专利名称：用于检测可溶性pdcd5蛋白的elisa方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学和生物技术领域，涉及一种用于检测可溶性PDCD5蛋白的 ELISA方法和试剂盒。该方法和试剂盒可用于自身免疫性疾病、各种炎症、肿瘤等病人的体 液样品中PDCD5蛋白的检测，基础研究中各种生物学样品(如细胞培养上清液、细胞溶解 液)中的PDCD5蛋白的检测，以及来源于动物模型的生物学样品中PDCD5蛋白的检测。
背景技术：
TFAR19 (TF-1 cell apoptosis-related gene 19)是一种新的程序性细胞死亡 调控基因，2002年国际人类基因命名委员会将其命名为PDCD5 (programmed cell death 5)。该基因进化保守，表达广泛，其编码的PDCD5蛋白由125个氨基酸组成，主要定位于细 胞质和核内。前期的功能研究证明PDCD5能够促进多种肿瘤细胞凋亡，是一种潜在的新的 抑癌基因，其效应机制是通过结合组蛋白乙酰转移酶Tip60发挥促进肿瘤细胞凋亡的作用 (中国专利 98101869. 6 ;Biochem Biophy Res Comm，1999，254 :203-210 ；Neoplasia, 2009, 10(4) :345-354) 目前，国内外已有多家实验室利用不同技术发现PDCD5的表达异常与多种疾病 的发生、发展有关。大量的研究报告证明PDCD5在肿瘤细胞中的表达明显低于正常细胞， 如肝癌(Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98 (26) 15089-15094 ；世界华人消化杂志，2008， 16(16) :1820-1824 ；中国普通外科杂志，2008，17 (7) :721-724)、乳腺癌(N Engl J Med, 2001,344 (8) :539-548 ；Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101 (52) :18147-18152)、卵巢上 皮性癌(中国妇产科临床杂志，2002，3 (3) 164-167)、口腔鳞癌(北京大学学报(医学版)， 2005，37 (4):似9-432)、肺癌(J Clin Oncol，2006，24 (11) :1672-1678)、胃癌(Apoptosis, 2006，11 (6) :993-1001)、多发性骨髓瘤(现代医药卫生，2007 (21) :3184-3187)、肾透明细 胞癌(南方医科大学学报，2006，沈(6) =805-809 ；2006, 26 (9) :1316-1318)以及脑胶质瘤 (Oncol Rep. 2008,20(3) :573-579 ；中国临床神经外科杂志，2008 年，13 (10) :611-613)等。 其中，PD⑶5的表达与卵巢上皮性癌的FIGO分期、组织学分级、病理类型密切相关。随FIGO 分期与组织学分级的升高，PD⑶5的表达下调；PD⑶5的低表达还与胃癌和肾透明细胞癌的 不良预后密切相关。还证实了急性髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)病人比慢 性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia, CML)病人表达更少的PDCD5蛋白，CML病人 尤其是加速/急变期的CML病人，PD⑶5表达量与BCR-ABL表达量呈负相关(北京大学学 报(医学版)，2002，34 (6) :676-679 ；Leuk Res. 2006，30 (9) :1159-1165)。