的“局部”。在此所谓“局部”，是指含有用于与0ΡΝ、肌腱蛋白C、VCAM-I等α 9整合素配体结合所必需的区域的部分。该α 9 整合素的“局部”，还可以按后述本技术领域中公知的方法或其修饰方法通过基因重组技术或化学合成法进行制备，还可以通过蛋白质分解酶等将采用细胞培养方法分离的α 9整合素、特别优选来自人的α 9整合素进行适当切断来制备。作为抗原，还能够使用通过重组技术在细胞膜上过量表达α 9整合素的细胞自身或其膜组分等。本发明的α 9整合素，还包括具有与人α 9整合素的氨基酸序列(序列号13)实质上相同的氨基酸序列的多肽。并且，尤其是在本发明中优选使用通过重组技术在细胞膜上过量表达人α 9整合素的细胞自身。因此，还存在后述的情况采用公知的基因工程学技术克隆编码人α 9整合素的基因(例如cDNA)，制备在细胞膜上过量表达人α 9整合素的细胞自身或其细胞膜组分以作为抗原。[抗体产生细胞的制备]将抗原自身或与载体、稀释剂一起给药于通过对被免疫的动物给药而可产生抗体的部位。在给药时，为了提高抗体产生能力，也可以给药弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂。通常每1 6周给药1次，总计进行2 10次左右。作为所用的温血动物，例如，可以举出小鼠、猴、兔、狗、豚鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、山羊、鸡等，但本发明中优选使用小鼠。当治疗对象是人并且产生α 9整合素抑制抗体的动物是小鼠时，优选使用人·小鼠的嵌合抗体或人源化抗体，更优选使用通过导入与抗体产生相关的人基因的小鼠等转基因动物所制备的人单克隆抗体。[抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合]作为骨髓瘤细胞，可使用来自小鼠、大鼠、人等的细胞。例如，可以举出小鼠骨髓瘤 P3U1、P3X63-Ag8、P3X63_Ag8_Ul、P3NS1-Ag4, SP2/0_Agl4、P3X63_Ag8_653 等，但优选抗体产生细胞与骨髓瘤细胞来自同种动物，特别优选来自同血统的动物。骨髓瘤细胞可冷冻保存，或通过用添加了马、兔或胎牛血清(FBQ的通常的培养基进行传代而保持繁殖。在细胞融合时优选使用对数增殖期的细胞。本发明中优选使用P3X63-Ag8-653。作为抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合而形成杂交瘤的方法，可以举出使用聚乙二醇(PEG)的方法、使用仙台病毒的方法、使用电融合装置的方法等。例如，当采用PEG法时， 可将脾细胞和骨髓瘤细胞以1 10 1、优选为5 10 1的混合比悬浮于含有约30 60%的PEG(平均分子量1000 6000)的适当的培养基或缓冲液中，在温度约25 37°C、 PH6 8的条件下，使发生反应约30秒 3分钟左右。反应结束后，去除PEG溶液，再悬浮于培养基中，接种于细胞孔板中，继续进行培养。[杂交瘤细胞的挑选]产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的挑选，可以依照公知的方法或基于公知的方法来进行。通常，可通过添加了 HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)的动物细胞用培养基来进行。作为挑选和繁殖用培养基，只要杂交瘤细胞能够生长发育的培养基即可使用。例如，可使用含有1 20%、优选10 20%的胎牛血清的RPMI 1640培养基、含有1 10%的胎牛血清的GIT培养基(和光纯药工业株式会社)或杂交瘤培养用无血清培养基 (SFM-101，日水制药株式会社)等。培养温度通常为20 40°C、优选为约37°C。培养时间通常为5天 3周、优选为1周 2周。培养通常可在5% CO2下进行。本发明的单克隆抗体的产生，可以使用《新临床免疫实验操作法(第三部分)》 (1997年，科学评论社)所记载的细胞ELISA法进行确认和筛选。