专利名称：一种检测相思子毒素的化学发光试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测相思子毒素的化学发光试剂 盒，本发明还提供了该试剂盒的制备方法。
背景技术：
相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思子(Abrus Precatorius L.)的种子 中的一种毒蛋白，与蓖麻毒素(ricin)同为II型核糖体失活蛋白(RIP)家族成员，是迄今 为止所发现的毒性最强的植物毒素之一，毒性是普通化学武器的几百倍。由于不同产地 或品种，同种植物所含毒素的结构和性质可能稍有不同，台湾产的相思子中同时分出四种 相思子毒素异毒素abrin-a、abrin_b、abrin-c及abrin_d，相对分子质量介于63kDa 67kDa之间，其中abrin-b和abrin-c由于其B链凝集活性低而只有较弱的细胞毒性作用， 而abrin-a、abrin-d则有极强的细胞毒性，成年人摄入的致死剂量为5. 0 7. 0 y g/Kg，只 需嚼烂后吞服一粒种子即可被毒死，而且出现症状时已经造成机体严重的器质损害，给中 毒的治疗及预防带来极大的困难，因此开展对相思子毒素检测技术的研究具有十分重要的
眉、o国内外有关相思子毒素的生物检定法和物理化学检定法报导较少，免疫学检测主 要有放射性免疫法(RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。RIA技术主要是通过使用放射性 元素1251标记的抗体来定量检测血液等样品中的相思子毒素，检测灵敏度高，血浆中相思子 毒素最小可测浓度达50 100pg/mL。其缺点是存在放射污染问题。HPLC法用于蛋白质鉴 定及检测特异性较好，但由于需要昂贵的设备及较多的专业技术，通常多用于实验室确证 分析，不适合大批量样品的现场筛检。ELISA法检测相思子毒素灵敏性和特异性较高，可定 量分析，曾广泛用于大批量样品的现场筛检。本发明的检测相思子毒素化学发光试剂盒，通 过检测发光底物产生的光信号代替传统ELISA中的显色底物，可明显提高检测灵敏度，同 时具有特异，快速，可靠的特点。
发明内容
本发明提供了一种检测相思子毒素的化学发光试剂盒，具有特异性强、灵敏度高、 操作简单方便等特点。本发明还提供了上述化学发光试剂盒的制备方法，适用工业化生产。本发明的检测相思子毒素化学发光试剂盒，其特征在于以特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体包被发光板，以辣根过氧化物 酶标记的羊抗兔IgG为酶标抗体，以鲁米诺为化学发光底物液。以浓度为0、5、10、20、40、 80ng/mL相思子毒素蛋白标准品一起装备成本发明的化学发光试剂盒。本发明检测相思子毒素化学发光试剂盒的制备方法如下采用凝胶层析法从相思子中制备相思子毒素，用甲醛减毒处理制备类毒素，分别 免疫家兔和Balb/C小鼠制备多克隆抗体和单克隆抗体。以特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体包被发光板，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标抗体，以鲁米诺 为化学发光底物液。以浓度为0、5、10、20、40、80ng/mL相思子毒素蛋白标准品一起装备成 本发明的化学发光试剂盒。主要包括以下步骤(1)采用5%冷醋酸液抽提，并用35% 95%硫酸铵分级沉淀制备相思子毒素粗 毒；再经S印harose 6B亲和层析，DEAE-Sepharose FF离子交换层析以及Superdex 75凝 胶过滤三步层析，制备相思子毒素；