此外，PD⑶5的异常表达也参与某些自身免疫性疾病和炎症等过程，如系统性红 斑狼疮(SLE)(中国病理生理杂志，2003，19 O) :189-193 ；中华风湿病学杂志，2002，6 (5) 328-330)、狼疮性肾炎(临床儿科杂志，2003，21 (10) =607-609)、银屑病(中华皮肤科杂志， 2004，37 :215-217)、骨关节炎(北京大学学报(医学版)，2003，35 (5) :481-484)、类风湿性 关节炎(APOPTOSIS, 2007 ； 12 (8) :1433-1441 ；中国生物化学与分子生物学报，2008二4 (6) 563-568 ；中国组织工程研究与临床康复，2008年(24) :4667-4671)、老年性白内障(眼科研究，2002，20(6) :514-516)、多囊卵巢综合征(PCOS)(北京大学学报(医学版)，2005， 37(5) =476-479)以及慢性心力衰竭(中华医学杂志，2005，85 (10) :676-678)等。上述研究主要是采用免疫组化、免疫荧光以及RT-PCR技术检测正常人或疾病 状态下组织细胞内PD⑶5的mRNA和蛋白质表达水平，或者采用间接酶联免疫吸附实验 (Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血液中 PDCD5 自身抗体的水平。其 中，间接酶联免疫吸附实验是将PDCD5抗原吸附到ELISA酶标板上，加入病人血清标本，再 加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG，最后加入酶底物显色。根据颜色的深浅判断PDCD5 自身抗体的水平。这个方法只能检测PDCD5抗体，一般应用在疾病的晚期，不能准确代表体 内PDCD5的蛋白水平，因为抗原的出现要早于抗体的产生，因此该方法仅可以检测PDCD5抗 体，而检测不到PD⑶5抗原。最近日本学者在对弓形虫PDCD5(TgPDCD5，^Toxoplasma gondiiProgrammed Cell Death 5)的研究中发现，弓形虫的PDCD5蛋白存在分泌形式，其在弓形虫感染的宿主细 胞的凋亡中起着重要的作用(Mol BiochemParasitol. 2008 ； 159 (2) :112-120 ;J Vet Med Sci. 2009 Sep ；71 (9) :1183-1189) 人类的PDCD5蛋白是否存在分泌形式国内外还未见报 道。鉴于PDCD5在肿瘤、自身免疫性疾病以及炎症等病人的组织细胞中的表达异常，因而 有必要开发检测实验室或临床生物样品中可溶性PDCD5蛋白的试剂盒，从而有望将可溶性 PDCD5蛋白作为一种新的生物标记，为疾病的诊断、病程判断、疗效观察、指导用药及预后提 供一种辅助检测手段，也为进一步研究PDCD5蛋白的功能奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测可溶性PD⑶5蛋白的抗体夹心ELISA方法， 实验结果表明采用该方法能够检测临床病人的血清、血浆、尿液、胸腹水、关节液、脑脊液、 羊水等体液中的可溶性PDCD5蛋白，同时也可用于基础研究中检测各种生物学样品(如细 胞培养上清液、细胞溶解液)中的可溶性PDCD5蛋白，以及用于检测来自动物模型的生物学 样品中的可溶性PD⑶5蛋白。本发明的目的还在于提供一种用于检测可溶性PD⑶5蛋白的抗体夹心ELISA试剂 盒。本发明制得的ELISA试剂盒为PDCD5的基础研究和临床应用研究提供了有利的工具。用于实现上述目的的技术方案如下一种用于检测可溶性PDCD5蛋白的ELISA方法，该方法包括以下步骤(1)将待测样品与负载PDCD5蛋白第一抗体的固体载体相接触；(2)加入能够与检测标记结合的PD⑶5蛋白第二抗体；(3)加入检测标记，检测被结合的检测标记。在上述方法中，待测样品可以为血清、血浆、尿液、胸腹水、关节液、脑脊液、羊水、 细胞培养上清液或细胞溶解液。优选地，上述方法包括如下步骤先以系列包含已知浓度的可溶性PD⑶5蛋白的 溶液替代待测样品重复步骤(1)至(3)，绘制标准曲线；再以待测样品重复步骤(1)至(3)， 并根据标准曲线得出待测样品中可溶性PDCD5蛋白的浓度。在上述方法中，优选地，PD⑶5蛋白第一抗体为PD⑶5蛋白的单克隆抗体，例如鼠 抗人PDCD5蛋白的单克隆抗体。