当预测若将在免疫中所用的细胞用于筛选则背景增高、假阳性增多时，能够将下述克隆作为抗人α 9整合素的抗体 与在免疫中所用细胞之外的细胞中过量表达的人α9整合素反应且与过量表达人α4整合素的细胞不反应的克隆。对这种克隆反复进行1 5次、优选2 4次有限稀释法，由此能够制备单克隆抗体。[抗体的分离纯化]所得到的抗体，可以进行纯化直至均勻。抗体的分离、纯化可以使用通常蛋白质所使用的分离、纯化方法。例如，适当选择、组合亲和色谱(法)等的色谱柱、过滤、超滤、 盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳等，可以分离、纯化抗体(Antibodies =A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988), 但并不限定于这些。作为在亲和色谱(法)中使用的柱，可以举出蛋白质A柱、蛋白质G 柱。例如，作为使用蛋白质A柱的柱，可以举出Hyper D.P0R0S,Sepharose F. F. (Amersham Biosciences)等。[抗体的标记化]通过采用公知的方法或者市售的试剂盒，能够对所得到的抗体进行各种标记化 (例如，生物素标记、FITC标记、APC标记)。本发明中，优选采取使用Biotin Labeling Kit (同仁化学)的生物素标记。通过如此操作所得到的单克隆抗体，根据需要纯化后，按照常规方法制剂化，能够作为癌、炎症性疾病、传染病、自身免疫性疾病和骨病等的预防和/或治疗剂使用。作为这些预防和/或治疗剂的剂型，能够制成注射剂、点滴用剂等非口服制剂，也能够通过创意设计制成口服制剂来使用。并且，当进行制剂化时，在药事(药剂)上以及药学可接受的范围内，能够使用适于剂型的载体、稀释剂或添加剂等。[抗体的药理学的效果]现已逐步明确整合素的作用不仅在于粘附、固定细胞与细胞外基质(ECM)而且还将来自细胞外基质的信息转换为细胞内信号，负责调节细胞的增殖、运动、细胞死亡、分化等。因此，所得到的单克隆抗体，由于能够通过抑制ECM与α9整合素的结合来阻断来自 ECM的信息的细胞内信号传递，所以可治疗与ECM相关的疾病。作为与α 9整合素结合的 ECM和α9配体，已知有0ΡΝ、纤连蛋白、前肽-血管性血友病因子(pp_vWF)、组织型转谷氨酰胺酶(tTG)、第XIII凝血因子、血管细胞粘附分子(VCAM-1 =Vascular Cell Adhesion Molecule-1)、肌腱蛋白C、纤溶酶等。使用这些ECM与表达α 9整合素的细胞、癌细胞，通过体外(in vitro)观察在所得到的单克隆抗体的存在下的结合抑制，能够发现本发明的单克隆抗体的对象疾病。[含有抗体的医药]以本发明的抗体(尤其是单克隆抗体)作为有效成分的制剂，能够用作癌(例如癌细胞的增殖、转移)、炎症性疾病(例如风湿性关节炎、变形性关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维症、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化症、炎症性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩氏病))、 传染病(例如，肝炎)、自身免疫性疾病(例如系统性红斑狼疮、多发性肌炎、自身免疫性甲状腺疾病、肾小管间质性肾炎、重症肌无力症)和骨病(例如骨质疏松症)等的治疗剂 (therapeutic agent)或者预防剂(prophylactic agent)。给药量，根据给药对象、对象疾病、症状、给药途径等而不同，例如，在用于癌患者的预防和/或治疗时，作为本发明抗体的1次用量，通常适合为0. 01 20mg/kg体重左右、 优选为0. 1 10mg/kg体重左右，更优选为0. 1 5mg/kg体重左右，并以每月1 10次左右、优选为每月1 5次左右来通过静脉注射给药。在其它的非口服给药和口服给药时，可按上述用量给药。在症状特别严重时，还可以根据其症状加大用量或增加给药次数。