专利名称：一种心肌肌钙蛋白i的检测试剂及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种心肌肌钙蛋白I (TROPONIN I)的检测试剂及其制备方法和用途， 属于生物医药检测试剂领域。
背景技术：
心血管疾病是威胁人类生命健康的第一重大疾病。根据世界卫生组织最新统计， 全球每年有1670万人死于各类心脑血管疾病，这一数字占所有疾病死亡的四.2%，其中有一半以上死于急性心肌梗死。在我国，近10年来，我国急性心肌梗死的发病率明显上升，已接近国际平均水平。冠心病发病率占总人口的6%。左右，实际的冠心病患者人数达780万人。而且由于缺乏冠心病的防治常识，很多患者就诊时已到晚期，以急性心肌梗死(AMI)为首发症状。目前国内外对AMI诊断标准是临床症状如胸痛，心电图异常以及血清心肌生化标志物异常。但是在AMI初期，约25%病人没有典型的临床症状，约一半的病人心电图没有典型异常变化，因此检测AMI初期病人心脏损伤时的血液样品中生化标志物异常在AMI临床诊断中具有重要参考意义。在我国各级医院中，在化验室中检测的主要生化标志物包括肌钙蛋白 Troponin-I (TNI)，Troponin-T (TNT)，肌红蛋白 Myoglobin 和肌酸磷酸激酶 CK-MB。其中 CK-MB大量存在于心肌中，一般在AMI发病4-8小时升高，12-20小时达到高峰，七十年代初以来被公认为是检测AMI的"金标准"。但是CK-MB特异性较差，马拉松赛跑、骨骼肌损伤、 肾衰者CK-MB含量均可异常增高。CK-MB在血液中存在的时间也较短(1-4天)。随着检测技术的发展，心肌肌钙蛋白I(CTnI)已被证实为心肌损伤最特异，最敏感的血清标志物之一。正常人血液中CTnI的含量一般低于0. ^g/ml，在AMI发生后，CTnI可在6_8小时内快速升高，在18-24小时内达到峰值，并在10-15天内都维持较高浓度。对CTnI的临床快速检测具有重要的社会和经济效益。现有的CTnI检测方法主要有酶联免疫法(ELISA，化学发光法和免疫荧光法。 ELISA的最低检测灵敏度可达到0. 2ng/mL，测定周期长，达5-6小时。化学发光法是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，其灵敏度高达 0.03ng/mL，检测时间也较短，约1_2小时，但需要采用专用大型设备，操作复杂。免疫荧光法采用夹心和酶联荧光相结合的方法，检测时间较快，最高灵敏度可达到0. Ing/mL，也需要专门仪器。这些检测方法都需要昂贵仪器和专业人员操作，只适用于在中心实验室使用，检测结果到达医生手中的时间较长，不能满足临床快速检测需要，也不适合于中小医院尤其是没有中心实验室的乡镇医院。国内现有的快速检测CTnI的试剂盒主要采用传统胶体金免疫层析法制备。其基本原理是采用胶体金标记单株或多株抗CTnI的单克隆抗体，采用双抗免疫夹心来检测 CTnI，中国专利200710022815. χ, 200810036418. 2已有报导。市场上所有的基于CTnI快速检测试剂盒检测灵敏度一般在2-lOng/ml范围内。
胶体金即指金微粒的悬浮液，其直径在1 lOOnm，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。其颜色依直径大小而呈红色至紫色。传统胶体金的合成过程，其对单克隆抗体的标记，固相免疫层析试纸条的制备均有报导。在二十世纪八十年代，胶体金首先被应用于蛋白分子的标记和体外检测领域。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合， 这种结合是静电结合，虽然不影响蛋白质的生物特性，也比较稳定，但是这种结合受溶液离子强度，PH影响很大，尤其是在高离子强度溶液中，胶体金发生凝聚，用纳米金标记的生物分子也随时间变化变得不稳定，影响了胶体金对很多生物分子的标记以及在生物样品中的应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂及其制备方法和用途，其特点是合成新型纳米微粒，纳米微粒表面功能化，以及纳米微粒对抗体的标记方法。它还包含试剂条，试剂条上含有抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体以及改性纳米金标记的抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体和抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的二抗。