在上述方法中，优选地，PD⑶5蛋白第二抗体为PD⑶5蛋白的多克隆抗体，例如兔 抗人PDCD5蛋白的多克隆抗体。在上述方法中，检测标记可以为酶、荧光或同位素。本发明还提供了一种用于检测可溶性PD⑶5的ELISA试剂盒，该试剂盒包括用于捕获待测样品中的可溶性PD⑶5蛋白的PD⑶5蛋白第一抗体；能够与检测标记结合的PD⑶5蛋白第二抗体；系列包含已知浓度的可溶性PD⑶5蛋白的溶液；检测标记；检测检测标记的工具。在上述ELISA试剂盒中，优选地，PD⑶5蛋白第一抗体为PD⑶5蛋白的单克隆抗体， 例如鼠抗人PDCD5蛋白的单克隆抗体。在上述ELISA试剂盒中，优选地，PD⑶5蛋白第二抗体为PD⑶5蛋白的多克隆抗体， 例如兔抗人PDCD5蛋白的多克隆抗体。在上述ELISA试剂盒中，优选地，检测标记可以为酶、荧光或同位素。检测检测标 记的工具可以为检测酶、荧光或同位素的工具。具体地，本发明的检测可溶性PD⑶5蛋白的ELISA方法包括下述步骤(1)收集各种生物样品，包括各种病人或正常人的体液标本，细胞培养上清液或细 胞裂解液。(2)标准品的稀释与加样在鼠抗人PDCD5蛋白的单克隆抗体包被板上设PDCD5 蛋白标准品孔16孔，从200ng/ml开始稀释，连续稀释8个浓度200ng/ml，100ng/ml, 50ng/ ml，25ng/ml，12. 5ng/ml，6. 25ng/ml，3. 125ng/ml，l. 56ng/ml,每个标准品设 2 个重复孔， 0. Iml/孔，置37°C下温育45-60分钟。(3)加待测样品采用鼠抗人PDCD5蛋白的单克隆抗体包被板，0. Iml/孔，同时设 空白对照(空白对照孔不加样品，其余各步操作相同)，置37°C下温育45-60分钟。(4)洗涤弃去上述孔板中的液体，甩干，每孔加0. 2ml洗涤液洗涤，如此重复3 次，拍干。(5)加PD⑶5多抗加入用样品稀释液稀释的兔抗人PD⑶5多克隆抗体(1 μ g/ ml)，0. Iml/孔，置37°C下温育45-60分钟。(6)洗涤弃去液体，甩干，每孔加0. 2ml洗涤液洗涤，如此重复3次，拍干。(7)加辣根过氧化物酶(HRP)-标记的抗兔抗体加入用样品稀释液稀释的该酶标 二抗(0. 2-0. 5 μ g/ml)，置 37°C 下温育 45-60 分钟。(8)洗涤弃去液体，甩干，每孔加0. 2ml洗涤液洗涤，如此重复3次，拍干。(9)显色3，3' ,5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液，0. Iml/孔，轻轻震荡混勻， 37°C下避光显色10 15分钟。(10)终止每孔加终止液50 μ 1，终止反应。(11)测定以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在 加终止液后15分钟以内进行。(12)描绘标准曲线，计算浓度。以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标 准曲线，并得出回归方程式。将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度。
本发明的抗体夹心ELISA方法的基础是抗体的固相化及抗体的酶标记，即结合在 固相载体表面的抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗体既保留其免疫学活性，又保留酶 的活性。例如，受检标本与固相载体表面的抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成 的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗体，通过反应也结合在固 相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质 的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。酶的催化效率很高，间接地放大了免 疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度，这种抗体夹心ELISA可应用于微量可溶性 PD⑶5抗原蛋白的检测。基于上述研究，本发明利用上述ELISA方法和试剂盒成功检测到了包括人的哺乳 动物的生物学样品中的可溶性PDCD5蛋白。各种病人和正常人血清中可溶性PDCD5蛋白表 达的检测结果证明多发性硬化症病人血清中PD⑶5蛋白的水平比正常人高2. 