本发明的抗体，能够将其自身直接或作为适当的医药组合物进行给药。上述给药所用的医药组合物，包括上述抗体或其盐以及药理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这种组合物，可以制成适于非口服给药或口服给药的剂型来提供。S卩，作为用于非口服给药的组合物，例如，可以使用注射剂、滴鼻剂、栓剂等，注射剂包括静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂型。这种注射剂，可按照公知的方法来制备，例如，通过采用通常注射剂所用无菌水性或油性液来溶解、 悬浮或者乳化上述抗体来制备。作为注射用的水性液，例如，可以使用生理盐水，含有葡萄糖、蔗糖、甘露醇、其它辅助药的等渗溶液等，还可以并用适当的增溶剂，诸如醇类(例如乙醇)、多元醇类(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如吐温(聚山梨醇酯)80、 吐温20、HC0-50(氢化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加合物(adduct))]等。作为油性液，例如，可以使用芝麻油、大豆油等，可以并用苯甲酸苄酯、苄醇等作为增溶剂。制备的注射液， 通常装入适当的安瓿、小瓶(vial)、注射器中。直肠给药时所用的栓剂，通过将上述抗体与通常的滴鼻药用基剂、栓剂用基剂混合来制备。另外，通过对上述抗体添加适当的赋形剂并制成冻干制剂，在使用时，可用注射用水、生理盐水等溶解后作为注射液。此外，由于抗体等蛋白质在口服给药时通常被消化器官分解，因此难以口服给药，但通过在抗体片断或修饰的抗体片断和剂型方面进行创意设计，也有口服给药的可能性。上述的非口服用医药组合物，优选制备成适于活性成分的给药量的给药单位的剂型。作为这种给药单位的剂型，可以举出注射剂(安瓿、小瓶、预充式注射器)、滴鼻剂、栓剂等，各给药单位剂型分别通常含有5 500mg的上述抗体，尤其是注射剂优选含有5 IOOmg的上述抗体，其它剂型优选含有10 250mg的上述抗体。另外，前述的各组合物，只要与上述抗体的配合不产生不良的相互作用，就可以含有其它活性成分。例如，本发明的医药制剂，除了上述抗体之外还可以含有抗人α4整合素抗体。对此时的混合比例并没有特别限定，例如，可调节抗人α 9整合素抗体抗人α 4整合素抗体的比率处于1 99 99 1的比率范围内。[含有本发明的单克隆抗体的诊断剂]含有本发明的单克隆抗体的医药组合物，可以用作炎症性疾病、例如，风湿性关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维症、糖尿病、癌转移、动脉硬化、多发性硬化症、肉芽肿等的诊断剂以及抑制器官移植后的慢性排斥反应、系统性自身免疫疾病·红斑狼疮·葡萄膜炎·白塞病(Behcet’ s disease) ·多发性肌炎·系膜增殖性肾炎·结节病等自身免疫性疾病的诊断剂。本发明的单克隆抗体，能够特异性识别α9整合素，因此，可以用于待测液中的α9 整合素的定量、尤其是夹层免疫测定法、竞争法或免疫测量法等进行的定量等。当各上述免疫学的测定法应用于本发明的测定方法时，不需要设定特别的条件、操作等。可以在各方法的常规条件、操作法的基础上再加上本领域技术人员通常的技术性考虑来构建测定系统。 这些通常的技术方法的详细内容，可以参照总论、书籍等。如上所述，通过使用本发明的抗体，可以高灵敏度地定量α 9整合素。并且，通过采取使用本发明的抗体的、生物体内的α 9整合素的定量法，能够进行与α 9整合素相关的各种疾病的诊断。例如，在检测到α 9整合素的浓度的增减时，可以诊断为与α 9整合素相关的疾病，例如炎症性疾病的可能性高或者将来患这种病的可能性高。另外，本发明的单克隆抗体，能够用于特异性检测存在于体液、组织等待测对象中的α 9整合素。而且，还可以在用于纯化α 9整合素的抗体柱的制备、包含于纯化时的各组分中的α 9整合素的测定、待测细胞内α9整合素的行迹变动分析等中使用。