专利名称：含有作为活性成分的硫氧还蛋白-1的乳腺癌诊断标记物及使用所述硫氧还蛋白-1的乳腺 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有作为活性成分的硫氧还蛋白-1的乳腺癌诊断标记物，以及使用所述硫氧还蛋白-1的乳腺癌诊断试剂盒。
背景技术：
目前提到的乳腺癌的各种病因包括女性荷尔蒙、癌症史、家族史、没有生育、饮食习惯等，但是迄今为止没有证明乳腺癌与这些病因之间的明确关系。近年来，报道韩国的乳腺癌病例迅速增加。一份韩国的统计学调查报告显示1998年乳腺癌病例超过宫颈癌病例， 并且2001年乳腺癌病例占女性癌症病例的16. 1%，超过胃癌排名第一。此外，2001年和 2002年之间乳腺癌的发病率为11. 1%，大于其他癌症的发病率。现在，认为乳腺癌的高发病率与多种因素有关。所述多种因素包括低出生率、短期母乳喂养、初潮早、绝经晚、饮食习惯西化以及生活环境的污染。另外，当女性发生生理上的活跃改变时，受迅速增加的女性荷尔蒙刺激的女性的腺体组织敏感性增加，这些女性个体会面临更大的患乳腺癌的可能性。考虑到由于生活方式西方化的趋势，预测韩国乳腺癌的发病率和乳腺癌的死亡率在将来相当长的时间内会增加。如同其它癌细胞那样，随着癌细胞的生长，乳腺癌细胞通常渗透到邻近的组织或转移到淋巴结中。在大多数乳腺癌的病例中，患者具有非常少的可检测症状，她们也不自我检查乳房。因此，有效地诊断早期乳腺癌对于降低乳腺癌的死亡率是非常重要的。对于乳腺癌的诊断而言，联合采用了各种方法。到目前为止，乳房自我检查已占乳腺癌病例的70%。然而，通过乳房自我检查区别恶性乳腺肿瘤和良性肿瘤是不可能的。已采用了一些乳腺癌筛查检测，包括X-射线乳房摄影、超声波、细针抽吸细胞学检查以及磁共振成像。最终，采用活体组织检查来诊断乳腺癌。用于乳腺癌的乳房摄影筛查使用χ-射线来检查乳房。乳房摄影有效确定乳房肿瘤是良性还是恶性，并且可检测隐藏的肿瘤。这种方法是在自我检查乳房检测到肿块之前可诊断早期乳腺癌的最有效的技术之一。然而，乳房摄影是有缺陷的，因为，对乳腺高度发达或者具有大量纤维组织的小而致密的乳房(如年轻女性的乳房)的诊断精确度降低。此外，存在这样的争议由于辐射，更加频繁的乳房摄影使得乳腺癌的风险显著增加。采用超声波检查法作为乳房摄影的代替技术。超声波检查法可有效地区别囊肿(cystis)和肿块(lumps)，但是无法有效地告知恶性肿瘤和良性肿瘤。为了补充这些乳房筛查方法，已经尝试使用血液肿瘤标记物水平来诊断乳腺癌。 尽管研究了作为诊断因素或预后因素的血液肿瘤标记物水平的值，但传统肿瘤标记物的使用受到限制，也没有官方推荐的乳腺癌标记物。硫氧还蛋白(Trx)是12kDa的氧化还原酶，所述12kDa的氧化还原酶在依赖NADPH 的反应中通过硫氧还蛋白还原酶而保持在还原状态。有两种哺乳动物硫氧还蛋白硫氧还蛋白I(Trxl)和硫氧还蛋白2(Trx2)。硫氧还蛋白作为过氧化物酶的电子供体起作用，因此，例如，可除去有毒的过氧化氢。硫氧还蛋白也为核糖核苷酸还原酶提供电子。在细菌中硫氧还蛋白在将转录元件结合至DNA方面发挥作用，而硫氧还蛋白影响真核生物中的 NF-kB(核转录因子kB)的活性。因此，硫氧还蛋白与细胞死亡和肿瘤细胞相关，并且在调节肿瘤细胞的生长方面发挥重要作用。作为一般的二硫化物氧化还原酶的硫氧还蛋白通过氧化还原机理促进其它蛋白还原，从而恢复蛋白质的正常功能，所述氧化还原机理基于二硫化物与两个半胱氨酸巯基基团之间的可逆还原反应。在哺乳动物的细胞中，硫氧还蛋白 1和硫氧还蛋白2也参与调节氮氧化物的水平，由此参与细胞死亡。因此，与许多疾病的发生有关的酶具有潜在的重要性，所述疾病包括炎症性疾病、心力衰竭、癌症等。抗硫氧还蛋白抗体的免疫组化分析揭示了硫氧还蛋白在诸如肝脏、结肠、胰腺和宫颈等各种组织的癌细胞中表达，这表明硫氧还蛋白涉及肿瘤形成。需要一种乳腺癌诊断标记物，使得早期乳腺癌得以准确诊断并且做出乳腺癌的预后。在使用硫氧还蛋白1作为乳腺癌诊断标记物方面已进行的研究非常少。