(2)将从步骤(1)中制备得到的相思子毒素用甲醛减毒处理制备类毒素，用于 免疫Balb/C小鼠制备单克隆抗体；(3)采用Westerblot方法从步骤(2)中制备得到的单克隆抗体中筛选出特异性结 合相思子毒素A链的单克隆抗体；(4)用步骤(3)得到的单克隆抗体包被发光板，10%的羊血清封闭制备发光板；(5)将步骤(2)中制备得到的相思子毒素类毒素免疫家兔制备兔源抗相思子毒素 多克隆抗体；(6)配制化学发光底物液、酶标抗体、稀释液、10倍浓缩洗涤液；(7)将特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体包被发光板；(8)以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标抗体；(9)利用步骤(8)中包被好的化学发光板及步骤(9)中制备得到的酶标抗体，以鲁 米诺为化学发光底物液，以浓度为0、5、10、20、40、80ng/mL相思子毒素蛋白标准品一起装 备成本发明的化学发光试剂盒。本发明涉及的上述相思子毒素化学发光试剂盒，其中相思子毒素的制备方法相思子去壳处理，去种仁200g，浸于1L 5%冷醋酸中，4°C过夜，高速勻浆处 理，10000g/min离心20min，上清用35 % 95 %硫酸铵分级沉淀，沉淀溶解于5mmol/L PB (pH8. 0)溶液中，用Sepharose 4B亲和层析纯化，纯化产物过DEAE-Sepharose FF离子 交换柱，收集第一个洗脱峰即为相思子毒素，经脱盐处理后加入终浓度为0.01%硫柳汞钠 盐，-20°C保存。本发明涉及的上述相思子毒素化学发光试剂盒，其中兔源抗相思子毒素的多克隆 抗体制备方法相思子毒素经甲醛减毒处理，分三次免疫家兔，首次免疫剂量为500 yg/只，加强 免疫于首次免疫2周后进行，剂量为300 u g/只，加强免疫每间隔2周进行一次，8周后用不 含佐剂的类毒素溶液经耳静脉注射作超强免疫免疫，剂量为800 yg/只，一周后心脏穿刺 采血，分离血清，血清经50%硫酸铵盐析沉淀法处理，5000g/min离心20min，弃上清，沉淀 用PBS(0. 02mol/L pH7. 0)重悬，即为粗提的多克隆抗体，粗提物用Hitrap rProteinA FF 或Hitrap rProtein G FF预装柱制备高纯度的抗体。本发明涉及的上述相思子毒素化学发光试剂盒，其中特异性结合相思子毒素A 链的鼠源单克隆抗体制备方法相思子毒素用甲醛减毒处理，对6 8周龄的Balb/ C小鼠免疫，通过细胞融合，ELISA筛选，克隆，并采用Westerblot法鉴定其特异性，取经 Westerblot鉴定为能分泌特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体的细胞株，采用体 外诱导法，将单克隆抗体细胞株扩大培养后注入6 8周龄Balb/C小鼠腹腔内制备腹水，制备的腹水经硫酸铵盐析法粗提后，用Hitrap rProtein A FF凝胶亲和层析柱进一步纯 化，即得到高纯度的单克隆抗体。本发明用特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体包被化学发光板，用兔源 抗相思子毒素多克隆抗体作为酶标抗体，以鲁米诺为化学发光底物液，采用双抗体夹心法 原理组装化学发光试剂盒，用于检测相思子毒素，既增强了其检测灵敏度，也保留了其特异 性强的特点。本发明检测相思子毒素的化学发光试剂盒的积极效果在于检测特异性高、灵敏 度高、稳定性好、方便、快捷，结合化学发光测量仪就能快速定量检测相思子毒。具有操作简 单、检测快速、结果易于判断和方便保存，适合于临床和突发事件的检测。尤其适合于临床 和突发事件的现场检测，适合流行病学调查大规模应用。
图1为相思子毒素单克隆抗体Westerblot鉴定结果图。其中第1泳道为低分子量Marker ；第2、3泳道为完整的相思子毒素Westerblot检 测显色结果；第4、5泳道为相思子毒素经巯基乙醇处理后，相思子毒素A链Westerblot 检测显色结果。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解 到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本 发明的待批权利要求范围内。实施例1相思子毒素抗体制备及鉴定1、相思子毒素的制备采用5%醋酸抽提粗毒，经高速离心(10，000g，20min)后弃沉淀物，上清液用 35% 95%饱和硫酸铵分级沉淀，将沉淀物用PBS充分透析72h，所得毒素粗提物采用 S印harose6B或S印harose 4B琼脂糖亲和层析柱、DEAE-S印harose FF阴离子交换柱及 Hiload26/60Superdex75凝胶过滤层析预装柱进一步分离，结果采用SDS-PAGE电泳法分析 分子量，凝胶薄层扫描测定纯度，N末端氨基酸序列测定及质谱肽指纹图谱分析鉴定，结果 表明制备得到高纯的相思子毒素。