[抑制人α9整合素活性的化合物的筛选方法]通过利用本发明的抗体所识别的人α 9整合素上的抗原表位(抗原决定簇)，能够筛选抑制人α 9整合素活性的化合物。具体而言，本发明提供一种抑制人α 9整合素活性的低分子化合物的筛选方法，其特征在于，使用含有人α9整合素的氨基酸序列的肽(下称 1太 Α”)。在本发明的筛选方法中，例如，对下述⑴与(ii)进行比较(i)使肽A与人α 9 整合素的配体(例如肌腱蛋白C、纤溶酶等)接触的情况；(ii)使肽A与配体和试验化合物接触的情况。关于工序⑴和(ii)的比较，例如，通过测定配体与肽A的结合量来进行。 为了容易比较上述结合量，优选使用已采用公知的方法标记的配体。对于采用这种方法所得到的备选化合物，进行确认是否抑制人α 9整合素活性的实验，从而获得抑制人α 9整合素活性的化合物。在此，作为待测物质，可以使用多肽、蛋白质、来自生物体的非肽化合物、合成化合物、微生物培养物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液等，既可以是新型化合物，也可以是公知的化合物。所选择的化合物，与本发明的抗体同样可用作癌、炎症性疾病、传染病、自身免疫性疾病和骨病等的预防和/或治疗剂。下面结合实施例进一步详细说明本发明，但本发明的范围并不局限于此。实施例实施例1[抗人α9整合素抗体的制备]抗人α 9整合素抗体的制备，按下述操作对3只BALB/c小鼠进行免疫。首先，将人α9整合素表达细胞(人α 9/ΝΙΗ-3Τ3细胞)以3 X IO6细胞/只进行腹腔内给药，再在此1周后和2周后，将人α 9/ΝΙΗ-3Τ3细胞以3X IO6细胞/只进行腹腔内给药。进而在1 周后，将人α9/ΝΙΗ-3Τ3细胞以2Χ106细胞/只进行静脉内给药。将与人α 9/CH0-K1细胞和内源性表达人α 9整合素的人黑色素瘤细胞株(G361细胞)反应且与表达人α 4整合素的CHO-Kl细胞不反应的克隆作为抗α 9整合素抗体。其结果建立了产生抗人α 9整合素抗体的杂交瘤细胞的2个克隆(Κ33Ν、Μ35Α)。在此所得到的杂交瘤细胞Κ33Ν和Μ35Α，于2007年5月29日，分别以保藏号FERM ΒΡ-10830和FERM ΒΡ-10831，保藏于日本茨城县筑波市东1 丁目1番地1、中央第6 (邮政编码305-8566)、独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心。实施例2[抗人α9整合素抗体的互补性决定区(OTR)的分析]从产生人α 9整合素抗体(Κ33Ν、Μ35Α)的杂交瘤中提取mRNA，经过逆转录制备cDNA。以该 cDNA 为模板，使用 kFv 克隆用引物(Light Primer Mix、Heavy Primer Mix, 7 * \ Λ KJ才寸4工> 7社(Amersham Biosciences公司)制造)进行PCR，分别延长、扩增抗体的重链和轻链的可变区。接着，基于常规方法将PCR产物嵌入pCRII TOPO载体中。对其进行测序而确定氨基酸序列。对于各抗体分别进行3次上述操作。其结果，K33N和M35A的重链和轻链的可变区和⑶R区的氨基酸序列，如图IA和图IB所示。CDR区的氨基酸序列，具体而言，如下所示。(重链)[CDRH1]K33N SYYMN (序列号 1)M35A SYffIH (序列号 2)[CDRH2]K33N WIFPGSGNTKYNEKFKGK (序列号 3)M35A :EINPSSGRTNFIENFETK(序列号 4)[CDRH3]K33N SffVSYERGYYFDY (序列号 5)M35A =LAYGNYSffFAY (序列号 6)(轻链)[CDRL1]K33N RASENIYYSLA (序列号 7)M35A :RASETVDSYGNTFMH(序列号 8)[CDRL2]K33N :NANSLED(序列号 9)M35A :LASNLES(序列号 10)[CDRL3]K33N :KQAYDVPYT(序列号 11)M35A :QQNNEDPYT (序列号 12)此外，图IA和图IB中还表示出采用不同于上述序列分析方法(GTS)的分析方法 (不同的序列分析软件)所获得的序列(JNBio和Takara)。