本发明的目的由下技术措施实现其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。心肌肌钙蛋白I的检测试剂及其制备方法心肌肌钙蛋白I的检测试剂有机硅包裹纳米金微粒的粒径为10-150nm，优选为50 lOOnm，最优选为55 75nm，纳米硅涂层厚为5-lOOnm，所述有机硅涂层表面引入胺基、羧基、羟基、氢硫基、环丙烷基和醛基功能基团，功能化的有机硅表面通过化学与生物分子如蛋白质、抗体进行标记，形成稳定的共价键连接，并保持被标记分子的生物活性。心肌肌钙蛋白I检测试剂的制备方法包括以下步骤1.传统的胶体金的制备将浓度为0. 01 4%氯金酸溶液100份加热，在100 400rpm搅拌下煮沸10 120分钟，快速加入浓度为2N氨水溶液0. 1 5份和浓度为1 %的柠檬酸钠2 10份，高速搅拌至溶液呈现橙红色，冷却后高速离心纯化，获得微粒径在10 200nm的胶体金微粒， 并将制得的胶体金分装保存；2.有机硅包裹的纳米金微粒的制备将上述制得的胶体金溶液100份，加入0. 1 2份三胺基丙基三乙氧基硅烷，在 100 400rpm搅拌15 120分钟，加入200 500份溶剂，用氨水调节溶液pH值至碱性，加入0. 1 2份四乙基硅烷混合物，在室温下继续搅拌18- 小时，对产物在2000 IOOOOrpm 高速离心纯化，获得有机硅包裹的纳米金微粒；3.有机硅包裹纳米金的表面功能化将上述制得的胶体金100份加入200 500份溶剂，在100 400rpm搅拌15 120分钟，用氨水调节pH值至碱性，加入0.1 2份1 1的四乙基硅烷和含有机功能基团的混合溶液，在室温下继续搅拌18 M小时，产物在2000 IOOOOrpm高速离心纯化，获得有机包裹纳米金表面功能化改性的纳米微粒；
4.有机硅包裹的纳米金对心肌钙蛋白I单克隆抗体的标记采用表面羧基化有机硅包裹纳米金通过乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺 (EDC)活化其表面羧基并与心肌肌钙蛋白I单克隆抗体Fc的胺基反应，形成化学性能稳定的酰胺结构，这种稳定的化学键不受溶液的离子强度，酸碱性影响，从而增加了标记的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的化学和储存稳定性。将标记好的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体喷涂在玻璃纤维垫片上，形成金标垫。5.试剂盒的制备将一株CTnI的单克隆抗体作为检测抗体配制浓度为1. 5mg/ml的抗体磷酸缓冲溶液，加入2%海藻糖1 20份，喷印到活化的硝酸纤维素膜上，形成检测线；将CTnI的单克隆抗体的二抗如羊抗鼠IgG喷印到硝酸纤维素膜上形成质量控制线；将硝酸纤维素膜干燥 2-10小时，制备检测CTnI的硝酸纤维素膜。将金标垫，样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在塑料板上，把塑料板切割成5mm宽度检测CTnI试纸条，再将CTnI检测试纸条装入塑料盒，制成检测CTnI的试剂盒。6.心肌肌钙蛋白I的快速检测方法将全血/血清样品加入试剂盒上的样品孔，渗透到样品垫上，样品中CTnI与有机硅包裹纳米金标记的CTnI的单克隆检测抗体相遇结合形成复合物，复合物继续顺硝酸纤维素膜渗透到检测线与固定在检测线上的CTnI单克隆捕捉抗体形成夹心双抗体的复合结合，在检测线上显示纳米金的红色，检测结果为阳性；多余纳米金标记的CTnI单克隆检测抗体在渗析到质量控制线时，与固定在质量控制线上的二抗形成夹心结合，使质控线也显示红色，表明样品在硝酸纤维素膜上的渗析完全，该检测结果有效。如果样品中CTnI含量低于检测灵敏度，纳米金标记的CTnI单克隆检测抗体不能与检测线上固定的捕捉抗体形成有效夹心复合结合，检测线不会显示红色，检测结果为阴性，但是纳米金标记的CTnI单克隆检测抗体仍然能与固定在质控线上的单克隆二抗形成夹心结合，在质控线上显示红色，表明检测结果有效。这种方法是本领域技术人员熟知的技术。有机功能基团为胺基、羧基、氢硫基、羟基、环丙烷基或醛基功能基团中的任一种。溶剂为乙醇、异丙醇、甲醇、正丁醇中的任一种。有机包裹纳米金表面功能化改性的纳米金微粒通过化学与生物分子进行标记形成稳定的共价健连接。