发明内容
技术问题本发明的发明人对乳腺癌的诊断和预后进行了深入和全面的研究，结果发现硫氧还蛋白1在正常乳腺组织中以低水平表达，而在乳腺癌组织中以高水平表达，从而得到了本发明。技术方案本发明提供含有作为活性成分的硫氧还蛋白1的乳腺癌诊断标记物，和使用所述硫氧还蛋白1的乳腺癌诊断试剂盒。
图1是表示通过96孔HMRT qPCR分析法检测的选自不同种族个体的48个不同的人体正常组织中硫氧还蛋白1转录物的表达谱的图。图2是表示通过CSRT 96-1分析法检测的在八种实体肿瘤(乳腺、结肠、肾脏、肝脏、肺、卵巢、前列腺和甲状腺)中硫氧还蛋白1和硫氧还蛋白2的mRNA水平的图。图3是表示在乳腺癌中硫氧还蛋白1和硫氧还蛋白2的mRNA水平㈧的图和由此获得的诱导倍数anduction fold)的水平(B)的图。图4是表示人体乳腺癌中硫氧还蛋白1的mRNA表达的诱导倍数的散点图(A)，表示硫氧还蛋白1的mRNA表达和癌症发展之间的相关性的箱型图(B)，以及表示在细分的癌症(I期、IIA期、IIB期、IIIA期、IIIB期、IIIC期和IV期)中硫氧还蛋白的mRNA表达的诱导倍数的图(C)。图5表示通过蛋白质印迹分析法检测的人体乳腺癌组织中硫氧还蛋白1的表达水平。图6表示通过蛋白质印迹分析法检测的来自不同个体的四个正常组织和四个癌组织中硫氧还蛋白1的表达水平。图7表示通过蛋白质印迹分析法检测的在乳腺组织的配对组中硫氧还蛋白1的表达水平(将来自同一个体的正常组织和初期癌组织配对；将来自同一个体的初期癌组织和转移性癌组织配对)以及在其它癌组织(肺和结肠)的配对组中硫氧还蛋白1的表达水平。
具体实施例方式本发明提供含有作为活性成分的硫氧还蛋白1的乳腺癌诊断标记物。本发明还提供含有抗硫氧还蛋白1的抗体的乳腺癌诊断试剂盒。此外，本发明提供使用硫氧还蛋白1的抗体检测乳腺组织中的硫氧还蛋白1的方法。下文将会给出本发明的详细描述。在本发明中，检测了人体正常组织和癌组织中的硫氧还蛋白1的表达水平。通过 qRT-PCR和蛋白质印迹法检测发现在48个不同的正常人体组织的正常乳腺组织中，硫氧还蛋白1的表达水平最低，并且硫氧还蛋白1在乳腺癌组织中的表达水平比在其它癌组织中的表达水平高。此外，随着癌症进一步发展，硫氧还蛋白1的mRNA表达的诱导倍数越高。因此，硫氧还蛋白1的mRNA表达的诱导倍数在乳腺癌II期至IV期变高，特别是在乳腺癌IV 期，即，转移性乳腺癌。另外，因为硫氧还蛋白1的mRNA表达的诱导倍数随着癌症的发展而增加，硫氧还蛋白1的mRNA表达的诱导倍数与癌症的恶性程度密切相关。因此，硫氧还蛋白1的mRNA表达的诱导倍数与细分的癌症阶段有关。如上所述，发现硫氧还蛋白1在人体乳腺癌组织中过表达，硫氧还蛋白1使乳腺癌得以诊断和预后，因此它作为乳腺癌的诊断标记物是有用的。根据本发明的含有抗硫氧还蛋白1的抗体的乳腺癌诊断试剂盒可使用本发明所述的乳腺癌诊断标记物来容易地制备。