专利名称：：一种检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法与前处理装置的制作方法
技术领域：
：本发明属于食品检测领域，涉及一种采用液相微萃取方法进行有机物分析的方法，更具体地说是采用中空纤维膜三相液相微萃取-高效液相色谱法进行原料乳和乳制品中三聚氰胺的测定。
背景技术：
：三聚氰胺原本是一种重要的化工原料，是常用的工业化学品。与食品领域相隔甚远。所以在但是2008年9月发生在中国的三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，却使得三聚氰胺一时间成了牛奶附属品。牛奶或奶制品中三聚氰胺的检测，突然间成了国内外分析化学领域关注的重要问题，与食品安全检测息息相关。由于三聚氰胺本是化工原料，不允许添加到食品中，所以此前，各国均没有检测食品中三聚氰胺的国家标准，检测方法较为落后。对于三聚氰胺的检测，传统的有浊度法、升华法、重量法，这些方法主要为化工行业的测定胺，其用于测定人工合成三聚氰胺的纯度，不能满足食品中检测微量三聚氰胺的要求；酶联免疫吸附分析(ELISA)主要通过试剂盒或试纸直接测定样品中是否含有三聚氰胺，可以满足日常食品卫生执法中检测三聚氰胺的要求，但是该法容易受其他物质的干扰，影响检测结果的准确性，一般只适用于样品的初检，对于阳性结果的样品需采用化学仪器法进一步确证。高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱_质谱联用法(LC-MS)、气相色谱法_质谱联用法(GC-MS)是近年来分析检测领域中高精度的检测方法，其用于检测食品中的三聚氰胺，具有灵敏度高、准确性强的优点。在美国，FDA在2007年3月的三聚氰胺污染猫粮狗粮事件后，相继公布了用GC-MS和HPLC检测三聚氰胺的详细流程。但是，采用液相色谱、气相色谱等进行的检测，需要对食品样品进行繁杂的前处理过程。以我国国家标准方法GB/T22388-2008(HPLC法)(以下简称"国标法")为例，其包括以下的前处理过程溶液萃取-离心分离_滤纸过滤-SPE柱净化-洗脱液浓縮、定容_微孔滤膜过滤，最后才能进入HPLC分析。这些或者繁琐或者可靠性低的检测方法，已经不能适应目前食品领域中三聚氰胺的检测压力。如何在利用液相色谱法、气相色谱法高精度高灵敏度的优点的同时，克服其前处理带来的耗时耗力的不足，成为该检测领域重要的课题。
发明内容本发明的目的是在于针对现有技术的不足，提供一种灵敏准确且快速简便的检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法。本发明的另一目的在于提供该方法的样品前处理装置。本发明通过以下技术方案实现上述目的本发明提供了一种检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法，采用高效液相色谱法进行测定，在进入高效液相色谱前，样品是通过采用中空纤维膜三相液相微萃取进行前处理的。中空纤维膜液相微萃取(Hollowfiberliquidphasemicroextraction，HF-LPME)是液相微萃取技术(Liquidphasemicroextraction,LPME)中的一种。液相微萃取技术是一种新型的样品前处理方法，还可方便地与后续的仪器分析结合起来，实现样品前处理与分析测定的一体化过程。按萃取方式的不同可分为顶空液相微萃取(HS-LPME)，直接浸入式液相微萃取(DI-LPME)，和中空纤维膜液相微萃取(HF-LPME)。其中，顶空液相微萃取要求所萃取的成分必须是易挥发的；直接浸入式液相微萃取则适用于较为洁净的液相样品；而中空纤维膜液相微萃取对于成分复杂，杂质含量较多或有色的液相样品尤为适合。尽管LPME已逐渐被应用到各种物质，如环境、生物样品、食品等的前处理方法中。但是，目前仍未有任何将LPME应用到三聚氰胺检测的相关报道。在本发明之前，采用LPME作为检测三聚氰胺的前处理手段的可行性，以及如何实施，尚未一个未知数。本发明创造性地将LPME中的HF-LPME作为检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的前处理手段，并摸索出一套能高效萃取样品溶液中三聚氰胺，并适于直接进入HPLC检测的前处理方法和系统。