专利名称：小鼠肝炎病毒实时荧光定量pcr检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种病毒检测方法，具体的地说是一种小鼠肝炎 病毒(MHV)实时荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
小鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus，MHV)可引起小鼠发生肝炎、脑炎和肠炎， 一般呈亚临床感染或慢性感染，而机体抵抗力低时可引起急性发病死亡，导致实验失败。 MHV可改变各种免疫应答参数，影响酶的活性，从而对实验产生严重的干扰。目前，检测各种病毒的方法很多，如血清学实验、组织块培养和共培技术、核酸杂 交和常规PCR检测技术等，其中常规PCR检测技术敏感性、特异性、稳定性和可操作性都比 较好，但常规PCR反应后的处理存在交叉污染，也比较容易出现假阳性结果，并且实验时间 也相对较长。而实时荧光定量PCR检测技术就填补了以上的缺陷，无论是在研究中还是在 临床样品的检测上，实时荧光定量PCR快速、敏感的特性使它成为应用于检测微生物的有 效方法。实时荧光定量PCR技术具有以下优点=(I)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和 光谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析，效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时 反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量，结果重现性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污 染系统，所有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种小鼠肝炎病毒实时 荧光定量PCR检测方法，该检测方法的检测灵敏度可达到1. 0 X IO4个拷贝的病毒分子，对 于单个样本检测时间为2个小时，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏感 性、重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。按照本发明提供的技术方案，所述小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR方法包括步骤 如下1、标准质粒的构建在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获得 小鼠肝炎病毒的保守基因，利用基因克隆技术构建含有该保守基因序列的标准质粒分子；2、特异性引物及荧光探针的设计以步骤1中选取的高度保守序列为基准，设计 一对特异性引物及一条荧光探针；设计原则为每条引物的长度为18-25个碱基，荧光探针 长度为20-30个碱基；特异性引物和荧光探针中GC含量要求在40-60%，理论Tm > 50°C ；特 异性引物和荧光探针自身以及特异性引物和荧光探针之间的3’端避免碱基配对；选用的 特异性引物和荧光探针要设计在小鼠肝炎病毒基因中的保守区，只对小鼠肝炎病毒特异， 和其他物种无交叉反应；荧光探针应位于一对特异性引物之间的区域；所述特异性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中正向引物的序列为5，-CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG-3，；反向引物的序列为5，-CATGGCCCTATAATACGGGT-3，；
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所述荧光探针的序列为5，-CTCGCTCTATGACCTACTGC-3，；3、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线，包括步骤(1)模板的制备将步骤1中构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下定量 标准质粒为2. 94X IO9拷贝/ μ 1，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为 1.0Χ ΙΟ8、1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ IO6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4 的稀释液，稀释液在-20°C条件下保存备 用；(2)实时荧光定量PCR反应体系25μ 1 的 PCR 反应体系含有成分如下DEPC 水，15. 75μ 1 ； 10XPCR buffer, 2. 5μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)， 2. 5μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR), 2. 5 μ 1 ；模板，1 μ 1 ；(3)循环反应根据步骤⑵中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环； (b)、95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产 物；(4)建立检测标准曲线荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始 模板数对数为X轴，Ct值为y轴的标准曲线；4、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备，包括步骤(1)采用Trizol法提取感染病毒样本的RNA ；(2) ffl Invitrogen & 目 ! # 白勺 SuperScriptTM Preamplification System forFirst Strand cDNA Synthesis 试剂盒做反转录，制备 cDNA ；5、有效性验证及结果检测判定(1)利用未感染MHV小鼠的cDNA配制阴性对照PCR反应体系25 μ 1的阴性对照 PCR 反应体系为含有成分如下DEPC 水，15. 75 μ 1 ;10XPCR buffer, 2. 