专利名称：一种提取香菇多糖的工艺及香菇多糖分子量分布测定方法
技术领域：
本发明涉及天然产物化学，公开了一种可用做消化系统等恶性肿瘤的辅助治疗的三螺旋香菇多糖的提取分离新工艺。属于香菇多糖分离纯化的技术领域，并涉及多糖分子量及其分布检测领域。
背景技术：
香菇(Lentirmula edodes)是我国传统的著名食用菌，也是一种著名的药用菌，在世界上最早被人工驯化栽培。香菇药用部位为子实体，1969年，日本学者千原吴郎从香菇子实体中提取、分离、纯化研制成的多糖(Nature 1969，p687_688)，即香菇多糖，日本名称为P千于 >，英文名为Lentinan，是一种免疫增强剂，被证明其在抗肿瘤方面具有明显的作用。日本厚生省于1985年批准上市并外销，用于癌症的辅助治疗，取得满意的临床疗效。 香菇多糖商品名难能治、力提能，英文名Lentinan，是一种生物免疫调节剂，可用于抗肿瘤辅助治疗。香菇多糖有明确的物理和化学特征，结构组成明确，β-(1 — 3)为主链、 β-(1 —6)为侧链，分子量 40-80 万，旋光[a ]2°D =+19. 5° 21. 5°，ν^—πΓ^Ο 有 β -葡萄糖的特征吸收，并有13CNMR数据等佐证其结构，结构式已经确定，如下。_ .Z ...+.香菇多糖对实验动物的治疗效果好
且重现性好，不仅对多种肿瘤，如S-180同种移植瘤有效；且对同系癌、原发癌有较强的抑制作用；对化学诱癌剂、病毒诱癌剂(表I)有预防效果；特别是对手术后的微转移 (Micrometastasis)有效，所以香菇多糖被国际上公认为是很有希望的抗癌药物之一。多年的临床应用也表明香菇多糖对胃癌(含手术复发)，肠癌(含手术复发)效果较好，与化疗药物配伍使用较单独使用化疗药(如MF，FT等)在抗癌效果、延长生命以及免疫反应三方面均有显著作用。自然界中很多多糖由于其特定的化学结构和分子间氢键的作用而具有很高的刚性，在溶液中能保持螺旋构象。具有活性的香菇多糖即是具有三螺旋构象的多糖。它依靠分子内氢键维持其螺旋结构，而由分子间的氢键维持多股螺旋链。然而，在强碱条件或者强极性溶剂及高温下，分子内和分子间氢键会被取代，使螺旋结构破坏，这个过程称之为螺旋多糖的变性。因此在提取过程中应避免对三螺旋结构的破坏才能使其保留生物活性，发挥更大疗效，而目前很多香菇多糖的提取工艺为了保留其三螺旋结构导致产品收率很低，而一些工艺为了提高收率采用高浓度的碱则破坏了三螺旋结构。香菇中成分复杂，为了提高多糖的纯度往往要通过很多步骤进行处理，工艺非常复杂，这就导致最终的成品收率不高。日本学者千原吴郎在Nature上发表的工艺表明，其提取的香菇多糖的收率只有0. 365%。，而国内大多发表的文献中香菇多糖的提取收率都维持在万分之几到千分之一的水平。如中国专利CN101261203A，专利申请号200710051644. 3的发明公开了一种碱溶
性香菇多糖的提取、分离、纯化及分子量的测定方法，该方法以香菇子实体为原料，通过粉碎、碱水浸提、过滤、浓缩、洗涤、级分、低温干燥得粗品、粗品溶解、离心、DEAE纤维素柱除杂纯化、离子交换树脂吸附脱色、过滤通过不同分子量的膜包超滤浓缩。采用GPC激光光散射凝胶色谱仪测定分子量，按测定分子量的范围，再分别装入透析袋透析、冻干得分子量为 10-100万Da的碱溶性香菇多糖。该方法制得的香菇多糖虽具有较高的纯度，但其使用高浓度的碱液提取香菇多糖，使得香菇多糖的螺旋结构容易被高浓度的碱破坏失去生物活性， 从而导致产品的收率过低。此外，该专利公开的分子量测定方法主要是依赖仪器，是通过多角度激光光散射来进行测定，如果分子的形状不是很规则，测定结果就存在较大的误差，并且测定分子量的仪器价格十分昂贵，不适于推广。现有的香菇多糖的分子量测定目前大多采用激光光散射法和普适校正法，激光光散射法设备昂贵，而普适校正法需要分别测定对照品和样品的k与α值，并仍需用激光光散射法确定样品的不同级分的绝对分子量以及各级分的粘度，再通过若干公式进行繁杂的计算，所以操作起来比较繁琐。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于寻求一种新的适合工业化生产，在不破坏香菇多糖三螺旋结构的前提下提高香菇多糖收率的提取分离新工艺。