HF-LPME最初是在1999年由Pedersen-Bjergaard等提出，是通过有机溶剂在纤维壁孔中形成的液膜进行传质，在多孔的中空纤维腔中进行萃取。HF-LPME有两相萃取和三相萃取两种模式。在两相萃取模式中，被测物通过被固定在中空纤维膜微孔中不溶于水的有机相，进入到膜腔内的接收相中。此时有机相和接收相为相同的有机溶剂，待测物质的富集过程发生在两相之间。而在三相萃取模式中，中空纤维膜腔内的接收相不是有机相而是水相，待测物质则通过固定在膜孔中的有机相，进入到膜内水相中。本发明发现，将有机相固定于膜孔中，以水相作为接收相，尤其适合于萃取样品溶液中的三聚氰胺并直接进入HPLC检测系统。采用中空纤维膜三相微萃取技术使目标物必须先进入到膜壁的有机相，再进入到膜内的接收相中，比两相萃取具有更突出的净化功能和抗干扰能力。本发明提供的检测方法如下原料乳和乳制品制备成为溶液之后，用中空纤维膜三相液相微萃取对溶液中的三聚氰胺进行提取，再直接进入HPLC检测。在这个方法中，三相液相微萃取是在中空纤维膜中，以水作为接收相存在于纤维膜的内部，纤维膜的孔壁上充有有机相；中空纤维膜放置于待测样品溶液中，即进行萃取过程。在本方法中，纤维膜为聚偏氟乙烯纤维膜、聚乙烯纤维膜或聚丙烯膜纤维膜；其为中空的细管状，两端可以封闭，其壁厚100300iim，内径1.2lOmm，孔径0.10.3ym;有机相通过一定的处理充满纤维膜的孔壁；有机相是非水溶性有机溶剂，如正辛醇、甲苯。中空纤维膜放置于待测样品溶液中进行萃取的时间可以为30120min;萃取过程是在5001200rpm的转速下进行的。采用此方法，可以检测多种原料乳和乳制品，如液态奶、奶粉。粉末或固体样品必须经过一定的处理成为溶液后再进行检测。比如，奶粉样品通过加水超声溶解方法制得样品溶液。其他的乳制品如奶酪，称取试样于研钵中研磨成干粉状，通过加水超声溶解后成为样品溶液再进行检测。本发明同时提供了适用于本方法的样品前处理装置，包括一个可以放置待测样品溶液的带盖小瓶，盖子下方悬挂有含有有机相和水相的纤维膜包覆物，其中的有机相吸附4于纤维膜的孔壁；所述的包覆物至少一部分浸泡于样品溶液中。本发明还提供了制备上述装置的方法，包括以下步骤(1)将由中空纤维膜构成的一端捏紧密封，另一端与塑料吸头相连，成为萃取管，中空纤维膜端为萃取管底部，塑料吸头端为萃取管顶部；(2)将萃取管浸入有机相溶液中，超声后取出，用擦镜纸把多余的有机相吸干；(3)将步骤(2)所得的萃取管的顶部固定于样品瓶的瓶盖，当盖上瓶盖时，纤维膜的至少一部分将浸泡于样品瓶中的样品溶液；而纤维膜与吸头的接口处位于样品溶液之上。(4)从萃取管顶部往管内注入水，使其充满或部分充满中空纤维膜部分，再封住萃取管顶部。具体的制备过程如下(1)准备一个带有瓶盖和垫片的小瓶，按照样品瓶高度，裁剪适当长度的中空纤维膜和透明移液器吸头(规格为O.5i!LlOi!L)，移液器吸头保留尖端部分，剪去粗口径端。用丙酮超声清洗20分钟以除去其污物，取出晾干后用胶水把中空纤维膜和吸头尖端连接固定，中空纤维膜另一端用钳子捏紧封闭；(2)将萃取管浸入到有机相中超声10秒，取出后用擦镜纸吸掉中空纤维膜上多余的有机相；(3)通过瓶盖内的垫片，把萃取管插入样品瓶内，当盖上瓶盖时，纤维膜的至少一部分将浸泡于样品瓶中的样品溶液；而纤维膜与吸头的接口处位于样品溶液之上。(4)用微量进样器吸取20iiL接收相(蒸馏水)注入中空纤维膜内，用封口膜封闭管口；以上所提供的前处理装置在进行萃取时，放置于振荡器中，在室温下以600r/min的转速，萃取90min;萃取完毕后，用微量进样器从薄膜内吸取全部接收相，转移至进样小瓶中，待HPLC测。采用该方法进行原料乳和乳制品中三聚氰胺的检测，不仅操作简便，且节省了实验成本。以下以国家标准方法GB/T22388-2008(HPLC法)为例，从操作步骤(如表1)和检测成本(如表2)两方面进行比较。表1.操作步骤的对比<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>高。本发明所提供的测定方法操作简便，通过微萃取技术进行样品前处理，集采样和样品净化于一体，大大节省了人力物力。