5 μ 1 ；IOmM dNTPs, 0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ； 300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向 引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；未感染 MHV 小鼠的 cDNA, 1 μ 1 ；利用感染MHV小鼠的cDNA制备阳性对照PCR反应体系25 μ 1的阳性对照PCR 反应体系为含有成分如下DEPC 水，15. 75μ 1 ;10XPCR buffer, 2. 5 μ 1 ； IOmM dNTPs, 0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ； 300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向 引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；感染 MHV 小鼠的 cDNA，1 μ 1 ；(2)循环反应按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环； (b)、95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产 物；(3)有效性验证荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对 照应无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照点应位于标准曲线上，并且其Ct值应< 32，否则重做。本发明采用实时定量荧光PCR进行小鼠肝炎病毒的特异性检测，具有以下优点(1)、特异性好由于TagMan荧光探针定量使用杂交对定量分子进行甄别，具有很 高的准确性，同时，靶序列由引物和荧光探针双重控制，特异性好，假阳性低。(2)、灵敏度高荧光检测技术是一个很灵敏的检测技术，因此TagMan检测的灵敏 度很高。(3)、线性关系好由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系，通过 荧光信号的检测可以直接对产物进行定量。(4)、操作简单，自动化程度高、防污染；使用TagMan荧光探针定量扩增和检测可 以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染。同时扩增和检测一步完成，操作简单，易于实现 自动化。
图1为小鼠肝炎病毒(MHV)的检测标准曲线。图2为小鼠肝炎病毒(MHV) PCR电泳图谱。
具体实施例方式一、实验材料1、阳性样本取自感染小鼠肝炎病毒(MHV)小鼠(来自无锡市血防所动物实验 室)的肝脏组织。2、实验试剂裂解液Trizol (购于美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒、TaqDNA 聚合酶及引物(购于美国Promega公司)，液氮、氯仿、异丙醇、75 %乙醇、DEPC处理水、 dNTPs、DL2000 Marker (其余试剂均购自美国Sigma公司)。实验仪器超细勻浆器(F6/10，上海fluko公司)、离心机(CT15RT，上海天美电化仪器设备 工程有限公司)、实时荧光定量PCR仪(FQD-48A，杭州博日科技有限公司)、普通PCR仪 (TC-96/G/H(b)A杭州博日科技有限公司)、紫外分光光度仪(ND-1000，美国Thermo Fisher Scientific公司)、扫描仪(YLN-26、北京市朝阳区京南机电综合服务部)、数码照相机(索 尼WXl)、冰箱(MDF-382E (N)，三洋电机国贸公司)。二、实验方法1、标准质粒的构建在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获得 小鼠肝炎病毒的保守基因，该保守基因序列的NC号为001846. 1，基因片段从9221 9570 ； 利用基因克隆技术构建含有该保守序列的标准质粒分子，所用的质粒为PUC57(由金斯瑞 公司提供)，由金斯瑞公司提供合成。2、特异性引物及荧光探针的设计以步骤1中选取的高度保守序列为基准，按照 发明内容部分的设计原则设计一对包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)的特 异性引物及一条荧光探针其中正向引物的序列(SEQ ID NO. 1)为5’ -CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG-3’，
反向引物的序列(SEQ ID NO. 2)为5， -CATGGCCCTATAATACGGGT-3，；荧光探针的序列(SEQ ID NO. 3)为5’ -CTCGCTCTATGACCTACTGC-3’ ；3、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线(1)模板的制备将步骤1中构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下定量 标准质粒为2. 94X IO9拷贝/ μ 1，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为 1.0Χ ΙΟ8、1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ IO6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4 的稀释液，稀释液在-20°C条件下保存备 用；(2)实时荧光定量PCR反应体系25 μ 1 的 PCR 反应体系含有成分如下DEPC 水，15. 75 μ 1 ；10XPCR buffer, 2. 5μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)， 2. 5μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR), 2. 5 μ 1 ；模板，1 μ 1 ；(3)循环反应根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环； (b)、95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产 物；(4)建立检测标准曲线荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始 模板数对数为X轴，Ct值为y轴的标准曲线(如图1所示)；对图1所示的检测标准曲线进行分析可见，模板的5个稀释点均在同一条直线上， 表明当基因拷贝数在LOXlO8-L OXlO4范围内时，检测域值与拷贝数之间均呈良好的线 性关系；回归分析显示，R2 = 0. 9923 ；可见本发明设计的引物及荧光探针的特异且工作性 能良好。