本发明的乳腺癌诊断试剂盒可包含特异性结合硫氧还蛋白1的抗体、结合了可与底物反应引起颜色变化的标签物的二级抗体、与所述标签物反应显示颜色的底物溶液、洗脱缓冲液和反应终止缓冲液。结合了二级抗体的标签物优选地是当所述标签物与其底物反应时可引起颜色变化的着色剂。其中的代表性的着色剂是HRP (辣根过氧化物酶)、碱性磷酸酶、胶体金、诸如 FITC(聚L-赖氨酸-异硫氰酸荧光素)和RITC(若丹明-B-异硫氰酸盐)之类的荧光素以及染料。至于底物溶液，其取决于标签物。例子包括TMB (3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺)、 ABTS[2, 2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]和OPD(邻苯二胺)。优选地，提供缓冲溶液形式(0. IM NaOAc, pH5. 5)的着色剂底物。优选地，洗脱溶液中包含磷酸缓冲液、NaCl和吐温20。更优选的是含有0. 02M磷酸缓冲液、0. 13M NaCl和0. 05%吐温20的溶液(PBST)。在使抗体与抗原反应之后，用二级抗体共轭物处理抗原-抗体复合物，接着进行固定，然后用洗脱溶液清洗3次至6次。可使用磺酸溶液停止酶促反应。根据本发明的一种实施方式，乳腺癌的诊断和预后可通过使用特异性结合硫氧还蛋白1的抗体的抗原-抗体反应检测乳腺癌标记物以高准确度容易地预测。例如，在 SDS-PAGE上分离含有硫氧还蛋白1的蛋白制剂，并将所述蛋白制剂转移并固定于固定器 (immobilizer)上，然后用抗硫氧还蛋白1的抗体处理固定器以确定硫氧还蛋白1的表达水平。就是说，当检测目标乳腺组织中硫氧还蛋白1的表达水平时，如果硫氧还蛋白1的表达水平高于正常乳腺组织中硫氧还蛋白1的表达水平，则诊断乳腺组织具有癌症，或者预测乳腺组织将癌变。检测到硫氧还蛋白1在II期至IV期乳腺癌组织中的表达水平比在I期乳腺癌组织或正常乳腺组织中的表达水平高。固定器的例子包括硝酸纤维素膜、PVDF(聚偏氟乙烯)膜、聚乙烯树脂或聚苯乙烯树脂做成的96孔板以及载玻片。抗原-抗体的结合反应可使用典型的方法来检测，所述方法例如ELISA、放射性免疫测定(RIA)、夹心分析法、蛋白质印迹、免疫沉淀反应、免疫组化染色、免疫荧光分析法、 酶-底物着色分析法以及抗原-抗体聚合。实施例通过下面的实施例可更好的理解本发明，下面的实施例是举例说明本发明，但并不限制本发明。实施例1 qRT-PCR分析法对于人体靶基因的表达谱而言，使用qRT-PCR (定量实时聚合酶链式反应)分析法进行下列反应。使用人体主要48种组织实时(HMRT) qPCR分析法、癌症调查实时(CSRT 96-1) qPCR 分析法以及人体乳腺癌实时(BCRT I-V) qPCR分析法，所有产品购自OriGene (OriGene科技公司，R0ckville，MD，美国)。使用HMRT分析法对48种不同组织中的靶基因的表达进行同时检测，所述靶基因包括多组选自不同种族的个体的人体组织中的第一链cDNA。使用CSRT 分析法检测八种不同癌症(乳腺、结肠、肾脏、肝脏、肺、卵巢、前列腺和甲状腺)中靶基因的表达水平，其中包括来自I期至IV期不同癌症阶段的每种癌症类型的12个样本。使用四组不同的分析法(BCRT I-IV)检测192个测试样本的乳腺癌中靶基因的表达以及使用CSRT 96-1分析法检测12个测试样本的乳腺癌中靶基因的表达。在这204个样本中，癌症等级分布如下19个样本为0期(正常)；37个样本为I期；76个样本为II期；60个样本为III 期；以及12个样本为IV期。