各方法的详细内容如下所述。[JN Biosciences 的序列分析法(K33N)]采用含有10%胎牛血清(FBS(fetal bovine serum), HyClone 公司制造)的 TIL Media I培养基(免疫生物研究所)在7. 5% C02、37°C环境下培养杂交瘤细胞(K33N)使其增殖。总RNA(总核糖核酸)，依照hvitrogen公司的规程(protocol)使用TRIzol试剂anvitrogen公司制造)，从约3X106个的杂交瘤细胞中提取。对基于使用01igO-dT 引物(寡聚脱氧胸苷引物)的逆转录反应的cDNA的制备而言，采用了 GeneRacer试剂盒 (Invitrogen公司制造)，依照了 hvitrogen公司的规程。重链和轻链的可变区cDNA，使用分别相当于小鼠恒定区Yl和κ的3'引物和GeneRacer试剂盒附带的GeneRacer 5'引物(5 ‘ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3 ‘(序列号 14))，并使用 Phusion DNA 聚合酶(New England Biolabs公司制造)，采用PCR进行扩增。用于重链可变区(VH)的PCR扩增的3' 引物是5 ‘ -GCCAGTGGATAGACAGATGG-3 ‘(序列号15)。用于L链可变区(VL)的PCR扩增的3 ‘引物是5 ‘ -GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3 ‘(序列号16)。将扩增后的VH和VL的 cDNA通过pCR4Blunt-T0P0载体(Invitrogen公司制造)中进行亚克隆以确定序列。采用 Tocore (Menlo Park)进行了可变区的DNA序列分析。[Takara 的序列分析法(M35A)]在培养、增殖杂交瘤细胞(M35A)后，使用RNAiso(夕力，八4才社(TaKaRa Bio Inc.，宝生物株式会社)制造)，以酸-异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法(Acid Guanidine-Phenol-Chloroform法，AGPC法)提取细胞的总RNA。所提取的RNA以常规方法进行DNase I处理(脱氧核糖核酸酶I处理)，然后进行苯酚氯仿处理，去除DNase I，基于乙醇沉淀法进行纯化。使所得到的RNA再次悬浮于蒸馏水中用于分析。将DNase I处理后的约IygW RNA作为模板使用随机引物Random Primer (9mer)通过逆转录酶Reverse Transcriptase M-MLV (核糖核酸酶RNase H free)进行逆转录反应。对于可变区的PCR扩增而言，以各逆转录反应液的一部分作为模板，并且重链使用引物Heavy Primer 1和Heavy Primer 义社制造)，轻链则使用引物Light Primer Mix( 了
才寸4工社制造)，而PCR酶则使用TaKafci LA Taq(夕力，”^才社制造)。采用琼脂糖凝胶对由PCR所得到的DNA片断进行电泳，切出条带并将凝胶溶解出来，由此进行DNA的纯化。将纯化的DNA进行TA克隆于pMD20_T载体上。可变区的DNA序列分析，通过使用PMD20-T载体中所含的M13-47引物序列来确定基因序列。对于测序反应 (^iiSiS ) ^ffi BigDye Terminators v3. 1 cycle sequencing kit (BigDyeV3. 1 的循环测序试剂盒，”勹八卜才* 7歹Λ文社(Applied Biosystems, Inc.)制造)， 并依照同社的规程，通过ABI3730序列发生器(定序器)(？/，^ F 才歹Λ文社 (Applied Biosystems, Inc.)制造)来实施。