4、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备(1)采用Trizol法提取感染病毒样本的RNA ；具体步骤为(a)、将小鼠肝组织按照每50_100mg，加入Iml Trizol液的比例加入到5ml离心 管中，并在超细勻浆器中生成研磨液，(注意组织的总体积不能超过所用Trizol体积的 10% )，然后转入新离心管中；(b)、将上述的研磨液在室温下放置5分钟，然后按照每ImlTrizol液加入0. 2ml 氯仿的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈振荡离心管15秒，4°C下12000g离心15分钟；(c)、吸取上述离心后的上层水相加入到另一个新的离心管中，按每ImlTrizol液 加0. 5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，4°C下12000g离心10分钟；(d)、弃去上清液，按每Iml Trizol液加入至少Iml的比例加入75%乙醇，涡旋混 勻，4°C下7500g离心5分钟。(e)、小心弃去上清液，室温晾干或真空干燥5 10分钟(注意不要干燥过分，否 则会降低RNA的溶解度)；(f)、将干燥后的RNA溶于水中，必要时可55 V 60 V水溶10分钟。RNA可进行
7mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70°C条件下。(2) cDNA 的制备米用 Invitrogen 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for FirstStrand cDNA Synthesis试剂盒做反转录，具体步骤为(a)、在0. 5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 μ g，补充适量的DEPC水使总体积达 11 μ 1 ；向微量离心管中加入10 μ M Oligo (dT) 15 μ 1，轻轻混勻、离心；(b)、将微量离心管70°C加热IOmin后立即插入冰浴中至少Imin ；然后加入下 列混合试剂，混合试剂的成分为10 X PCR buffer, 2 μ 1 ； 25mM MgCl2, 2 μ 1 ； IOmM each dNTPmix, 1 μ 1 ；0. IM DTT,2y 1 ；然后轻轻混勻，4°C下 IOOOOg 离心 Imin ；然后转入 42°C水 浴中下孵育2-5min ；(c)、加入反转录酶200U1 μ 1，在42°C水浴中继续孵育50min ；(d)、将微量离心管70°C加热15min，终止反应；(e)、将微量离心管插入冰中，加入RNase H 1 μ 1，在37°C下孵育20min，降解残留 的RNA，反转录的最终体系为35 μ 1，最后补足DEPC水165 μ 1，得最终cDNA为200 μ 1，置 于-20°C保存备用。5、有效性验证及结果检测判定(1)利用未感染MHV小鼠的cDNA配制阴性对照PCR反应体系25 μ 1的阴性对照 PCR 反应体系为含有成分如下DEPC 水，15. 75 μ 1 ;10XPCR buffer, 2. 5 μ 1 ；IOmM dNTPs, 0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ； 300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向 引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；未感染 MHV 小鼠的 cDNA, 1 μ 1 ；利用步骤4中制备的感染MHV小鼠的cDNA制备阳性对照PCR反应体系25 μ 1的 阳性对照PCR反应体系为含有成分如下:DEPC水，15. 75 μ 1 ； 10 XPCRbuffer, 2. 5 μ 1 ； IOmM dNTPs,0. 5 μ 1 ；1. 25U Tag DNA聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；感染 MHV 小鼠的 cDNA，1 μ 1 ；(2)循环反应按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环； (13)、951变性208沈，551退火30seC，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产 物；(3)有效性验证荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点(如图1 所示)；阴性对照在本检测试验中无Ct值并且无扩增曲线，表明该反应体系中无小鼠肝炎 病毒；图中的阳性对照点位于标准曲线上，并且其(^值< 32，实验有效，可见，本发明的检 测方法能够准确有效地检测出小鼠肝炎病毒。三、常规PCR检测(1)以DL2000 Marker作为参照，采用步骤1中构建的标准质粒作为模板，以未感 染MHV小鼠的cDNA作为样本cDNA，进行PCR电泳检测，分为参照组、阴性对照组、阳性对照 组和样本组a、b、c，各组的反应体系成分如表1所示组别成分(含量)体积阴性对照组反应体系DEPC 水11.75μ1混合液8.25 μ 1样本cDNA5μ1阳性对照组反应体系DEPC 水15.75 μ 1混合液8.25 μ 1感染MHV小鼠的cDNA1 μ 样品组a反应体系DEPC 水10.75 μ 1混合液8.25 μ 1样本cDNA5μ1模板(Ing)Ιμ 样品组b反应体系DEPC 水10.75 μ 1混合液8.25 μ 1样本cDNA5μ1模板(IOOpg)Ιμ 样品组C反应体系DEPC 水10.75 μ 1混合液8.25 μ 1样本cDNA5μ1模板(IOpg) μ 表1 常规PCR电泳检测中的各组的反应体系成分其中，8.25 μ 1 的混合液由 2. 5 μ 1 的 10 X PCR buffer, 0. 5 μ 1 的 IOmMdNTPs, 0· 25 μ 1 的 1. 25U Tag DNA 聚合酶，2. 5 μ 1 的 300nM PrimerF 和 2· 5 μ 1 的 300nM PrimerR 组成。(2)常规PCR反应反应循环程序及参数为(a)、95°C预变性5min，l个循环；(b)、 95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，35个循环后反应结束，得到反应产物；(3)将上述反应产物进行常规凝胶电泳检测(120V 40min)，检测结果如图2所示 (泳道M 参照组DL2000 Marker,泳道1 阴性对照组，泳道2 阳性对照组，泳道3 样品组 a，泳道4 样品组b，泳道5 样品组c)，由图可见，泳道1未跑出条带，说明本实验方法的非 特异性较好。本发明采用的实时荧光定量PCR技术巧妙地利用了 PCR技术的DNA高效扩增、荧 光探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量分析的优点，克服了常规PCR定性检 测的一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了实验时间，简化了实验操作。 而且荧光检测的结果由电脑分析读数，避免了产物后处理过程所致的污染，较常规PCR更 为客观、灵敏、准确。同时，本发明中采用的阳性对照是根据小鼠肝炎病毒的保守基因序列 设计构建的标准质粒分子，相对于以往采用灭活病毒液作为阳性品的检测，更增加了安全 性，标准质粒分子还可以大量进行复制，使得阳性标准品的来源更加稳定和可靠，避免了阳 性病毒株在每次试验中的使用。