5倍以上； 肝炎病人血清中PD⑶5蛋白的水平比正常人高4倍以上；甲型流感病人血清中PD⑶5蛋白 的水平比正常人高4倍以上；在骨髓瘤和慢性粒细胞白血病病人血清中PDCD5蛋白的水平 略低于正常人，其差异具有显著性(P < 0. 05)；类风湿关节炎病人血清中PD⑶5蛋白的水 平显著高于正常人，其差异具有显著性(P < 0. 05)；系统性红斑狼疮病人血清中PD⑶5蛋 白的水平高于正常人，其差异具有显著性(P < 0. 05)。将上述方法和试剂盒用于检测血浆、 血清、尿、脑脊液、关节液中的PDCD5蛋白水平，为自身免疫疾病、各种炎症(如肝炎)以及 肿瘤等疾病的诊断、病程判断、疗效观察，指导用药及预后提供了一种新的辅助检测方法。 该检测方法及其试剂盒取样方便，操作简单，灵敏度和准确性更高，更有利于推广应用。
图1显示了 ^festern Blot检测兔抗人PD⑶5蛋白多克隆抗体与PD⑶5蛋白的反 应性，1 :PDCD5h25 ；2 :PDCD527_125 ；3 :PDCD520_104 ；4 :PDCD534_1M。图2显示了 Wfestern Blot检测鼠抗人PD⑶5蛋白单克隆抗体与PD⑶5蛋白的反 应性，1 :PDCD5h25 ；2 :PDCD5 34-125 ；3 :PDCD\0_125 ；4 :PDCD527_125 ；5 :PDCD5H12。图3显示了抗体夹心ELISA方法检测PD⑶5蛋白的结果；图4显示了抗体夹心ELISA方法检测正常人和多发性硬化症病人血清中PD⑶5蛋 白的结果；图5显示了抗体夹心ELISA方法检测正常人和肝炎病人血清中PD⑶5蛋白的结 果；图6显示了抗体夹心ELISA方法检测正常人和甲型流感病人血清中PD⑶5蛋白的结果。图7显示了抗体夹心ELISA方法检测正常人和类风湿关节炎病人血清中PD⑶5蛋 白的结果。图8显示了抗体夹心ELISA方法检测正常人和系统性红斑狼疮病人血清中PD⑶5 蛋白的结果。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。实施例1兔抗人PDCD5 _m蛋白多克隆抗体的制备步骤1 动物免疫M 100 μ g/ml 纯化的重组 PDCD534_1M 蛋白(Archives of Biochemistry andBiophysics,486(2) :141-149)与等量弗氏完全佐剂(Complete Freund' sAdjuvant, Sigma公司产品)混合，充分乳化后采用背部多点注射法免疫家兔。2周后同剂量(100 μ g/ ml)纯化的重组？00)534_仍蛋白加弗氏不完全佐剂ancomplete Freund's Adjuvant, Sigma 公司产品)同法加强免疫。以后每两周免疫一次(采用100μ g/ml纯化的重组？000534,5蛋 白+等量弗氏不完全佐剂)，全程共免疫3次，末次免疫后7天于耳缘静脉取血，间接ELISA 检测血清中兔抗人PDCM34J蛋白多克隆抗体的效价，然后心脏取血，收集血清，-20°C冻 存。步骤2 兔抗人PD⑶\4_125蛋白多克隆抗体的纯化间接ELISA方法测定兔血清中抗人蛋白多克隆抗体效价为5X 105，将 该血清用HiTrap Protein G(为Amersham Pharmacia Biotech公司产品)亲和层析的方 法(按说明书操作)纯化兔抗人PDCD5蛋白的多克隆抗体。将纯化的抗体进行SDS-PAGE 电泳，按常规方法进行(分离胶浓度为12. 5%，浓缩胶浓度为4. 5% )，鉴定其抗体纯度为 90%以上，纯化的抗体放_30°C下保存备用。步骤3 :兔抗人PD⑶\4_125蛋白多克隆抗体与PD⑶5蛋白的反应性Western Blot免疫印迹实验检测兔抗人PDCM34_1M蛋白多克隆抗体与PDCD5蛋白 的结合反应。将纯化的重组 PDCD5 蛋白(PDCD5H，PDCD\7_125，PDO^2chiq4, PDCM34_125)进 行15% SDS-PAGE电泳，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到硝酸纤维 素膜上(Schleicher & Schuell公司产品)，用5%脱脂奶粉在4°C下封闭过夜，加入兔抗 人PD⑶\4_125蛋白多克隆抗体室温下反应1小时，洗涤三次，每次5-10分钟。