本发明所提供的方法大大减少了检测过程对环境的影响和溶剂的浪费，节省成本且对环境友好。通过微萃取的方式，本发明的方法样品用量少，对环境友好，且中空纤维只能一次性使用，避免了交叉污染的现象。图1本发明的样品前处理装置1为橡胶垫片、2为瓶盖、3为萃取小瓶、4为塑料吸头、5为孔壁吸附有有机相的中空纤维膜、6为样品溶液、7为接收相。图2实施例2的三聚氰胺标准色谱图。图3实施例2的液态奶空白样品色谱图。图4实施例2的液态奶加标样品色谱图(添加水平为1yg/mL)。图5实施例3的奶粉空白样品色谱图。图6实施例3的奶粉加标样品色谱图(添加水平为2iig/mL)。图7实施例4的样品前处理过程的萃取结果(A)为样品乳液；(B)为萃取后的接收相。图8实施例5的液态奶空白样品色谱图。图9实施例5的液态奶加标样品色谱图(添加水平为0.05yg/mL)。具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明的内容。实施例1样品前处理装置的制备将中空纤维膜剪成2.8厘米长的段，中空纤维膜的材料为聚偏氟乙烯纤维膜，壁厚200iim，内径1.2mm，孔径0.2ym;取510yL的移液器吸头作为塑料吸头，吸头剪去粗口端，保留尖头端，剪成2.7厘米长的段。把剪好的膜和吸头4分别浸泡在丙酮中超声20分钟，取出晾干；然后将中空纤维膜与吸头4尖端用胶水黏紧，用平头镊子捏紧封闭中空纤维膜的另一端至膜上出现透明印痕，即制成萃取管；将萃取管浸入正辛醇(有机相)中，超声IO秒后取出，使得正辛醇充满在中空纤维膜孔壁中；用擦镜纸擦去萃取管上多余的正辛醇，此时萃取管的下段即为孔壁吸附有有机相的中空纤维膜5。将萃取管插入萃取小瓶，吸头4另一端通过瓶盖2的垫片1，固定萃取管的位置，使得萃取管悬置于萃取小瓶正中央。往萃取小瓶加入样品溶液，将孔壁吸附有有机相的中空纤维膜5浸入样品液，并保证孔壁吸附有有机相的中空纤维膜5与吸头的接口处高于样品液，不浸入样品中。用微量注射器吸取蒸馏水(接收相)，注入萃取管内腔；然后用封口膜封闭萃取管吸头4的管口。实施例2检测方法的空白试验和加标回收试验配制lmg/mL三聚氰胺标准溶液。准确量取8mL液态奶样品，加标组加入8yL三聚氰胺标准溶液(即添加水平为1Pg/mL)，空白组不加入，每组平行处理三个样品。将萃取管浸入到正辛醇中超声IO秒，取出后用擦镜纸吸掉多余的正辛醇。把萃取管插入样品瓶内，用微量进样器吸取20iiL蒸馏水(接收相)注入薄膜内，用封口膜封闭管口。把萃取装置放入振荡器，室温下以600r/min的转速振荡萃取90min。萃取后吸取全部接收相，转移至进样小瓶中，待HPLC领U。称取1.Olg庚烷磺酸钠和1.05g柠檬酸，加水溶解并定容至500mL，制得离子对试剂。HPLC型号为岛津LC-20A，检测器为二极管阵列检测器SPD-M20A。色谱柱为DiamonsilTM(钻石二代)C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5ym。流动相条件为乙腈/离子对试剂(10/90，V/V)，流速1.2mL/min，柱温30。C，检测波长240nm。以其在色谱上的响应峰面积和保留时间作图。实验结果如表3和图2、图3、图4所示表3液态奶基质空白和加标实验测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注RSD为峰面积的相对标准偏差。由结果可知在该色谱条件下，液态奶基质无干扰物影响三聚氰胺的定性和定量，平均加标回收率为109.9%，相对标准偏差为2.3%。说明本方法可用于液态奶中三聚氰胺的测定。实施例3检测奶粉样品配制lmg/mL三聚氰胺标准溶液。将一小包(25g)市售奶粉溶于200mL温水中，超声5min，即配制成牛奶样品。准确量取8mL牛奶样品，加标组加入16yL三聚氰胺标准溶液(即添加水平为2iig/mL)，空白组不加入，每组平行处理六个样品。将萃取管浸入到正辛醇中超声IO秒，取出后用擦镜纸吸掉多余的正辛醇。把萃取管插入样品瓶内，用微量进样器吸取20yL蒸馏水(接收相)注入薄膜内，用封口膜封闭管口。把萃取装置放入振荡器，室温下以600r/min的转速振荡萃取90min。萃取后吸取全部接收相，转移至进样小瓶中，待HPLC测。