检测试剂用于临床快速检测心肌梗塞病人血液中的心肌肌钙蛋白I的含量。本发明具有如下优点1、本发明采用有机硅对传统的纳米金微粒进行包裹，在其表面形成纳米厚度的硅涂层，对硅涂层表面进行化学改性，引入羧基，胺基，羟基，氢硫基，环丙烷基和醛基功能基团。有机硅改性的纳米金较传统的胶体金具有更好的稳定性，不容易发生金颗粒的凝聚。硅表面引入的化学功能基团与生物分子如蛋白，抗体，抗原形成稳定化学共价键结合，制备更加稳定的纳米金标记物。这种改性的纳米金可以取代传统胶体金用于免疫学领域，制备免疫试剂。2、利用该纳米金对生物蛋白，抗体进行标记，在生物分子和纳米金微粒间形成稳定共价键，提高了被标记分子的化学和储存稳定性。3、表面硅涂层可以提高纳米材料的表面反射光强度，从而提高该材料的肉眼分辨率，提高了免疫试剂的灵敏度，可达到0. 4ng/mL04、利用该有机硅包裹的纳米金对心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体标记并通过免疫层析法制备检测心肌肌钙蛋白I的检测试剂盒，大大提高了心肌肌钙蛋白I的检测速度。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。实施例11 有机硅包裹纳米金颗粒的制备及表面胺基化纳米金颗粒溶液的制备采用柠檬酸钠还原法制备胶体金微粒溶液，胶体金的微粒大小控制在10-150nm。将浓度为1 %的氯金酸去离子水溶液100份，高速搅拌并煮沸10 分钟。快速加入浓度为2N的氢胺溶液0. 1份和浓度为1 %的柠檬酸钠2份，高速搅拌，溶液呈现橙红色，冷却后高速离心纯化得到微粒的粒径为55-75nm的胶体金微粒，得到的胶体金保存一段时间然后对胶体金表面进行有机硅包裹并胺基化改性，取得到的胶体金溶液 100份，加入300份乙醇，在100 400rpm搅拌15分钟，用氨水调节溶液pH至碱性，加入 1份1 1混合的四乙基硅烷和3-氨基丙基三乙氧基硅烷混合溶液，在室温下继续搅拌 18-24小时，产物在2000 IOOOOrpm高速离心纯化，获得有机硅包裹表面胺基化的新型纳米金微粒。2表面胺基化有机硅包裹纳米金标记抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体在100份上述描述的方法制备的有机硅包裹表面胺基化的纳米金溶液中，加入10 份交联剂和100微克抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体继续反应2小时，然后加入浓度为10% 牛血清白蛋白的磷酸缓冲液0. 1份，继续反应1小时。高速离心纯化后得到表面胺基化有机硅包裹纳米金标记的抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体。3心肌肌钙蛋白I试剂盒的制备将上述制备的改性纳米金标记的抗心肌肌钙蛋白I的单抗喷涂到玻璃纤维纸片上制备免疫改性纳米金纸片。用喷点仪器将心肌肌钙蛋白I的单克隆捕捉抗体和二抗 IgGd. 5mg/mL)喷点于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上，在温度37°C干燥2小时，获得到免疫硝酸纤维素膜片条，将吸水纸粘贴于免疫硝酸纤维素膜片条上，并切割成5mm宽试纸条，将切割的试纸条，金标纸和样品垫，过滤垫组装在样品盒中，制成心肌肌钙蛋白I的试齐U盒。实施例21有机硅包裹纳米金颗粒的制备及表面羧基化按实施例1所描述的方法制备粒径为55-75nm的胶体金微粒，取上述制得胶体金溶液100份，加入250份乙醇，在100 400rpm搅拌65分钟，用氨水调节溶液pH至碱性， 加入1份四乙基硅烷，反应2小时，再加入1份马来酰胺酸丙基三乙氧基硅烷，在室温下继续搅拌18- 小时，产物在2000 IOOOOrpm高速离心纯化，获得有机硅包裹表面羧基化的新型纳米金微粒。2表面羧基化有机硅包裹纳米金标记抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体