将膜与Alexa Fluor 780-标记的抗兔IgG荧光抗体室温下避光孵育1小时。洗膜三次，每次5_10分钟。 固定于膜上的可被红外线激发的荧光团在780nm激发光的作用下，其波长为820nm的发射 光可被 LI-COR 红外成像系统(LI-C0R Infrared Imaging System, Odyssey, Lincoln, NE) 的信号检测器检测到，所得信号可经Odyssey公司提供的软件进行分析。结果如图1所示， 兔抗人PDCD534_1M蛋白多克隆抗体能与PDCD534_1M肽段发生特异反应，说明该多抗能够识别 氨基酸序列；34位后的PD⑶5蛋白。实施例2鼠抗人PD⑶5蛋白单克隆抗体与PD⑶5蛋白的反应性鼠抗人PD⑶5单克隆抗体的制备参见文献(中国医学科学院学报，2000，22(6) 502-504)。Western Blot免疫印迹实验检测鼠抗人PDCD5蛋白单克隆抗体与PDCD5蛋白结 合反应反应步骤同实施例1的步骤3。结果如图2所示，鼠抗人PDCD5蛋白单克隆抗体能 与PD⑶5多肽的N端发生特异反应，与片段不发生特异反应。实施例3双抗体夹心ELISA方法的建立1、包被将鼠抗人PD⑶5单抗用pH9. 0,0. 5M的碳酸盐缓冲液稀释到1 μ g/ml，加 到96孔ELISA板中，0. Iml/孔，置4°C下反应24小时。2、洗涤弃去液体，甩干，每孔加0. 2ml含0. 05% Tween20的PBS洗涤液洗涤，重
复3次，拍干。
3、封闭将含0. 05% Tween20和3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS，加到包被过的 ELISA板中，0. 15ml/孔，37°C下反应2小时或封闭过夜。4、洗涤弃去液体，甩干，每孔加0. 2ml含0. 05% Tween20的PBS洗涤液洗涤，重
复3次，拍干。5、标准品的稀释与加样在鼠抗人PD⑶5单抗包被的板上设PD⑶5蛋白标准品孔 16 孔，从 200ng/ml 开始稀释，连续稀释 8 个浓度，200ng/ml，100ng/ml, 50ng/ml, 25ng/ml, 12. 5ng/ml，6. 25ng/ml，3. 125ng/ml, 1. 56ng/ml,每个标准品设 2 个重复孔，0. Iml/ 孔，置 37°C下温育45-60分钟。6、加待测样品鼠抗人PD⑶5单抗包被的板，0. Iml/孔，每个样品设2个重复孔。 同时设空白对照(空白对照孔不加样品，其余各步操作相同)，置37°C下温育45-60分钟。7、洗涤弃去液体，甩干，每孔加0. 2ml含0. 05% Tween20的PBS洗涤液洗涤，重 复3次，拍干。8、加PD⑶534_1M多抗加入用样品稀释液(即PBS，0. 15Mol/L，pH 7. 4的磷酸 盐缓冲液，配方为=KH2PO4 0. 2g，Na2HPO4 · Iffl2O 2. 9g，KCl 0. 2g，NaCl 8. Og，加蒸馏水至 IOOOmL)稀释的兔抗人PDCD534_125多克隆抗体(1 μ g/ml)，0· lml/孔，置37°C下温育45-60 分钟。9、洗涤弃去液体，甩干，每孔加0. 2ml含0. 05% Tween20的PBS洗涤液洗涤，重
复3次，拍干。10、加辣根过氧化物酶(HRP)-标记的抗兔二抗加入用样品稀释液稀释的该酶标 二抗(0. 2-0. 5 μ g/ml)，置 37°C 下温育 45-60 分钟。11、洗涤弃去液体，甩干，每孔加0. 2ml含0. 05% Tween20的PBS洗涤液洗涤，重