权利要求
小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括有标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备、有效性验证及结果检测判定，其特征在于，所述特异性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中正向引物的序列为5’ CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG 3’，反向引物的序列为5’ CATGGCCCTATAATACGGGT 3’；所述荧光探针的序列为5’ CTCGCTCTATGACCTACTGC 3’。
2.如权利要求1所述的小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征还在于，所述 实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线的步骤为(1)模板的制备将构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下定量标准质粒为 2. 94X IO9拷贝/ μ 1，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为1. OX 108、 1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ IO6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4的稀释液，稀释液在_20°C条件下保存备用；(2)实时荧光定量PCR反应体系25 μ 1 的 PCR 反应体系含有成分如下DEPC 水，15. 75μ 1 ； 10XPCR buffer, 2. 5 μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)，2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；模板，1 μ 1 ；(3)循环反应根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置 相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环；(b)、 95°C变性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；(4)建立检测标准曲线荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板 数对数为χ轴，Ct值为y轴的标准曲线。
3.如权利要求1所述的小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征还在于，所述 有效性验证及结果检测判定的步骤为(1)利用未感染MHV小鼠的cDNA配制阴性对照PCR反应体系25μ 1的阴性对照 PCR 反应体系为含有成分如下DEPC 水，15. 75 μ 1 ;10XPCR buffer, 2. 5 μ 1 ；IOmM dNTPs, 0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ；300ηΜ 反向 引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；未感染 MHV 小鼠的 cDNA, 1 μ 1 ；利用感染MHV小鼠的cDNA制备阳性对照PCR反应体系25 μ 1的阳性对照PCR反应 体系为含有成分如下:DEPC 水，15. 75 μ 1 ； 10 XPCR buffer, 2. 5 μ 1 ； IOmM dNTPs, 0. 5 μ 1 ； 1.25U Tag DNA 聚合酶，0· 25μ 1 ;300nM 正向引物(PrimerF)，2· 5μ 1 ;300nM 反向引物 (PrimerR)，2. 5 μ 1 ；感染 MHV 小鼠的 cDNA, 1 μ 1 ；(2)循环反应按照步骤(1)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置 相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为(a)、95°C预变性5min，1个循环；(b)、 95°C变性20seC，55°C退火30seC，72°C延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；(3)有效性验证荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对照应无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照点应位于标准曲线上，并且其Ct值应< 32，否则重做。
全文摘要
本发明涉及一种小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法。该方法包括标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备以及有效性验证及结果检测判定步骤；其中特异性引物的正向引物的序列为5’-CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG-3’，反向引物的序列为5’-CATGGCCCTATAATACGGGT-3’；所述荧光探针的序列为5’-CTCGCTCTATGACCTACTGC-3’。本发明检测灵敏度高，检测时间短，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。
文档编号G01N21/64GK101914631SQ201010110268
公开日2010年12月15日 申请日期2010年2月3日 优先权日2010年2月3日
发明者张红, 潘振华, 盛青松, 陈林凤 申请人:无锡奥瑞生物医药科技有限公司