在100份上述描述的方法制备的有机硅包裹表面羧基化的纳米金溶液中，加入5 份1 1混合的浓度为20mmol 1_乙基_3_ (3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和浓度为20mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合溶液，在室温下反应45分钟，加入50微克抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体继续反应2小时，然后加入浓度为10%牛血清白蛋白的磷酸缓冲液 0. 1份，继续反应1小时。高速离心纯化后得到表面羧基化有机硅包裹纳米金标记的抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体。3心肌肌钙蛋白I试剂盒的制备将上述制备的改性纳米金标记的抗心肌肌钙蛋白I的单抗喷涂到玻璃纤维纸片上制备免疫改性纳米金纸片。用喷点仪器将心肌肌钙蛋白I的单克隆捕捉抗体和二抗 IgGd. 5mg/mL)喷点于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上，在温度37°C干燥2小时，获得到免疫硝酸纤维素膜片条，将吸水纸粘贴于免疫硝酸纤维素膜片条上，并切割成5mm宽试纸条，将切割的试纸条，金标纸和样品垫，过滤垫组装在样品盒中，制成心肌肌钙蛋白I的试齐U盒。实施例31 有机硅包裹纳米金颗粒的制备及表面氢硫基化按实施例1所描述的方法制备粒径为55-75nm的胶体金微粒，取上述制得的胶体金溶液100份，加入200份异丙醇，在100 400rpm搅拌120分钟，用氨水调节溶液pH至碱性，加入份0. 1份1 1混合的四乙基硅烷和3-硫基丙基三乙氧基硅烷混合溶液，在室温下继续搅拌18- 小时。产物在2000 IOOOOrpm高速离心纯化，获得有机硅包裹表面氢硫基化的新型纳米金微粒。2表面氢硫基化有机硅包裹纳米金标记抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体将100微克心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的磷酸缓冲液中加入5微克活化剂，室温下反应20分钟，用凝胶色谱柱纯化反应物，得到活化的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体溶液。 将活化的单克隆抗体中加入1份实施例3中描述的有机硅包裹的纳米金溶液，室温下反应 1小时，加入浓度为5%牛血清白蛋白的磷酸缓冲液0. 1份，继续反应1小时，高速离心纯化后得到表面氢硫基化有机硅包裹纳米金标记的抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体，标记的抗体与硅包裹纳米金之间形成稳定的化学共价键连接，增加了标记抗体的化学稳定性和储存稳定性。3心肌肌钙蛋白I试剂盒的制备将上述制备的改性纳米金标记的抗心肌肌钙蛋白I的单抗喷涂到玻璃纤维纸片上制备免疫改性纳米金纸片。用喷点仪器将心肌肌钙蛋白I的单克隆捕捉抗体和二抗 IgGd. 5mg/mL)喷点于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上，在温度37°C干燥2小时，获得到免疫硝酸纤维素膜片条，将吸水纸粘贴于免疫硝酸纤维素膜片条上，并切割成5mm宽试纸条，将切割的试纸条，金标纸和样品垫，过滤垫组装在样品盒中，制成心肌肌钙蛋白I的试齐U盒。实施例41 有机硅包裹纳米金颗粒的制备及表面环丙烷基化按实施例1所描述的方法制备粒径为55-75nm的胶体金微粒，取上述制得胶体金溶液100份，加入250份乙醇，在100 400rpm搅拌75分钟，用氨水调节溶液pH至碱性，加入1份四乙基硅烷，反应2小时，再加入1份(3-环氧丙氧基丙基)二甲基乙氧基硅烷， 在室温下继续搅拌18- 小时，产物在2000 IOOOOrpm高速离心纯化，获得有机硅包裹表面环丙烷基化的新型纳米金微粒。2表面环丙烷基化有机硅包裹纳米金标记抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体在100份上述描述的方法制备的有机硅包裹表面丙烷基的纳米金溶液中，加入50 微克抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体在38°c继续反应2小时，然后加入浓度为10%牛血清白蛋白的磷酸缓冲液0. 1份，继续反应1小时。高速离心纯化后得到表面环丙烷基化有机硅包裹纳米金标记的抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体。3心肌肌钙蛋白I试剂盒的制备将上述制备的改性纳米金标记的抗心肌肌钙蛋白I的单抗喷涂到玻璃纤维纸片上制备免疫改性纳米金纸片。用喷点仪器将心肌肌钙蛋白I的单克隆捕捉抗体和二抗 IgGd. 5mg/mL)喷点于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上，在温度37°C干燥2小时，获得到免疫硝酸纤维素膜片条，将吸水纸粘贴于免疫硝酸纤维素膜片条上，并切割成5mm宽试纸条，将切割的试纸条，金标纸和样品垫，过滤垫组装在样品盒中，制成心肌肌钙蛋白I的试齐U盒。