复3次，拍干。12、显色3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液，0. Iml/孔，轻轻震荡混勻， 37°C下避光显色10 15分钟。13、终止每孔加终止液50 μ 1，终止反应。14、测定以空白孔调零，450nm波长下依序测量各孔的吸光度(0D值)。测定应在 加终止液后15分钟以内进行。15、描绘标准曲线，计算浓度。以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标 准曲线，并得出回归方程式。将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度。实施例4抗体夹心ELISA方法检测PDCD5蛋白将PDCD5蛋白(北京大学学报(医学版)，2003，34 (4) =360-363)倍比稀释，从 200ng/ml 开始稀释，连续稀释 8 个浓度，200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml ,12. 5ng/ ml, 6. 25ng/ml，3. 125ng/ml，l. 56ng/ml，每个样品设3个重复孔，0. lml/孔，采用实施例3建 立的ELISA方法重复检测三次，结果相似，如图3所示，PDCD5与抗体的反应具有良好浓度 依赖关系，检测区间为lng/ml-200ng/ml。实施例5ELISA方法检测正常人和多发性硬化症病人血清中的PD⑶5蛋白分别收集8例正常人(Normal)血清和10例多发性硬化症(Multipl必clerosis， MS)病人的血清，用样品稀释液进行1 10稀释，采用实施例3建立的ELISA方法进行操 作。通过标准曲线计算样品中可溶性PDCD5蛋白的含量，统计学处理用t检验。结果如图4所示，10例多发性硬化症病人血清中PD⑶5蛋白含量为47. 39士22. 323ng/ml，8例正常人 血清中PD⑶5蛋白含量为20. 49 士 13. 32ng/ml，多发性硬化症病人血清中PD⑶5蛋白含量显 著高于正常人，差异具有统计学意义(P < 0. 01)。实施例6ELISA方法检测正常人和肝炎病人血清中的PD⑶5蛋白分别收集42例正常人血清和118例肝炎病人的血清，用样品稀释液进行1 10稀 释，采用实施例3建立的ELISA方法进行操作。通过标准曲线计算样品中可溶性PDCD5蛋白 的含量，统计学处理用t检验。结果如图5所示，118例肝炎病人血清中PDCD5蛋白的平均 含量为84. 85士09ng/ml，42例正常人血清中PDCD5蛋白的平均含量为20. 35士 12. 35ng/ ml，肝炎病人血清中PD⑶5蛋白含量显著高于正常人，差异具有统计学意义(ρ < 0. 0001)。实施例7ELISA方法检测正常人和甲型流感病人血清中的PD⑶5蛋白分别收集42例正常人血清和12例甲型流感病人的血清，用样品稀释液进行 1 10稀释，采用实施例3建立的ELISA方法进行操作。通过标准曲线计算样品中可溶 性PDCD5蛋白的含量，统计学处理用t检验。结果如图6所示，12例甲型流感病人血清中 PD⑶5蛋白的平均含量为87. 28 士 58. 92ng/ml，42例正常人血清中PD⑶5蛋白的平均含量为 20. 35士 12. 35ng/ml,甲型流感病人血清中PD⑶5蛋白的含量显著高于正常人，差异具有统 计学意义(P < 0. 0001)。实施例8ELISA方法检测正常人和类风湿关节炎病人血清中的PD⑶5蛋白分别收集20例正常人血清和20例类风湿关节炎病人的血清，用样品稀释液进行 1 10稀释，采用实施例3建立的ELISA方法进行操作。通过标准曲线计算样品中可溶性 PDCD5蛋白的含量，统计学处理用t检验。结果如图7所示，20例类风湿关节炎病人血清中 PDCD5蛋白的平均含量为26. 94士沈.12ng/ml,20例正常人血清中PDCD5蛋白的平均含量 为14.观士3. 23ng/ml，类风湿关节炎病人血清中PD⑶5蛋白的高于正常人，差异具有统计 学意义(P < 0. 05)。实施例9ELISA方法检测正常人和系统性红斑狼疮病人血清中的PD⑶5蛋白分别收集20例正常人血清和35例系统性红斑狼疮病人的血清，用样品稀释液进 行1 10稀释，采用实施例3建立的ELISA方法进行操作。通过标准曲线计算样品中可溶 性PDCD5蛋白的含量，统计学处理用t检验。结果如图8所示，35例系统性红斑狼疮病人血 清中PD⑶5蛋白的平均含量为20. 84士 13. 89ng/ml,20例正常人血清中PD⑶5蛋白的平均 含量为14.观士3. 23ng/ml，系统性红斑狼疮病人血清中PD⑶5蛋白的高于正常人，差异具 有统计学意义(P < 0. 05)。实施例10抗体夹心ELISA方法检测孕、产妇羊水中的PDCD5蛋白收集不同时间的孕、产妇羊水80例，采用实施例3建立的ELISA方法进行操作，通 过标准曲线计算样品中可溶性PDCD5蛋白的含量，结果总结见表1，80例羊水的PDCD5蛋白 含量为 3. 561 + 1. 068ng/ml (η = 80)。表1 抗体夹心ELISA方法检测孕、产妇羊水中PD⑶5蛋白的结果(ng/ml)