称取1.Olg庚烷磺酸钠和1.05g拧檬酸，加水溶解并定容至500mL，制得离子对试剂。HPLC型号为岛津LC-20A，检测器为二极管阵列检测器SPD-M20A。色谱柱为DiamonsilTM(钻石二代)C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5ym。流动相条件为乙腈/离子对试剂(10/90，V/V)，流速1.2mL/min，柱温30。C，检测波长240nm。以其在色谱上的响应峰面积和保留时间作图。检测结果如表4所示表4奶粉基质空白和加标实验测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注RSD为峰面积的相对标准偏差。由结果可知，在该色谱条件下，奶粉基质无干扰物影响三聚氰胺的定性和定量，平均加标回收率为75.6%，相对标准偏差为12.1%。说明本方法可用于奶粉中三聚氰胺的测定。实施例4检测液态奶样品配制lmg/mL三聚氰胺标准溶液。准确量取8mL液态奶样品，加标组分别加入三聚氰胺标准溶液16iiL、4iiL、0.8iiL(即添加水平分别为2iig/mL、0.5iig/mL、0.1yg/mL)，每组平行处理三个样品。将萃取管浸入到正辛醇中超声IO秒，取出后用擦镜纸吸掉多余的正辛醇。把萃取管插入样品瓶内，用微量进样器吸取20iiL蒸馏水(接收相)注入薄膜内，用封口膜封闭管口。把萃取装置放入振荡器，室温下以600r/min的转速振荡萃取90min。萃取后吸取全部接收相，转移至进样小瓶中，待HPLC测。称取l.Olg庚烷磺酸钠和1.05g拧檬酸，加水溶解并定容至500mL，制得离子对试剂。从乳液中萃取所得的液体状态如图7所示。HPLC型号为岛津LC-20A，检测器为二极管阵列检测器SPD-M20A。色谱柱为DiamonsilTM(钻石二代)C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5ym。流动相条件为乙月青/离子对试剂(10/90，V/V)，流速1.2mL/min，柱温30。C，检测波长240nm。以其在色谱上的响应峰面积和保留时间作图。实验结果如表5所示表5不同添加水平实验测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注RSD为峰面积的相对标准偏差。如图7所示，从浑浊的乳液中萃取得到澄清透明的样品溶液，可直接应用到HPLC检测，无需进一步的0.45iim滤膜净化。由表5的结果表明在添加浓度O.liig/mL2iig/mL浓度范围内，方法回收率在72.10%100.5%之间，相对标准偏差小于5%。说明本方法回收率高且稳定，重复性强，精密度高。本方法在0.1iig/mL(即0.l卯m)添加水平下，目标物三聚氰胺仍有较高的响应值。现有的国家标准方法(GB/T22388-2008)中，高效液相色谱法的定量限为2mg/kg，即2ppm。说明本方法通过液相微萃取方法进行样品前处理，能达到富集目标物和去除干扰物的作用，与一般的高效液相色谱检测方法相比，能达到更低的检测限。说明本方法具有灵敏度高，检测限低的优点。实施例5液态奶检测的定量限测定配制0.lmg/mL三聚氰胺标准溶液。准确量取8mL液态奶样品，加标组加入三聚氰胺标准溶液4L(即添加水平分别为0.05g/mL)，空白组不加标，每组平行处理三个样品。将萃取管浸入到正辛醇中超声IO秒，取出后用擦镜纸吸掉多余的正辛醇。把萃取管插入样品瓶内，用微量进样器吸取20yL蒸馏水(接收相)注入薄膜内，用封口膜封闭管口。把萃取装置放入振荡器，室温下以600r/min的转速振荡萃取90min。萃取后吸取全部接收相，转移至进样小瓶中，待HPLC测。称取1.Olg庚烷磺酸钠和1.05g柠檬酸，加水溶解并定容至500mL，制得离子对试剂。HPLC型号为岛津LC-20A，检测器为二极管阵列检测器SPD-M20A。色谱柱为DiamonsilTM(钻石二代)C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5ym。流动相条件为乙腈/离子对试剂(10/90，V/V)，流速1.2mL/min，柱温30。C，检测波长240nm。以其在色谱上的响应峰面积和保留时间作图。