权利要求
1.一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂，其特征在于该检测试剂含有有机硅包裹的纳米金微粒的粒径为10 150nm，纳米硅涂层为5 lOOnm，所述的有机硅涂层表面引入胺基、羧基、羟基、氢硫基、环丙烷基和醛基功能基团，功能化的有机硅表面通过化学与生物分子如蛋白质、抗体进行标记，形成稳定的共价键连接，并保持被标记分子的生物活性。
2.如权利要求1所述心肌肌钙蛋白I的检测试剂，其特征在于有机硅包裹的纳米金微粒的粒径为50 lOOnm。
3.如权利要求1所述心肌肌钙蛋白I的检测试剂，其特征在于有机硅包裹的纳米金微粒的粒径为55-75nm。
4.如权利要求1 3之一所述心肌肌钙蛋白I的检测试剂的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)传统的胶体金的制备将浓度为0. 01 4%氯金酸溶液100重量份加热，在100 400rpm搅拌下煮沸10 120分钟，快速加入浓度为2N氨水溶液0. 1 5重量份和浓度为1 %的柠檬酸钠2 10重量份，高速搅拌至溶液呈现橙红色，冷却后高速离心纯化，获得微粒径在10 150nm的胶体金微粒，并将制得的胶体金分装保存；(2)有机硅包裹的纳米金微粒的制备将上述制得的胶体金溶液100重量份，加入0. 1 2重量份三胺基丙基三乙氧基硅烷， 在100 400rpm搅拌15 120分钟，加入200 500重量份溶剂，用氨水调节溶液pH值至碱性，加入0. 1 2重量份四乙基硅烷混合物，在室温下继续搅拌18-M小时，对产物在 2000 IOOOOrpm高速离心纯化，获得有机硅包裹的纳米金微粒；(3)有机硅包裹纳米金的表面功能化将上述制得的胶体金100重量份加入200 500重量份溶剂，在100 400rpm搅拌 15 120分钟，用氨水调节pH值至碱性，加入0.1 2重量份1 1的四乙基硅烷和含功能基团的混合溶液，在室温下继续搅拌18 M小时，对产物在2000 IOOOOrpm高速离心纯化，获得有机硅包裹纳米金表面功能化改性的纳米微粒；(4)心肌肌钙蛋白I的检测试剂的制备采用双抗免疫夹心法将上述制得的纳米微粒标记的心肌肌钙蛋白I单克隆检测抗体喷点于样品垫上，另一心肌肌钙蛋白I捕捉抗体和单克隆捕捉抗体的二抗喷点于硝酸纤维素膜形成制备抗心肌肌钙蛋白I的快速检测试剂纸条，再将该检测试剂纸条制成试剂盒。
5.如权利要求4所述心肌肌钙蛋白I的检测试剂的制备方法，其特征在于含有机功能基团为胺基、羧基、氢硫基、羟基、环丙烷基或醛基功能基团中的任一种。
6.如权利要求4所述心肌肌钙蛋白I的检测试剂的制备方法，其特征在于溶剂为乙醇、 异丙醇、甲醇、正丁醇的任一种。
7.如权利要求4所述心肌肌钙蛋白I检测试剂的制备方法，其特征在于有机聚合物包裹纳米金表面功能化改性的纳米金微粒通过化学与生物分子进行标记形成稳定的共价健连接。
8.如权利要求1所述心肌肌钙蛋白I检测试剂的用途，其特征在于该检测试剂用于临床快速检测心肌梗塞病人血液中的心肌肌钙蛋白I的含量。
全文摘要
本发明公开了一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂及其制备方法和用途，其特点是该检测试剂为有机硅包裹的纳米金微粒，微粒的粒径为10～150nm，纳米硅涂层为5～100nm，所述的有机硅涂层表面引入胺基、羧基、羟基、氢硫基、环丙烷基和醛基功能基团，功能化的有机硅表面通过化学反应与生物分子如蛋白质、抗体进行标记，形成稳定的共价键连接，并保持被标记分子的生物活性；这种改性的纳米金可以取代传统胶体金用于免疫学领域，制备免疫试剂；用这种改性的纳米胶体可以制备心肌肌钙蛋白I的检测试剂。
文档编号G01N33/68GK102192986SQ20101012788
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月19日 优先权日2010年3月19日
发明者胡卫红 申请人:胡卫红