根据图IA和图IB可知，在基于所使用的分析方法(或者分析软件)所得到的序列中，可见稍微有所不同，但对于CDR的氨基酸序列而言，未见到由分析方法的不同引起的差异。实施例3[抗人α9整合素抗体的细胞粘附抑制效果]在细胞粘附时，α 9整合素与包括0ΡΝ、纤连蛋白、肌腱蛋白C、VCAM-1等的细胞外基质(ECM)的配体结合，因此通过抑制α 9整合素表达细胞(人黑色素瘤细胞G361)与配体的结合，研究了对所得到的新型抗人α 9整合素抗体的细胞粘附抑制。OPN肽使用了结合有BSA(牛血清白蛋白)的SVVYGLI^i ；TN_C fn3 (RAA)使用了在大肠杆菌中对人肌腱蛋白-C的纤连蛋白III的重复序列(Fibronectin TypeIII repeat) 的第三区域所表达的蛋白(将该区域内的RGD序列转换为RAA序列)。将OPN肽或者肌腱蛋白C片段(TN-C fn3 (RAA)) (5 μ g/mL)在96孔培养板中、37°C 下放置1小时后，以0. 5% BSA/PBS进行封闭。用0. 25% BSA/DMEM培养基调节人黑色素瘤细胞G361以使其形成为IX IO5个/mL，并添加各浓度的抗人α 9整合素抗体。将添加了抗体的G361细胞分别以200 μ L加入到固相的96孔培养板中，在37°C下反应1小时。用PBS 清洗2次后，接着用0.5%结晶紫/20%甲醇对粘附细胞进行固定、染色。用蒸馏水清洗3次后，用20%醋酸溶解，测定590nm中的吸光度。此外，作为阴性对照使用了人·骨桥蛋白的单克隆抗体(5A1)；作为阳性对照使用了预先制备的5种抗人α 9整合素抗体(1K11、21C5、 24I11、25B6、28S1)。抗人α 9整合素抗体对OPN肽与G361细胞的粘附的影响结果示于图2中，抗人 α 9整合素抗体对肌腱蛋白C片段与G361细胞的粘附的影响结果示于图3中。在OPN肽与G361细胞的粘附中，Μ35Α与阴性对照5Α1以及阳性对照1Κ11、25Β6、 28S1同样地，细胞粘附抑制的效果小。另一方面，Κ33Ν与阳性对照21C5、24I11相比，少量即可抑制细胞粘附，显示出与Y9A2同等的细胞粘附抑制效果。在肌腱蛋白C片段与G361 细胞的粘附中，M35A的细胞粘附抑制效果小，K33N少量即可抑制细胞粘附，其细胞粘附抑制效果与Y9A2相同程度地明显强于阳性对照21C5、24I11。如此，尤其是K33N，与其它抗体相比，显示出特别明显的细胞粘附抑制效果。实施例4[抗人α9整合素抗体的识别位点的差异]新制备的抗人α 9整合素抗体Κ33Ν的细胞粘附抑制效果，显示出与Υ9Α2同样的行迹变动，因此，通过采用FACS测定两种抗体对人α 9整合素表达细胞(h α 9/CH0)的竞争反应，研究了识别位点的差异。在生物素标记的Κ33Ν或Υ9Α2 (5 μ g/mL、100 μ L)中添加其100倍量的K33N、Y9A2、 阴性对照 IgG (0. 5mg/mLU00y L)后，与人 α 9 整合素细胞(h α 9/CH0、1 X 107/mL、100 μ L) 发生反应G°C、30分钟)，用FACS缓冲液(0. 5% BSA/PBS)清洗细胞。将链霉亲和素标记 APC (0. 5 μ g/mL、100 μ L)添加于细胞溶液中，以4°C、20分钟的条件发生反应。再次用FACS 缓冲液清洗细胞后，使用7-AAD(0.05mg/mL、20yL)对死亡细胞进行染色。然后，再次用 FACS缓冲液清洗，采用FACS测定了细胞。如图4所示，若使生物素标记Y9A2和无标记Y9A2对人α 9整合素表达细胞发生竞争反应，则结合有荧光物质的细胞明显减少至接近背景，但在生物素标记Υ9Α2与无标记 Κ33Ν共存的情况下，可见结合了荧光物质的细胞减少，但没有减少至接近背景。另一方面， 若在生物素标记Κ33Ν中添加无标记Κ33Ν，则对人α 9整合素表达细胞进行竞争，结合有荧光物质的细胞明显减少，但在添加无标记Κ33Ν之前，即使添加无标记Υ9Α2，结合有荧光物质的细胞也没有减少。因此，若Υ9Α2和Κ33Ν识别相同抗原表位则显示有竞争，但由于未显示出完全的竞争，所以表明Υ9Α2和Κ33Ν识别不同的抗原表位而不是相同的抗体。