2、特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体的制备相思子毒素经1 %甲醛磷酸盐缓冲液减毒处理24h后，免疫Balb/C小鼠制备单 克隆抗体。免疫免疫程序为首次免疫每只取100 iiL抗原(50iig)与100iiL完全费氏 佐剂混勻，皮下多点注射。加强免疫于首免后2周进行，每只取100 yL抗原(30i!g)与 等量不完全费氏佐剂混勻后，腹腔注射。此后每2周免疫一次，共免四次，最后一次免疫后 7天断尾采血分离血清，以2i!g/mL原毒(未经醛化减毒处理)包被酶标板，用间接ELISA 法检测抗相思子毒素血清抗体效价。若效价高于1X10—4即可用于细胞融合。超强免疫 于细胞融合前3 4d尾静脉各注射无佐剂抗原50 u g，200 u L/只。采用小鼠杂交瘤细胞 技术制备抗相思子毒素的单克隆抗体杂交瘤细胞株，采用体内诱导法，分别将杂交瘤细胞接种于Balb/c小鼠制备了腹水；用小鼠mAb亚类鉴定试剂盒检测mAb的亚类，腹水经硫酸铵盐析法粗提后，采用Hitrap rProtein A FF亲和层析柱或Hitrap rProtein GFF亲 和层析柱纯化，SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度，BCA法测定其浓度；间接ELISA法检测腹水 效价为1 3. 2X105，且与相思子凝集素、蓖麻毒素及蓖麻凝集素三种类似物均无交叉反 应；采用Westerblot法鉴定其特异性，结果表明所制备得到的单克隆抗体可特异性结合相 思子毒素A链，与相思子凝集素、蓖麻毒素和蓖麻凝集素等均无交叉反应，表明该单克隆抗 体特异性高。见图1 图中，第1泳道，低分子量Marker ；第2、3泳道，完整的相思子毒素 Westerblot检测显色结果；第4、5泳道，相思子毒素经β -巯基乙醇处理后，相思子毒素A 链Westerblot检测显色结果。3、兔源抗相思子毒素多克隆抗体的制备相思子毒素经甲醛减毒处理，制备得相思子毒素类毒素。用此类毒素经皮下及肌 肉注射免疫家兔，首次免疫剂量为500 μ g/只，取等体积完全弗氏佐剂与类毒素溶液混合 并完全乳化后经皮下注射免疫，强化免疫于首次注射2周后进行，免疫间隔时间为两周，剂 量为300μ g/只，取等体积不完全弗氏佐剂与类毒素溶液混合并充分乳化后经皮下或肌肉 注射免疫，免疫8周后，用不含佐剂的类毒素溶液经耳静脉注射作超强免疫，最后一次免疫 1周后经心脏采血制备抗血清。血清经50%硫酸铵沉淀法处理，5000g/min离心20min，弃上 清，沉淀用PBS (0. 02mol/LpH7. 0)重悬，即为粗提的多克隆抗体，粗提物用Hitrap rProtein A FF或Hitrap rProtein G FF凝胶亲和层析制备高纯度的抗体。兔源抗相思子毒素多克 隆抗体采用琼脂免疫扩散试验及ELISA法进行鉴定，结果表明与相思子凝集素、蓖麻毒素 和蓖麻凝集素均无交叉反应。实施例2化学发光试剂盒的制备1、利用单克隆抗体及兔抗相思子毒素多克隆抗体浓度梯度试验，最终确定单克隆 抗体最佳工作浓度为4 μ g/mL，兔抗相思子毒素抗体最佳工作浓度为2. 15μ g/mL。2、发光板制备，将纯化的单克隆抗体用包被液液稀释到4 μ g/mL包被发光板，并 用10%羊血清封闭。3、标准品的制备，分别将相思子毒素稀释到O、5、10、20、40、80ng/mL。4、兔抗相思子毒素抗体的制备，取纯化兔抗相思子毒素抗体(20mg/mL)用稀释液 (0. 5% BSA-PBST)稀释到 2. 15 μ g/mL。5、酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自Sigma公司，临用前用去离 子水1 3000稀释。6、化学发光底物液、酶标抗体、稀释液、10倍浓缩洗涤液的制备(1)稀释液pH7· 4PBSKH2PO40. 2gNa2HPO4. 12H20 2. 9gNaCl8. OgKCl0. 2gBSA(牛血清白蛋白)0· 5g(2) 10倍浓缩洗涤液