癌组织的类型包括导管型(n = 154)、小叶型(n = 13)、转移型(n = 12)以及其它癌组织类型(n = 25)，所述其它癌组织类型包括髓质型、粘液型、管状型、复发型和乳头状型。在OriGene的产品宣传页中描述了每个病人的更多的临床病理信肩、οPCR在96孔光学板中进行，所述96孔光学板使用含有Trxl、Trx2、β -肌动蛋白、 GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)的特异性引物的iCycleHBio-rad实验室，Hercules，CA， 美国)和iQ SYBR绿色超级混合物(iQ SYBR Green Supermix) (Bio-rad)。在每个延伸阶段末期，在530nm处检测到所产生的荧光与扩增的DNA的量成比例。构建从连续稀释的靶基因得到的所有反应的Ct(荧光通过阈值的点)值的标准曲线图，从而确保靶基因被扩增并与模板成比例的被报告。用方程式2“"将Ct值转化为模板cDNA的基因拷贝数。Δ Ct为在每个时间点被标准化为β-肌动蛋白和GAPDH的每个基因的转录物的cDNA的丰度。通过减去所测定的每个基因转录物的基准值而得到△△&。为了使Ct值相互关联，使用靶基因的连续稀释液构建平行于每个cDNA样本的标准曲线。从斜率和相关系数来评价标准曲线的性质。通过比较未知浓度的PCR产物的荧光和几个稀释液的荧光来进行定量。熔解曲线分析用来验证产物。β-肌动蛋白和GAPDH的引物购买于Origene。其它引物序列总结于表1中。
表 权利要求
1.一种乳腺癌诊断标记物，所述诊断标记物包括作为活性成分的硫氧还蛋白1。
2.如权利要求1所述的诊断标记物，其中，所述标记物对于II期至IV期乳腺癌是特异性的。
3.一种乳腺癌诊断试剂盒，所述试剂盒包含特异性结合硫氧还蛋白1的抗体。
4.一种检测乳腺组织中的硫氧还蛋白1的方法，所述方法包括抗原-抗体反应，所述抗原-抗体反应使用特异性结合硫氧还蛋白1的抗体。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述硫氧还蛋白1在II期至IV期乳腺癌组织中的表达水平比在I期乳腺癌组织或正常乳腺组织中的表达水平高。
6.一种使用权利要求1所述的标记物诊断或预后乳腺癌的方法，所述方法包括1)检测目标乳腺组织中硫氧还蛋白1的表达水平；以及2)将目标乳腺组织中所检测的硫氧还蛋白1的表达水平与正常乳腺组织中硫氧还蛋白1的表达水平进行比较，当所检测的硫氧还蛋白1的表达水平高于正常乳腺组织中硫氧还蛋白1的表达水平时，诊断目标乳腺组织具有癌症或者预测癌变的可能性。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述硫氧还蛋白1在II期至IV期乳腺癌组织中的表达水平比在I期乳腺癌组织或正常乳腺组织中的表达水平高。
全文摘要
本发明涉及含有作为活性成分的硫氧还蛋白1的乳腺癌诊断标记物，并涉及使用所述硫氧还蛋白1的乳腺癌诊断试剂盒。根据本发明的硫氧还蛋白1在人类乳腺组织中过表达，使得能够早期诊断乳腺癌或预测乳腺癌的预后，因此，根据本发明的硫氧还蛋白1作为乳腺癌诊断标记物具有重要用途。
文档编号G01N33/574GK102348983SQ200980158089
公开日2012年2月8日 申请日期2009年4月15日 优先权日2009年3月16日
发明者金一韩 申请人:培材大学校产学协力团