工业实用性本发明的抗α 9整合素抗体，显示出优良的α 9整合素功能抑制作用，并起到治疗癌(例如癌细胞的增殖、转移)、炎症性疾病(例如风湿性关节炎、变形性关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维症、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化症、炎症性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩氏病等))、传染病(例如肝炎)、自身免疫性疾病(例如系统性红斑狼疮、多发性肌炎、自身免疫性甲状腺疾病、肾小管间质性肾炎、重症肌无力症)和骨病(例如骨质疏松症)等治疗效果。并且，含有本发明的抗α 9整合素抗体和抗α 4整合素抗体这两者的医药组合物，起到进一步得到改善的治疗癌、炎症性疾病等的治疗效果。本发明的抗体，能够在病理学上检测细胞或组织中α 9整合素的表达，因此还可以作为诊断药来加以利用。
权利要求
1.一种抗人α 9整合素抗体，其含有序列号1 12中的任一个氨基酸序列。
2.一种抗人^9整合素抗体，其含有序列号1、3、5、7、9或11的氨基酸序列。
3.一种抗人α 9整合素抗体，其含有序列号1、3、5、7、9和11的氨基酸序列。
4.一种抗人α 9整合素抗体，其含有序列号2、4、6、8、10或12的氨基酸序列。
5.一种抗人α 9整合素抗体，其含有序列号2、4、6、8、10和12的氨基酸序列。
6.一种抗人α 9整合素抗体，其含有作为重链的互补性决定区⑶RH中的氨基酸序列的序列号1 6中的任一个氨基酸序列、作为轻链的互补性决定区CDRL中的氨基酸序列的序列号7 12中的任一个氨基酸序列。
7.如权利要求1 6中任一项所述的抗人α9整合素抗体，其抑制人α 9整合素与α 9 整合素的配体的结合。
8.如权利要求1 7中任一项所述的抗人α9整合素抗体，其为单克隆抗体。
9.如权利要求1 8中任一项所述的抗人α9整合素抗体，其为嵌合抗体
10.如权利要求1 8中任一项所述的抗人α9整合素抗体，其为人源化抗体。
11.如权利要求1 8中任一项所述的抗人α9整合素抗体，其为人抗体。
12.—种抗人α 9整合素抗体，其由保藏号FERM ΒΡ-10830或FERM ΒΡ-10831所标记的杂交瘤细胞产生。
13.一种癌、炎症性疾病、传染病、自身免疫性疾病或骨病的治疗剂，其作为有效成分含有权利要求1 12中任一项所述的抗人α 9整合素抗体。
14.一种癌、炎症性疾病、传染病、自身免疫性疾病或骨病的治疗剂，其作为有效成分含有权利要求1 12中任一项所述的抗人α 9整合素抗体和抗人α 4整合素抗体两者。
15.一种癌、炎症性疾病、传染病、自身免疫性疾病或骨病的诊断剂，其作为有效成分含有权利要求1 12中任一项所述的抗人α 9整合素抗体。
16.一种细胞，其产生权利要求1 12中任一项所述的抗人α整合素抗体。
17.一种杂交瘤细胞，其标记为保藏号FERM ΒΡ-10830或FERM ΒΡ-10831。
18.—种抑制α 9整合素活性的化合物的筛选方法，其特征在于，使用含有α 9整合素的氨基酸序列的肽。
全文摘要
本发明涉及抗人α9整合素抗体，更具体而言是特异性识别人α9整合素的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及人抗体；产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞；上述单克隆抗体的制备方法；上述杂交瘤细胞的制备方法；含有上述抗人α9整合素抗体的治疗剂；含有上述抗人α9整合素抗体的诊断剂；抑制人α9整合素活性的化合物的筛选方法等。
文档编号G01N33/15GK102325796SQ20098015734
公开日2012年1月18日 申请日期2009年2月23日 优先权日2009年2月23日
发明者上出利光, 今重之 申请人:株式会社遗传科技