为达到该目的，本发明采用如下技术手段一种提取三螺旋香菇多糖的工艺，包括如下步骤(1)取香菇子实体进行前处理；(2)将前处理后的香菇子实体进行碱水加热提取处理，得提取液；C3)将提取液过滤，滤液浓缩后加入醇溶液使其沉淀，沉淀干燥后得香菇多糖粗品；(4)粗品经溶解后过滤，在滤液中加入沉淀剂使其沉淀，得沉淀物；( 沉淀物用酸溶液洗涤；(6)将酸溶液洗涤后的沉淀溶解于碱溶液；(7)沉淀物去蛋白；(8)加入醇溶液使其沉淀，收集沉淀物；(9)沉淀物经洗涤，干燥后得香菇多糖精制品；所述的步骤(2)中碱水加热提取，所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠或碳酸钾，优选氢氧化钠；所用碱浓度为0. 05mol/L-0. lmol/L ；优选0. 08mol/L ；碱水加热提取的温度范围为 65 °C -95°C，优选 85°C。所述的步骤(3)中的醇溶液采用体积浓度为40% -90%的乙醇，优选60% ；所述的步骤(3)中的干燥采用低温冷冻干燥。所述的步骤中的沉淀剂选用十六烷基三甲基氢氧化铵或十六烷基三甲基溴化铵，优选十六烷基三甲基氢氧化铵，沉淀剂的浓度为0. 1-0. 4mol/L，优选0. 2mol/L。所述的步骤(5)中的酸溶液为盐酸或乙酸，优选乙酸；所用酸的体积浓度为 10% -80%，优选50%，酸溶液的用量为沉淀物的8-12倍，优选10倍。所述的步骤(6)中的碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠或碳酸钾，优选氢氧化钠；所用碱浓度为5% -30%，优选10%。所述的步骤(7)采用kvag法去蛋白，所用试剂为氯仿和正丁醇，二者的体积比为 3:1-6: 1，优选为 4 1。所述的步骤(9)中的干燥为低温干燥，温度为10°C -30°C，优选20°C。香菇多糖提取、分离、纯化的工艺流程图见
图1，香菇多糖的红外色谱图见图2。为了进一步摸索出最佳的提取工艺，在本发明的研发过程中，发明人做了大量的对比实验以筛选出合适的提取条件，从而达到本发明的目的。1、碱水提取中碱液浓度对香菇多糖三螺旋结构及产品收率的影响实验方法取香菇子实体10kg，粉碎，加入各种浓度的碱溶液，于80°C提取12小时，过滤，滤液减压浓缩相对密度为1.05(50°C )，放冷，加入乙醇沉淀，使含醇量达到60%，收集沉淀，冷冻干燥得粗多糖。将上述粗多糖加400倍量纯化水溶解，过滤，滤液加入0. 2mol/L的十六烷基三甲基氢氧化铵至PH为12，使产生沉淀，收集沉淀物。沉淀物用10倍量50%乙酸洗涤二次，沉淀最后用10倍量10%氢氧化钠洗涤二次，合并碱溶液，用saveg法(氯仿-正丁醇4 1的混合液)去蛋白，有机溶媒用量为样液体积的1/4，共去除三次；溶液加入乙醇使沉淀，收集沉淀物，沉淀物用乙醚洗涤，室温下真空干燥得香菇多糖精制品。计算纯度及收率，以不同碱浓度提取的样品照中国药典2005年版二部附录VIG黏度测定法第三法测定各样品的特性粘数，并以特性粘数和碱浓度绘制曲线，来考察碱浓度对香菇多糖三螺旋结构的影响。(特性粘数(intrinsic viscosity) [ η ]是高聚物溶液粘度的最常用的表示方法，它和分子量符合Mark-Howink方程[h] = KXMwa, k和a是常数，因此可以通过特性粘数来反应分子量的变化情况)。实验结果见表1和图3(碱浓度对香菇多糖三螺旋结构的影响(以特性粘数变化体现))。表1碱液浓度对产品的含量及收率的影响
权利要求
1.一种提取三螺旋香菇多糖的工艺，包括如下步骤(1)取香菇子实体进行前处理；(2)将前处理后的香菇子实体进行碱水加热提取处理，得提取液；(3)将提取液过滤，滤液浓缩后加入醇溶液使其沉淀，沉淀干燥后得香菇多糖粗品；(4)粗品经溶解后过滤，在滤液中加入沉淀剂使其沉淀，得沉淀物；(5)沉淀物用酸溶液洗涤；(6)将酸溶液洗涤后的沉淀溶解于碱溶液；(7)沉淀物去蛋白；(8)加入醇溶液使其沉淀，收集沉淀物；(9)沉淀物经洗涤，干燥后得香菇多糖精制品；其特征在于所述的步骤O)中碱水加热提取，所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠或碳酸钾，优选氢氧化钠；所用碱浓度为0. 05mol/L-0. lmol/L ；优选 0. 08mol/L ；碱水加热提取的温度范围为65°C _95°C，优选85°C。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于所述的步骤(3)中的醇溶液采用体积浓度为40% -90%的乙醇，优选60% ；所述的步骤(3)中的干燥采用低温冷冻干燥。