实验结果如表6所示表6定量限实验测定结果10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注RSD为峰面积的相对标准偏差。结果显示，本方法的定量限为0.05ug/mL。权利要求一种检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法，包括样品前处理及高效液相色谱检测，其特征在于所述的样品前处理是采用中空纤维膜三相液相微萃取进行的。2.如权利要求1所述的检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法，其特征在于所述的中空纤维膜三相液相微萃取是在将含有有机相和水相的纤维膜包覆物置于待测样品溶液中进行萃取；所述的有机相吸附于纤维膜的孔壁中，所述的水相包覆于纤维膜的内部。3.如权利要求2所述的检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法，其特征在于所述的有机相为正辛醇或甲苯；所述的纤维膜为聚偏氟乙烯纤维膜、聚乙烯纤维膜或聚丙烯膜纤维膜。4.如权利要求2所述的检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法，其特征在于所述的纤维膜包覆物为细管形状，其壁厚100300iim，内径1.210mm，孔径0.10.3ym。5.如权利要求2所述的检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法，其特征在于所述的萃取时间为30120min。6.如权利要求2所述的检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法，其特征在于所述的萃取过程是在5001200rpm的转速下进行的。7.如权利要求1或2所述的检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法，其特征在于所述的原料乳和乳制品为液态奶、奶粉、奶酪、奶油或巧克力类含乳制品。8.如权利要求7所述的检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法，其特征在于所述的奶粉通过溶解成为待测样品；奶酪、奶油或巧克力类含乳制品通过研磨成粉后再经溶解成为待测样品。9.一种用于如权利要求1所述方法的样品前处理装置，包括装有待测样品溶液的带盖瓶子，其特征在于盖子下方悬挂有含有有机相和水相的纤维膜包覆物，其中的有机相吸附于纤维膜的孔壁；所述的包覆物至少一部分浸泡于样品溶液中。10.—种如权利要求9所述的样品前处理装置的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将由中空纤维膜构成的一端捏紧密封，另一端与吸头相连，成为萃取管，中空纤维膜端为萃取管底部，塑料吸头端为萃取管顶部；(2)将萃取管浸入有机相溶液中，超声后取出；(3)将步骤(2)所得的萃取管的顶部固定于样品瓶的瓶盖，当盖上瓶盖时，纤维膜的至少一部分将浸泡于样品瓶中的样品溶液；而纤维膜与吸头的接口处位于样品溶液之上。(4)从萃取管顶部往萃取管中注入水，使其充满或部分充满中空纤维膜部分，再封住萃取管顶部。全文摘要本发明公开了一种检测原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法，采用高效液相色谱法进行测定，其原料乳和乳制品的样品前处理是采用中空纤维膜三相液相微萃取进行的，纤维膜的孔壁上吸附有机相，而水相作为接收相存在于纤维膜内部，通过浸泡入待测样品溶液中进行萃取后，可直接进入HPLC进行检测。同时，本发明还公开了应用于该方法的样品前处理装置及其制备方法。本发明所提供的测定原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法灵敏可靠，测定方法操作简便，节省成本且对环境友好。文档编号G01N30/08GK101776664SQ20101010998公开日2010年7月14日申请日期2010年2月5日优先权日2010年2月5日发明者何建国,朱芳,欧阳钢锋,王录才,阮静雯,鲁统部申请人:中山大学