权利要求
1.一种用于检测可溶性PD⑶5蛋白的ELISA方法，该方法包括以下步骤(1)将待测样品与负载PDCD5蛋白第一抗体的固体载体相接触；(2)加入能够与检测标记结合的PDCD5蛋白第二抗体；(3)加入检测标记，检测被结合的检测标记。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为血清、血浆、尿液、胸腹 水、关节液、脑脊液、羊水、细胞培养上清液或细胞溶解液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤先以系列包 含已知浓度的可溶性PDCD5蛋白的溶液替代待测样品重复步骤(1)至(3)，绘制标准曲线； 再以待测样品重复步骤(1)至(3)，并根据标准曲线得出待测样品中可溶性PDCD5蛋白的浓 度。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述PDCD5蛋白第一抗体为 PDCD5蛋白的单克隆抗体，例如鼠抗人PDCD5蛋白的单克隆抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述PDCD5蛋白第二抗体为 PDCD5蛋白的多克隆抗体，例如兔抗人PDCD5蛋白的多克隆抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测标记为酶、荧光或 同位素。
7.一种用于检测可溶性PD⑶5的ELISA试剂盒，该试剂盒包括用于捕获待测样品中的可溶性PDCD5蛋白的PDCD5蛋白第一抗体；能够与检测标记结合的PDCD5蛋白第二抗体；系列包含已知浓度的可溶性PD⑶5蛋白的溶液；检测标记；检测检测标记的工具。
8.根据权利要求7所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述PDCD5蛋白第一抗体为 PDCD5蛋白的单克隆抗体，例如鼠抗人PDCD5蛋白的单克隆抗体。
9.根据权利要求7或8所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述PDCD5蛋白第二抗体为 PDCD5蛋白的多克隆抗体，例如兔抗人PDCD5蛋白的多克隆抗体。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述检测标记为 酶、荧光或同位素。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述检测检测标 记的工具为检测的酶、荧光或同位素的工具。
全文摘要
本发明提供一种用于检测可溶性PDCD5蛋白的ELISA方法和试剂盒，该方法包括以下步骤(1)将待测样品与负载PDCD5蛋白第一抗体的固体载体相接触；(2)加入能够与检测标记结合的PDCD5蛋白第二抗体；(3)加入检测标记，检测被结合的检测标记。本发明利用上述ELISA方法和试剂盒成功检测到了包括人的哺乳动物的生物学样品中的可溶性PDCD5蛋白。将上述方法和试剂盒用于检测血浆、血清、尿、脑脊液、关节液中的PDCD5蛋白水平，为自身免疫病、各种炎症(如肝炎)以及肿瘤等疾病的诊断、病程判断、疗效观察，指导用药及预后提供了一种新的辅助检测方法。该检测方法及其试剂盒取样方便，操作简单，灵敏度和准确性更高，更有利于推广应用。
文档编号G01N33/68GK102135542SQ201010034529
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月21日 优先权日2010年1月21日
发明者宋泉声, 张颖妹, 潘欢, 许兰俊, 陈英玉, 马大龙 申请人:北京大学