KH2PO40. 2gNa2HPO4. 12H20 2. 9gNaCl8. OgKCl0. 2g去离子水溶解并定容值lOOmL，调节pH为7. 4，加入ImLTween-20(3)化学发光底物A液鲁米诺8. 858g对碘苯酚 0. 66gTris12. 114g去离子水定容至1L，用浓盐酸调pH至8. 5化学发光底物B液30 %的H2O2购自Sigma公司，使用时A液与B液按体积比 100 1混合。实施例3检测相思子毒素化学发光试剂盒的测试1、样品处理检测液体乳样制品视样品浓度及粘稠度用稀释液适当稀释，所得溶液即可作为 检测液。检测血液样品1体积血液样品加入1体积的稀释液，混勻静止10分钟，离心处理 后取上清即可作为检测液。检测食物样品将食物做粉碎处理后加入适当量的稀释液混勻，室温下静止 30min,离心处理后取上清即可作为检测液。2、样品检测本发明的化学发光试剂盒检测相思子毒素的方法取单克隆抗体包被的发光板， 反应孔中分别加入各浓度的标准品0、5、10、20、40、80ng/mL和待测样品每孔50μ L，37°C保 温45min，洗涤3次，4min/次，在吸水纸上拍干。反应孔中加入纯化的兔抗相思子毒素抗体 100 μ L/孔，37°C保温45min，洗涤3次，4min/次，在吸水纸上拍干。将酶标抗体用稀释液稀 释5000倍，加入反应孔内，100 μ L/孔，37°C保温45min，洗涤3次，4min/次，在吸水纸上拍 干。每孔加入发光底物液100yL，37°C避光反应5-lOmin。在化学发光测量仪上依次测量 各孔的发光强度(RLU)，检测时间1秒/孔。通过标准品的浓度和对应的RLU值建立标准曲 线，通过曲线方程确定待测样品中相思子毒素的浓度。实施例4相思子毒素免疫层析试纸性能的测定及实践1、检测相思子毒素化学发光试剂盒特异性的测定应用制备的检测相思子毒素化学发光试剂盒检测与相思子毒素分子结构的性质 较近的相思子凝集素、蓖麻毒素、蓖麻凝集素时，结果均为阴性，表明与它们之间没有交叉 反应，试纸条特异性良好。2、检测相思子毒素化学发光试剂盒敏感性用本发明检测相思子毒素，最小检出量为0. Ing/mL,相思子毒素浓度在 0. l-80ng/mL范围内浓度对数值与测量的发光强度(RLU)对数值成直线相关性。
3、检测相思子毒素化学发光试剂盒稳定性(1)同一批次的化学发光试剂盒于37°C破坏试验期间，每天都进行化学发光试剂盒的检测，在第6天时试纸条颜色的强度有所降低。说明试纸条在37°C可保存6天。(2)化学发光试剂盒于4°C保存10个月期间，每周测定的结果标准品的发光强度 值稳定；说明试剂盒在4°C可保存10个月，第11个月后灵敏度有所下降。(3)同一批次的化学发光试剂盒于-20°C保存13个月期间，分别每半个月一检测， 在第11个月时颜色强度有所降低；说明化学发光试剂盒在-20°C可保存11个月，第11个 月后灵敏度有所下降。5、检测相思子毒素化学发光试剂盒人工模拟样本检测(1)对人工模拟香肠毒素样品检测结果显示当毒素样品浓度大于Ing/mL时，检出 率为100%。(2)对人工模拟牛奶毒素样品检测用ELISA试验和制备的化学发光试剂盒进行鉴 别试验，结果显示当毒素样品浓度大于Ing/mL时，两种检测方法的符合率为100%。
权利要求
一种检测相思子毒素的化学发光试剂盒，其特征在于以特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体包被发光板，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标抗体，以鲁米诺为化学发光底物液；以浓度为0、5、10、20、40、80ng/mL相思子毒素蛋白标准品一起装备成试剂盒。
2.权利要求1所述检测相思子毒素化学发光试剂盒的制备方法，包括以下步骤采用凝胶层析法从相思子中制备相思子毒素，用甲醛减毒处理制备类毒素，分别免疫 家兔和Balb/C小鼠制备多克隆抗体和单克隆抗体；以特异性结合相思子毒素A链的鼠源单 克隆抗体包被发光板，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标抗体，以鲁米诺为化学 发光底物液；以浓度为0、5、10、20、40、80ng/mL相思子毒素蛋白标准品一起装备成试剂盒。