3.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于所述的步骤(4)中的沉淀剂选用十六烷基三甲基氢氧化铵或十六烷基三甲基溴化铵，优选十六烷基三甲基氢氧化铵，沉淀剂的浓度为 0. 1-0. 4mol/L，优选 0. 2mol/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的工艺，其特征在于所述的步骤(5)中的酸溶液为盐酸或乙酸，优选乙酸；所用酸的体积浓度为10% -80%，优选50%，酸溶液的用量为沉淀物的8-12倍，优选10倍。
5.根据权利要求1-4任一项所述的工艺，其特征在于所述的步骤(6)中的碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠或碳酸钾，优选氢氧化钠；所用碱浓度为 5% -30%，优选 10%。
6.根据权利要求1-5任一项所述的工艺，其特征在于所述的步骤(7)采用Sevag法去蛋白，所用试剂为氯仿和正丁醇，二者的体积比为3 1-6 1，优选为4 1。
7.根据权利要求1-6任一项所述的工艺，其特征在于所述的步骤(9)中的干燥为低温干燥，温度为10°c -30°c，优选20°C。
8.一种香菇多糖分子量分布测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)、制备至少5种不同分子量的香菇多糖分级分离标准品；(2)、通过激光光散射法测定香菇多糖分级分离标准品的重均分子量；(3)、通过高效凝胶渗透色谱法和GPC软件确定香菇多糖分级分离标准品的保留时间， 根据香菇多糖分级分离标准品的保留时间与重均分子量，绘制标准曲线；(4)、取香菇多糖样品，通过高效凝胶渗透色谱法和GPC软件计算其保留时间；(5)、根据香菇多糖样品的保留时间与标准曲线，确定其分子量及其分布。
9.如权利要求8所述的分子量分布测定方法，其特征在于所述的高效凝胶渗透色谱，固定相采用1-4根多糖专用凝胶柱，分离范围可选用1000-4000000道尔顿，优选固定相为Ohpak SB-803、SB-804、SB-805HQ串联而成的凝胶柱组，采用的流动相为水、盐溶液或缓冲盐溶液，优选0. lmol/L的硫酸钠溶液，所述的香菇多糖分级标准品重均分子量范围为20万-95万，优选5种香菇多糖分级分离标准品重均分子量分布为89. 6X 104，57. 4X 104, 41. 9X IO4, 30. 8X IO4, 23. 5X 104。
10.如权利要求9所述的分子量分布测定方法，其特征在于所述的标准曲线，其回归方程为Y = 8. 0596-0. 0524Χ, r = 0. 9999。
全文摘要
本发明公开了一种提取三螺旋香菇多糖的工艺，所述的工艺以香菇子实体为原料，通过粉碎、碱水加热提取、过滤、浓缩、醇沉、冷冻干燥得粗品；粗品经溶解、搅拌、过滤、沉淀，酸洗涤、碱溶解、Sevag法除蛋白、乙醇沉淀、乙醚洗脱、干燥得香菇多糖精制品。经测定，该精制品保持了香菇多糖的三螺旋结构不被破坏，并能有效提高香菇多糖精制品的收率；此外，本发明还公开了一种新的香菇多糖的分子量分布测定方法。采用高效凝胶渗透色谱法，以香菇多糖系列标准品直接绘制标准曲线，测定本品精制品重均分子量为40-80万。
文档编号G01N30/74GK102190739SQ20101012307
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月12日 优先权日2010年3月12日
发明者周礼明, 封思阳, 蒋昊翔 申请人:南京易亨制药有限公司