3.权利要求2所述的制备方法，主要包括以下步骤(1)采用5%冷醋酸液抽提，并用35% 95%硫酸铵分级沉淀制备相思子毒素粗毒；再 经S印harose 6B亲和层析，DEAE-S印harose FF离子交换层析以及Superdex 75凝胶过滤 三步层析，制备相思子毒素；(2)将从步骤(1)中制备得到的相思子毒素用甲醛减毒处理制备类毒素，用于免疫 Balb/C小鼠制备单克隆抗体；(3)采用Westerblot方法从步骤(2)中制备得到的单克隆抗体中筛选出特异性结合相 思子毒素A链的单克隆抗体；(4)用步骤(3)得到的单克隆抗体包被发光板，10%的羊血清封闭制备发光板；(5)将步骤(2)中制备得到的相思子毒素类毒素免疫家兔制备兔源抗相思子毒素多克 隆抗体；(6)配制化学发光底物液、酶标抗体、稀释液、10倍浓缩洗涤液；(7)将特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体包被发光板；(8)以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标抗体；(9)利用步骤⑶中包被好的化学发光板及步骤(9)中制备得到的酶标抗体，以鲁米诺 为化学发光底物液，以浓度为0、5、10、20、40、80ng/mL相思子毒素蛋白标准品一起装备成试齐U盒。
4.权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于相思子毒素的制备步骤如下相思子去壳处理，去种仁200g，浸于115%冷醋酸中，4°C过夜，高速勻浆处理，10000g/ min离心20min，上清用35% 95%硫酸铵分级沉淀，沉淀溶解于5mmol/LPB (pH8. 0)溶液 中，用S印harose 4B亲和层析纯化，纯化产物过DEAE-S印harose FF离子交换柱，收集第一 个洗脱峰即为相思子毒素，经脱盐处理后加入终浓度为0. 01%硫柳汞钠盐，-20°C保存。
5.权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于兔源抗相思子毒素的多克隆抗体制备 方法相思子毒素经甲醛减毒处理，分三次免疫家兔，首次免疫剂量为500 u g/只，加强免疫 于首次免疫2周后进行，剂量为300 y g/只，加强免疫每间隔2周进行一次，8周后用不含 佐剂的类毒素溶液经耳静脉注射作超强免疫免疫，剂量为800 u g/只，一周后心脏穿刺采 血，分离血清，血清经50%硫酸铵盐析沉淀法处理，5000g/min离心20min，弃上清，沉淀用 PBS(0. 02mol/L pH7. 0)重悬，即为粗提的多克隆抗体，粗提物用HitraprProtein A FF或 Hi trap rProtein G FF预装柱制备高纯度的抗体。
6.权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于特异性结合相思子毒素A链的鼠源单 克隆抗体制备方法如下相思子毒素用甲醛减毒处理，对6 8周龄的Balb/C小鼠免疫，通过细胞融合， ELISA筛选，克隆，并采用Westerblot法鉴定其特异性，取经Westerblot鉴定为能分泌特异 性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体的细胞株，采用体外诱导法，将单克隆抗体细胞 株扩大培养后注入6 8周龄Balb/C小鼠腹腔内制备腹水，制备的腹水经硫酸铵盐析法粗 提后，用Hitrap rProtein A FF凝胶亲和层析柱进一步纯化，即得单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种检测相思子毒素的化学发光试剂盒及其制备方法，以特异性结合相思子毒素A链的鼠源单克隆抗体包被发光板，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标抗体，以鲁米诺为化学发光底物液，以浓度为0、5、10、20、40、80ng/mL相思子毒素蛋白标准品一起装备成本发明的化学发光试剂盒。本发明化学发光试剂盒适合于临床和突发事件中大量样品的定量检测，适合流行病学调查，具有操作简单，灵敏度高、稳定性好、方便、快捷等特点，对相思子毒素中毒的鉴别诊断和及时救治具有重要意义和实际应用价值。
文档编号G01N33/543GK101819203SQ201010132580
公开日2010年9月1日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者刘国文, 刘磊, 唐佳佳, 孔涛, 孙佳, 张志刚, 张燚, 李小兵, 杨威, 王哲 申请人:吉林大学